Biotechnology Explorer Kit de genes en una botella Mdulo de extraccin de ADN

Nmero de catlogo 166-2000EDU

El collar para guardar el ADN (166-2200EDU) debe adquirirse por separado. explorer.bio-rad.com
La temperatura de almacenamiento est detallada en cada componente.

La duplicacin de cualquier parte de este documento est autorizada slo para su uso en clase.

Para soporte tcnico llame a su oficina local de Bio-Rad (en Espaa 91 590 52 00) 4110034

Extraccin de ADN

ndice

Manual del profesor

Extraccin de ADN: Inventario de material Revisin general para el profesor Por qu debes ensear a extraer ADN? Estudiantes de destino Ajuste curricular Formacin recomendada del estudiante Programacin de la actividad Cuestiones de seguridad Claves del xito Medida de volmenes Informacin bsica y fundamentos para un nivel avanzado Aplicaciones de la tecnologa del ADN Extraccin y precipitacin de ADN: Cmo funciona? Gua de laboratorio del profesor Extraccin y precipitacin de ADN Listado de material Gua rpida para la extraccin y precipitacin de ADN

Manual del alumno: nivel avanzado

Unidad 1 Unidad 2 Unidad 3 Introduccin y material bsico Aislamiento de clulas de la mucosa bucal, extraccin de ADN y precipitacin Preparacin de un collar de ADN (opcional)

Extraccin de ADN

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Extraccin de ADN de las clulas de la mucosa bucal Captura en un frasco tu esencia gentica

Manual del profesor

Extraccin de ADN: Inventario de material .............................................................. Revisin general para el profesor ...................................................................... 3 4

Por qu debes ensear a extraer ADN? ................................................ 4 Estudiantes de destino ........................................................................ Ajuste curricular ................................................................................... Formacin recomendada del estudiante ............................................. Programacin de la actividad................................................................ Cuestiones de seguridad ..................................................................... Claves del xito .................................................................................... Medida de volmenes .......................................................................... Informacin bsica y fundamentos para un nivel avanzado................................. Aplicaciones de la tecnologa del ADN ................................................................ Extraccin y precipitacin de ADN: Cmo funciona? ........................................ Gua de laboratorio del profesor .......................................................................... Extraccin y precipitacin de ADN ....................................................................... Listado de material .......................................................................... ...... Gua rpida para la extraccin y precipitacin de ADN ......................................... 11 4 4 5 5 5 5 5 6 6 7 8 9 9

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Extraccin de ADN: Inventario de material

El material de este kit es suficiente para 36 alumnos. Contenido del kit Tampn de lisis Proteasa Cloruro sdico 5M Agua estril Tubos de 5 ml de fondo redondeado Microtubos transparentes Microtubos de colores Tubos de rosca sin tapa transparentes Tapas de rosca de diferentes colores Pipetas de plstico Gradillas de corcho Torundas para citologas Parafilm Accesorios necesarios (no incluidos en este kit) Isopropanol 91% o etanol 95% Bao con termmetro, a 50 C * Rotuladores de tinta indeleble Contenedor de hielo Contenedor de residuos
**

Cantidad 40 ml 1.3 ml 5 ml 2.5 ml 50 60 60 40 40 50 10 80 1 Cantidad 250 ml aprox. 1 1-9 1 9

Mdulo opcional DNA Necklace

(no incluido en este kit)

166-2200EDU contiene: Viales de vidrio Tapas de plata Tapones de plstico Cordn Pegamento super glue 18 18 18 18 1 tubo

* Si no se dispone de bao con termostato, use uno o ms recipientes recubiertos de material aislante (el
corcho es lo mejor), lo suficientemente grandes para contener las gradillas de corcho, y rellnelos con agua a 50 C.

** Cada mdulo de DNA Necklace contiene material suficiente para preparar 18 collares de ADN. Se
necesitan dos kits para una clase de 36 alumnos.

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Revisin general para el profesor

Por qu debes ensear a extraer ADN?
1) La extraccin de ADN proporciona a los alumnos la oportunidad de ver su propia esencia gentica. Tu y tus alumnos os emocionareis al ver la sustancia que os hace nicos ante vuestros ojos. El ADN precipitado puede ser precintado y guardado en un atractivo vial de vidrio que se puede conservar durante mucho tiempo. 2) La extraccin del ADN ayuda a los estudiantes a comprender las propiedades del ADN. Las molculas de ADN que forman nuestros cromosomas son increblemente largas y finas. Pide a tus alumnos que se imaginen cmo unas molculas tan largas pueden caber en las microscpicas clulas de la mucosa bucal. Los finos filamentos blancos que vern como su propio ADN precipitado, estn formados por muchos miles de molculas de ADN unidas unas a otras como las fibrillas de un hilo. 3) La extraccin de ADN es el primer paso en la tecnologa del ADN. La extraccin de ADN es un paso rutinario en muchos procedimientos biotecnolgicos: la clonacin gentica, la construccin de mapas genticos, la secuenciacin de ADN, y el ADN fingerprinting requieren que el ADN sea extrado y aislado de las clulas o tejidos de procedencia. Con esta actividad, los estudiantes podrn hacerse una idea de lo sencillo que es aislar el ADN para su utilizacin en investigacin puntera.

Estudiantes de destino
Esta prctica es apropiada para alumnos desde el bachillerato a la universidad, como una primera introduccin al conocimiento del ADN, o como una rpida y sencilla actividad complementaria a la enseanza de la existencia del ADN. Incluso los alumnos que previamente han extrado ADN de cebollas o hgado encontrarn ms emocionante y relevante la extraccin de su propio ADN. El manual de instruccin incluye contenidos tanto para un nivel avanzado como para un nivel bsico. Dependiendo de las necesidades de tus alumnos, puedes elegir qu actividades incluir de cada seccin. Se proporciona un completo manual del estudiante para ambos niveles de conocimiento.

Ajuste curricular
Esta prctica se puede realizar en cualquier momento durante un curso de Biologa o Ciencias Naturales, pero es particularmente apropiada cuando se estn tratando los siguientes temas: Biomolculas Estructura celular Mitosis y meiosis Gentica Tecnologa del ADN

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Formacin recomendada del estudiante

Los alumnos de bachillerato deberan tener un conocimiento general de la estructura y funcin del ADN antes de comenzar esta actividad. En los alumnos de niveles inferiores no se espera que tengan ningn conocimiento previo sobre la estructura o funcin del ADN.

Programacin de la actividad
Esta prctica se puede realizar fcilmente en 50 minutos, pero se puede ampliar al incluir varias actividades complementarias. Unidad 1 Unidad 2 Unidad 3 Introduccin y material bsico Aislamiento de clulas de la mucosa bucal, extraccin de ADN y precipitacin Preparacin de un collar de ADN (opcional)

Cuestiones de seguridad
No est permitido comer, beber, fumar o aplicarse cosmticos en el rea de trabajo. Se recomienda llevar bata y guantes. Los alumnos deben lavarse las manos con jabn antes y despus de cada prctica. Si alguna de las soluciones utilizadas se introduce en los ojos, lavar con agua abundante durante 15 minutos.

Claves del xito

Es de vital importancia realizar una abundante recogida de clulas. Para mejorar los resultados, asegrate de que los alumnos emplean la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las clulas de la mucosa bucal y transfirindolas.

Medida de volmenes
Este kit est diseado para usar en laboratorios con un equipamiento mnimo y con un conocimiento limitado de las tcnicas cientficas. No se necesitan micropipetas, aunque se pueden utilizar si se dispone de ellas para transferir lquidos.

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Informacin bsica y fundamentos para un nivel avanzado

Aplicaciones de la tecnologa del ADN

Esta prctica puede ser realizada cuando se estn impartiendo lecciones sobre la estructura y funcin del ADN, y se puede usar para proporcionar a los estudiantes una sencilla experiencia prctica con su propio ADN. Incluso alcanza ms significado si los estudiantes comprenden que la extraccin de ADN es el primer paso en muchas aplicaciones biotecnolgicas, como:

Clonacin
Clonar significa hacer muchas copias de un fragmento de ADN o genoma. Un gen defectivo que origina una enfermedad se puede clonar para que pueda ser secuenciado y analizado con el fin de buscar un tratamiento a la enfermedad. Un gen que codifica una determinada protena o caracterstica se puede clonar para poder ser insertado en otro organismo (ver prctica de Transferencia de genes). Asimismo, un genoma completo se puede clonar insertndolo en los ncleos celulares pudiendo desarrollarse en el interior de los organismos.

Transferencia gnica: Organismos Modificados Genticamente (OMG)

Para producir cantidades importantes de una protena de inters, como el factor de coagulacin de la sangre humana, el gen que codifica la protena es aislado e introducido en clulas que puedan crecer rpidamente. Estas factoras celulares pueden ser bacterias, levaduras, hongos, clulas vegetales o clulas animales. A veces un mamfero es utilizado para producir la protena deseada. Un gen que codifica para esta protena se puede insertar en un vulo de vaca fecundado. La vaca genticamente modificada producir la protena deseada en su leche, de la cual se podr extraer la protena. Actualmente los granos de cereal contienen genes de otros organismos. Por ejemplo, algunas plantas contienen un gen que codifica una protena que mata a las orugas. Otras plantas contienen genes que les permiten resistir a los herbicidas, y permiten a los agricultores fumigar toda la plantacin con herbicida, matando las malas hierbas y permitiendo la supervivencia de los cereales.

Determinacin del perfil de ADN

Mediante una tcnica denominada reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), los cientficos pueden estudiar regiones especficas de cromosomas en las que las secuencias de ADN difieren entre individuos, y pueden amplificarlas, o hacer muchas copias de ellas (originando cantidades suficientes de esas secuencias para poder manipularlas y analizarlas). Mediante una electroforesis, se pueden mostrar las diferencias entre individuos comparando los patrones de bandas (que recuerda a cdigos de barras). Esta tcnica se puede usar para resolver crmenes, realizar pruebas de paternidad, y tambin para determinar el parentesco evolutivo de los organismos.

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Extraccin y precipitacin de ADN: Cmo funciona?

Los alumnos comenzarn esta actividad haciendo un raspado de las clulas del interior de su boca y depositando las clulas recogidas en un tubo con solucin tampn de lisis. La solucin tampn de lisis contiene un detergente que rompe las membranas celular y nuclear, dejando el ADN libre. Tambin contiene un compuesto tampn para mantener el pH de la solucin de manera que el ADN permanezca estable. Se aade proteasa, una enzima que digiere protenas, para eliminar las protenas unidas al ADN y para destruir las enzimas celulares que podran digerir el ADN. Esto asegura que la cantidad de ADN intacto recogida sea mxima. El extracto celular que contiene proteasa se incuba a 50 C, la temperatura ptima para la actividad proteasa. El ADN y otros componentes celulares, como lpidos, azcares y protenas, se disuelven en la solucin de lisis. El ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato de su estructura, y esta carga elctrica es lo que hace soluble a esta molcula. Cuando se aade sal a la muestra, los iones sodio con carga positiva son atrados por las cargas negativas del ADN, neutralizando la carga del ADN. Esto permite a las molculas de ADN unirse en vez de repelerse entre s. La adicin de alcohol fro precipita el ADN dado que es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El ADN precipitado forma unas finas hebras blancas y visibles en el lmite de separacin de la fase de alcohol, mientras que el resto de las sustancias permanecen disueltas.

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Gua de laboratorio del profesor

Esta seccin incluye una visin general y rpida del tema, la preparacin anticipada, la preparacin de los puestos de trabajo de los alumnos, y las tcnicas y conceptos a destacar.

Programacin de la prctica
1-2 das Unidad 1 Introduccin y material bsico

50 minutos 30-50 minutos

Unidad 2 Unidad 3

Aislamiento de clulas de la mucosa bucal Extraccin de ADN y precipitacin Opcional: Preparacin de un collar de ADN

Preparacin previa del profesor para la Unidad 2

Medida de volmenes Este kit contiene pipetas graduadas de plstico que se usarn para todas las medidas de volmenes. El siguiente dibujo muestra en la pipeta las marcas correspondientes a los volmenes que se medirn. Tambin se pueden utilizar micropipetas.

750 l 500 l 250 l 100 l

Pon el alcohol (isopropanol o etanol) en el congelador al menos 1 hora antes de empezar la prctica. Aade 1.25 ml de agua (1 ml + 250 l) al bote que contiene la proteasa para diluirla. Invierte suavemente el bote 5 veces para mezclar el agua y la proteasa. Una vez diluida, la solucin con proteasa se puede mantener almacenada a 4 C durante 2 meses.

1 ml + 250 ml

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Alicuota el tampn de lisis, la proteasa diluida y el cloruro sdico (sal) en los correspondientes tubos eppendorf. Mira las siguientes instrucciones:

Tampn de lisis

Sal

Proteasa diluida

Corta cinta Parafilm en 36 o ms cuadrados pequeos, uno para cada estudiante.

Preparacin de alcuotas de las soluciones para cada puesto de trabajo de alumnos (4 alumnos/puesto) 1. Para cada estudiante, alicuota 1 ml de tampn de lisis en un microtubo transparente (4 tubos por puesto). 2. 3. Alicuota 500 l (0.5 ml) de cloruro sdico (sal) en 8 microtubos rosas y rotlalos con la palabra sal. Alicuota 250 l de la proteasa diluida (ver pgina anterior para su preparacin) en 8 microtubos azules y rotlalos como prot. 4. Coloca 4 microtubos transparentes con tampn de lisis, 1 rosa marcado como sal y uno azul marcado como prot en cada gradilla de corcho, y deja una gradilla en cada puesto de trabajo.

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Extraccin y precipitacin de ADN

Listado de material
En este kit hay material suficiente para 36 alumnos.

Puesto comn
Bao a 50 C Botella sacada del congelador de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo

Nmero
1 1

( ) o o

Puesto de trabajo de los alumnos

Microtubos transparentes, con 1 ml de tampn de lisis Microtubo azul rotulado como prot, con 250 l de proteasa Microtubo rosa rotulado como sal, con 500 l de sal Tubos transparentes de rosca sin tapa Tapas de rosca de colores Escobillas para citologa Tubos de fondo redondeado de 5 ml Parafilm (trozos pequeos) Pipetas de plstico Gradilla de corcho para tubos eppendorf Rotulador de tinta indeleble Contenedor de residuos

Nmero
4 1 1 4 4 8 4 4 4 1 1 1

( ) o o o o o o o o o o o o

Nota para el profesor Recoger un elevado nmero de clulas es crtico para el xito de la prctica. Para obtener unos buenos resultados, asegrate de que los alumnos emplean suficiente tiempo en recoger y transferir las clulas.

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Gua rpida para la extraccin y precipitacin de ADN

1.

Coge un microtubo transparente con 1 ml de tampn de lisis de la gradilla situada en tu puesto de trabajo, y rotlalo con tus iniciales utilizando el rotulador de tinta indeleble. 1 ml tampn de lisis

2.

Con suavidad raspa con la escobilla el interior de tu mejilla derecha, y el espacio situado entre tu mejilla y la enca durante 1 minuto; trata de recoger la mayor cantidad de clulas posible.

3.

Introduce la escobilla con las clulas de la mucosa en el tubo que contiene el tampn de lisis. Gira la escobilla para liberar las clulas de la escobilla en el tampn. Frota las cerdas de la escobilla contra el borde del tubo para transferir la mayor cantidad posible de clulas en el tubo.

4.

Usando una segunda escobilla limpia, raspa suavemente las clulas del interior de tu mejilla izquierda, entre la mejilla y la enca, por el paladar, y debajo de la lengua durante 1 minuto; de nuevo, trata de recoger la mayor cantidad posible de material. Introduce la escobilla en el mismo tubo de antes y transfiere las clulas a su interior.

5.

Cierra el tubo y, suavemente, voltalo 5 veces para mezclar los componentes.

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Extraccin de ADN

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6.

Con una pipeta de plstico, aade 1 gota del tubo rotulado como prot en el tubo que contiene tus clulas. Cierra el tubo y suavemente voltalo 5 veces para mezclar los componentes.

1 gota de solucin de proteasa

7.

Pon los tubos de tu grupo en la gradilla de corcho e incbalos a 50 C durante 10 minutos. Saca tus tubos del bao. Bao 50 C, 10 min.

8.

Con una pipeta de plstico, aade 2 gotas del tubo rotulado como sal en el tubo que contiene el extracto de tus clulas. Cierra el tubo y suavemente voltalo 5 veces para mezclar los componentes.

2 gotas de solucin salina

9.

Rotula con tus iniciales un tubo limpio de 5 ml y fondo redondeadon y pasa el contenido de tu microtubo a este tubo.

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10. Coge una pipeta de plstico y llnala con alcohol fro.

11. Inclina 45 el tubo de fondo redondeado y lentamente aade el alcohol, dejando que caiga con cuidado por la pared interna del tubo.

12. Deja el tubo en posicin vertical y en reposo durante 5 minutos.

13. Despus de 5 minutos, sella la boca del tubo con un trozo de Parafilm y voltea lentamente el tubo 5 veces para facilitar que el ADN, que ha empezado a precipitar, se agregue.

14. Con una pipeta de plstico, transfiere con cuidado el ADN precipitado, con aproximadamente de 750 l a 1 ml de solucin alcohlica, a un vial de vidrio incluido en el DNA necklace kit (166-2200EDU). Si no te vas a hacer el collar de ADN, guarda tu ADN en el tubo de rosca proporcionado por este kit.

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Extraccin de ADN de las clulas de la mucosa bucal

Captura en un frasco tu esencia gentica

Manual del alumno: nivel avanzado

Unidad 1: Unidad 2 Unidad 3 Introduccin y material bsico ................................................................................. 14

Aislamiento de clulas de la mucosa bucal, extraccin de ADN y precipitacin ........ 19 Preparacin de un collar de ADN (opcional) ............................................................... 25

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Unidad 1: Introduccin
El cido desoxirribonucleico (ADN) es una molcula presente en todos los seres vivos, incluyendo bacterias, plantas y animales, y en casi todos los tipos de clulas. El ADN lleva la informacin gentica y determina el color del pelo, piel y ojos, caractersticas faciales, complexin, altura, tipo de sangre, y cualquier otra cosa que hace a un individuo nico. Tambin lleva la informacin que necesitan las clulas para realizar las funciones que son comunes a todos los miembros de las especies, o a todos los seres vivos, y por esto a menudo se considera como un anteproyecto biolgico. Tu anteproyecto biolgico es una combinacin de la mitad del ADN de tu madre (de su vulo) y la mitad del ADN de tu padre (de su esperma) durante la concepcin. Todas tus clulas contienen ese juego completo de instrucciones. Cualquier ADN tiene el mismo aspecto cuando es extrado de las clulas, pero es emocionante contemplar tu propio ADN, sabiendo que eso es lo que te hace nico y con vida. En esta prctica, extraers tu propio ADN una sustancia que contiene tu propio anteproyecto- de las clulas de tu mucosa bucal. Seguirs un protocolo rpido y sencillo, que los cientficos usan rutinariamente para extraer ADN de diferentes organismos. Cada da los cientficos hacen nuevos descubrimientos estudiando la informacin codificada en nuestro ADN. La comprensin de esta informacin abre la posibilidad de curar enfermedades, siendo la esperanza de millones de personas que sufren de varios trastornos y sndromes genticos, permite fabricar productos mejores de fuentes biolgicas, e incluso abre la puerta a una mayor longevidad. Mediante el estudio de nuestro material gentico estamos empezando a entender quines somos y por qu.

Estructura del ADN

A nivel molecular, el ADN se parece a una escalera de mano enrollada o a una escalera de caracol. Dos largas molculas estn alineadas entre si, y los peldaos estn formados por pares de unidades qumicas llamadas bases. Esta estructura es denominada como doble hlice por la forma espiral o como forma helicoidal compuesta por las dos cadenas. Las bases funcionan como letras de un cdigo, de manera que se conocen como A, G, T y C (abreviaturas de sus nombres completos, adenina, guanina, timina y citosina, respectivamente). Cada base est unida a un azcar y un grupo fosfato, y el azcar y los grupos fosfato forman las columnas de la escalera (un nucletido es una unidad formada por una base, un azcar y un fosfato). Los cientficos han descubierto que en la doble cadena de ADN la A siempre se empareja con la T, y la G con la C. Las 4 letras del ADN se organizan para crear mensajes que pueden ser entendidos por las clulas, y que se denominan genes. Estos genes contienen la informacin para sintetizar las protenas, las cuales son la base de casi todas tus estructuras y funciones corporales. Cada una de tus clulas contiene varios billones de letras formando textos de ADN.

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Extraccin de ADN

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Representacin esquemtica del ADN (cido desoxirribonucleico). El ADN es una molcula de larga cadena que contiene la informacin gentica.

Una secuencia de ADN est determinada por la particular colocacin u orden de las bases a lo largo de la molcula de ADN. Las secuencias de ADN humano son idnticas entre s en un 99.9%. Son las variaciones de la secuencia algo menores al 0.1 % restantes lo que nos hace nicos a cada uno de nosotros. En otras palabras, lo que te distingue de tus compaeros de clase es una diferencia ocasional en la secuencia de bases de tus genes.

Genoma, Cromosomas, Genes, ADN, ARN, y Protenas Cul es la conexin?

El ADN se encuentra en el ncleo de cada clula del cuerpo humano, con la excepcin de los glbulos rojos maduros. El ADN est organizado en estructuras denominadas cromosomas, en las cuales las largas y finas cadenas de ADN estn firmemente enrolladas alrededor de protenas. Cada vez que una clula se divide para el crecimiento, reparacin o reproduccin- los cromosomas se replican mediante un proceso muy organizado llamado mitosis. Los 46 cromosomas hallados en las clulas humanas son anlogos a 46 volmenes de una enciclopedia, los cuales colectivamente contienen toda la informacin de tu genoma. Un gen es una seccin de ADN que contiene la informacin para sintetizar una protena; es como una receta escrita que especifica la composicin y orden de montaje de una protena. El genoma humano contiene aproximadamente 40.000 genes. El genoma es anlogo a una coleccin (gigantesca) de libros de cocina (recuerda, hay 46 volmenes en la coleccin completa); al igual que no se hacen a la vez todas las recetas de un libro de cocina para preparar una comida, no todos los genes del genoma se usan en cada clula. Esta expresin selectiva de genes en funcin del tipo de clula genera las caractersticas de los diferentes tipos de clulas en tu cuerpo. Bsicamente, todas tus clulas contienen los mismos libros (cromosomas), pero diferentes clulas leen recetas (genes) diferentes de los libros. Aunque los genes determinan las protenas sintetizadas por las clulas, el ADN no es directamente la plantilla para la sntesis proteica. Las plantillas para la sntesis proteica son molculas de ARN (cido ribonucleico) llamadas ARN mensajeros (ARNm). Cada molcula de ARNm es una simple copia de la secuencia de ADN de un gen. Los ARNm son intermediarios que llevan la informacin del ADN, situado en el ncleo, a los ribosomas o fabricantes de protenas, situados en el citoplasma. Los ribosomas descodifican la informacin gentica y unen entre s los aminocidos correspondientes para hacer la protena que est codificada en el gen. Todas las protenas sintetizadas en una clula funcionan para aportar a la clula sus caractersticas.

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Cuestiones:
1. Imagina que ests intentando explicar la diferencia entre cromosomas, genes y ADN a tu hermano o hermana que es un par de aos ms pequeo que tu. Escribe cmo lo explicaras con palabras sencillas que ellos pudieran entender.

2.

Contiene una clula heptica los mismos cromosomas que una clula de la mucosa bucal?

3.

Si quisieras aislar una copia del gen que codifica una protena encontrada en el estmago, podra estar ese gen en las clulas de la mucosa bucal? Razona tu respuesta.

Cmo se puede aislar el ADN de las clulas?

Paso 1. Recogida de las clulas
El primer paso para aislar el ADN es la recogida de las clulas. La mucosa de la boca es una buena fuente de clulas, dado que estas clulas se dividen con mucha frecuencia y continuamente se estn renovando. Simplemente raspando con suavidad el interior de tu boca con una escobilla, podrs recoger la cantidad suficiente de clulas para poder aislar tu propio ADN.

Cuestiones:
A continuacin aparece un dibujo esquemtico de una clula de la mucosa bucal.

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Extraccin de ADN

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4. 5.

Indica los compartimentos celulares, incluyendo la membrana celular, el citoplasma y el ncleo. En qu compartimento celular esperas encontrar tu ADN?

6.

Por qu es necesario un intermediario como el ARNm para pasar de la informacin del ADN a la sntesis de las protenas?

7.

Cul crees que ser el siguiente paso en el aislamiento del ADN de tus clulas?

Paso 2. Lisis de las clulas y de las membranas fosfolipdicas

Si pensaste que el siguiente paso en la extraccin de ADN era romper las clulas, acertaste!. Los detergentes disuelven las molculas grasas, y las membranas celular y nuclear estn formadas principalmente por lpidos (sabrs que las membranas celulares estn formadas por bicapas de fosfolpidos). As, despus de recoger las clulas de tu boca, las pondrs en una solucin que contiene detergente.

Cuestiones:
8. Una vez que las membranas se han roto, el ADN queda libre en la solucin, al igual que otras molculas celulares. Haz un listado de las molculas que junto con el ADN esperas encontrar en la clula.

9.

Qu mtodo o agente crees que se puede usar para eliminar esas molculas que no nos interesan?

Paso 3. Utilizacin de proteasa para romper las protenas celulares

Como ya habrs adivinado, las molculas que principalmente podran interferir en la precipitacin del ADN son las protenas. Podemos deshacernos fcilmente de las protenas sin daar el ADN, usando una enzima especfica que digiere las protenas, llamada proteasa. La proteasa rompe los enlaces peptdicos existentes entre los aminocidos de las protenas. Al destruir todas las protenas tambin eliminars las DNAsas, que son enzimas que digieren ADN (porque las enzimas son protenas).

Cuestiones:
10. Qu protenas podran estar asociadas al ADN en la clula?

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Extraccin de ADN

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11. La proteasa utilizada en este protocolo tiene un funcionamiento ptimo a 50 C. Crees que esta enzima se ha aislado de E. coli? Razona tu respuesta. Una pista: Dnde vive E. coli?

12. A menudo para ablandar la carne (de un filete, por ejemplo) sta se golpea. Sabiendo que ese filete es tejido muscular rico en protenas procedente de una vaca, puedes pensar en una explicacin de por qu esto funciona?

Paso 4. Insolubilizacin del ADN

Aadirs solucin salina a tu muestra, la cual har que el ADN se haga menos soluble en el extracto celular. EL ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato de su estructura. Cuando se aade sal, los iones sodio con carga positiva son atrados por la carga negativa del ADN, neutralizndose la carga del ADN. Esto permite a las molculas de ADN unirse entre s en vez de repelerse unas a otras.

Paso 5. Precipitacin del ADN con alcohol fro

Para separar el ADN del resto de molculas presentes, aadirs alcohol fro a tu muestra. Como consecuencia, el ADN precipitar porque es menos soluble en alcohol que en agua. Cuanto ms fro est el etanol, menos soluble ser el ADN en l. Esto es similar a la solubilidad del azcar en el t (o en cualquier otra bebida); as, el azcar se disuelve con ms fcilidad en t caliente que en te helado. En presencia de altas concentraciones de sal y de alcohol fro, el ADN liberado de tus clulas precipita y se agrega hasta poder visualizarse a simple vista!. Las otras molculas en el extracto celular, como los aminocidos y carbohidratos, permanecen disueltas en el alcohol y el agua y no se pueden visualizar. Se necesitan muchos miles de cadenas de ADN para formar una fibra lo suficientemente grande para poder ser visible. Cada cadena tiene miles de genes, as que estars viendo millones de genes a la vez. Recuerda, no obstante, que estars viendo el ADN procedente de miles de clulas.

Cuestiones: 13. Une los resultados de la izquierda con los pasos de laboratorio de la derecha: Recoger las clulas Disolver las membranas Precipitar el ADN Romper protenas Hacer al ADN menos soluble en agua A. Pasar un cepillo por el interior de la mejilla B. Aadir proteasa, incubar a 50 C C. Aadir una solucin de detergente D. Aadir alcohol fro sobre el extracto celular E. Aadir sal

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Unidad 2: Extraccin de ADN de las clulas de la mucosa bucal

Guarda en un frasco tu esencia gentica

Puesto comn
Bao a 50 C Botella de isopropanol 91% sacada del congelador, o etanol 95% en hielo

Nmero
1 1

Puesto de trabajo de los alumnos

Microtubos transparentes, con 1 ml de tampn de lisis Microtubo azul rotulado como prot Microtubo rosa rotulado como sal Tubos transparentes de rosca sin tapa Tapas de rosca de colores Escobillas para citologa Tubos de fondo redondeado de 5 ml Parafilm (trozos pequeos) Pipetas de plstico Gradilla de corcho para tubos eppendorf Rotulador de tinta indeleble Contenedor de residuos

Nmero
4 1 1 4 4 8 4 4 4 1 1 1

Protocolo para la extraccin y precipitacin de ADN

Pasos 1 y 2: Recogida y ruptura de clulas
Para recoger la mayor cantidad posible de clulas de tu boca, usars 2 escobillas. Mezclars las clulas recogidas por ambas escobillas en un nico tubo con la solucin del detergente. Es crucial recoger una elevada cantidad de clulas. Para que todo salga bien, asegrate de que tardas el tiempo recomendado en la recoleccin y transferencia de las clulas. 1. Coge un microtubo transparente con 1 ml de tampn de lisis para ti, y rotlalo con tus iniciales utilizando el rotulador de tinta indeleble.

1 ml de tampn de lisis

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2.

Coge la primera escobilla, y con suavidad psala a lo largo del interior de tu mejilla derecha y por el espacio situado entre tu mejilla y la enca durante 1 minuto. Para que todo salga bien, asegrate de que tardas el tiempo recomendado en la recoleccin. Raspa tu mucosa con firmeza, pero sin daarte.

3.

Introduce la escobilla con las clulas de la mucosa en el tubo que contiene el tampn de lisis. Gira la escobilla para liberar las clulas de la escobilla en el tampn. Frota las cerdas de la escobilla contra el borde del tubo para transferir la mayor cantidad posible de clulas en el tubo. Luego tira la escobilla al contenedor de residuos.

4.

Usando una segunda escobilla limpia, raspa suavemente las clulas del interior de tu mejilla izquierda, entre la mejilla y la enca, por el paladar, y debajo de la lengua durante 1 minuto; de nuevo, trata de recoger la mayor cantidad posible de material.

5.

Introduce la escobilla en el mismo tubo de antes, y gira la escobilla para liberar la mayor cantidad posible de clulas en el tubo. Despus tira la escobilla.

6.

Cierra el tubo y suavemente voltalo 5 veces para mezclar los componentes.

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Extraccin de ADN

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Paso 3. Eliminacin de protenas

1. Coge el tubo rotulado como prot y aade 1 gota de la solucin de proteasa (35 l si utilizas una micropipeta) al tubo que contiene tu extracto celular. Cierra el tubo y voltalo suavemente 5 veces para mezclar los componentes.

1 gota de solucin de proteasa

2.

Pon el tubo con tu extracto celular en la gradilla de corcho de tu puesto de trabajo, y coloca las muestras en el bao a 50 C durante 10 minutos para dejar que la proteasa acte.

Bao 50 C, 10 min.

Pasos 4 y 5. Hacer visible el ADN

1. Saca tu microtubo del bao y aade 2 gotas (70 l si usas una micropipeta) del tubo rotulado como sal. Cierra el tubo y voltalo suavemente 5 veces para mezclar los componentes.

2 gotas de solucin salina

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2.

Rotula con tus iniciales un tubo de 5 ml de fondo redondeado y pasa el contenido de tu microtubo a este tubo.

3.

Coge una pipeta de plstico y llnala con alcohol fro (consulta a tu profesor si es necesario hacer este paso en el puesto de trabajo comn).

4.

Inclina el tubo de fondo redondeado 45 y lentamente aade el alcohol, dejando que caiga con cuidado por la pared interna del tubo. Deberas ver cmo se forman dos capas (superior e inferior). Segn aades el alcohol, fjate especialmente en la zona de unin de la capa de alcohol y de la capa del extracto celular. Anota tus observaciones.

5.

Deja el tubo de 5 ml en posicin vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos.

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6.

A los 5 minutos mira el tubo, especialmente en la zona de unin de la capa de alcohol y de la capa del extracto celular. Ves algo? Anota tus observaciones. Compara tu muestra con las de tus compaeros.

7.

Sella la boca del tubo con un trozo de Parafilm, tapona la boca con el pulgar e invierte lentamente el tubo 5 veces para mezclar los componentes. Busca la presencia de un material fibroso, blanco o claro. Es tu ADN!

8.

Si vas a hacer un collar de ADN, tu profesor te proporcionar un vial de vidrio. Con una pipeta de plstico, transfiere con cuidado al vial el ADN precipitado, junto a aproximadamente entre 750 l y 1 ml de alcohol. A continuacin tu profesor te ensear cmo sellar el vial para poder terminar el collar. Si no vas a hacer el collar de ADN, puedes pasar y conservar tu ADN en un tubo de rosca. Con una pipeta de plstico, saca con cuidado tu ADN precipitado junto a 500 l de alcohol y psalos al tubo de rosca. Ajusta la tapa y asombra a tus amigos y a tu familia al ensearles tu ADN!

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Unidad 3: Genes en un frasco: captura tu propia esencia!

Instrucciones
Advertencia: Ten precaucin al utilizar el pegamento super glue para ensamblar el collar de ADN. Si accidentalmente se te pegan los dedos, aplica en la zona solucin quitaesmalte de uas o acetona en abundancia, y luego aclara la zona intensamente. Si no dispones de quitaesmalte o acetona, aplica agua caliente con jabn y lentamente y con suavidad ve tirando de la piel hasta despegar los dedos. 1. Con una pipeta de plstico, transfiere con cuidado una porcin adecuada de ADN y alcohol al vial de vidrio, dejando espacio suficiente para el tapn de plstico. El vial se debe rellenar dejando al menos 1/2 cm vaco en la parte superior. No rellenes todo el vial con alcohol. FIGURA 33 2. Introduce el tapn de plstico en el cuello del vial para cerrarlo. FIGURA 34 3. Aplica una pequea gota de pegamento en el interior del tapn de plata. Aplica una pequea cantidad de pegamento alrededor del borde del vial de vidrio y del tapn de plstico. No apliques mucho pegamento para que se seque rpidamente. FIGURA 35 4. Coloca el tapn de plata sobre la boca del vial y presiona con firmeza durante 30 segundos. Deja que el pegamento se seque durante 10-15 minutos y despus comprueba que est completamente sellado. FIGURA 36 5. Cuando el pegamento se haya secado, desliza el cordn a travs del tapn de plata y talo.

Enhorabuena, te has hecho un collar con tu propio ADN!

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