LABORATORIO DE BIOQUIMICA I

PRACTICA 5
AISLAMIENTO DE PROTENAS INTRODUCCIN En bioqumica es muy comn aislar y purificar protenas para estudiar su composicin, su estructura y de ser posible su funcin, como es e caso de las enzimas. Para dicha purificacin se emplean mtodos basados en sus propiedades de solubilidad. Cada protena tiene una composicin de aminocidos especfica qu las hace diferentes unas de otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones tambin es diferente. Por lo general las protenas fibrosas son solubles en agua y resistentes a la degradacin enzimtica, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza inica se pueden solubilizar. Las protenas globulares son relativamente mas solubles en agua y en soluciones de baja fuerza inica, aunque algunas coagulan cuando se calientan. La composicin de aminocidos, es tambin responsable del comportamiento de las protenas en diferentes condiciones de pH. As al acidificar o alcalinizar una determinada protena, sta puede llegar a su punto isoelctrico, es decir, alcanzar una carga neta de cero y por lo tanto precipitar. La leche es un producto rico en protenas, tales como las casenas y globulinas, adems de contener carbohidratos y cidos grasos. De la leche se puede separar la casena por precipitacin en su punto isoelctrico (pH 4.6). El huevo tambin es un producto con una buena cantidad de nutrientes, tal como la ovoalbmina, la cual se clasifica como fosfoglucoprotena por tener hidratos de carbono y fsforo. La precipitacin de esta protena con una solucin saturada de (NH4)2SO4 permite aislarla del resto de las protenas que se encuentran en la clara del huevo. Existen factores que afectan el estado nativo de las protenas, sin embargo, stas pueden someterse a una purificacin parcial empleando tcnicas bioqumicas sencillas como la centrifugacin, dilisis y cromatografa. OBJETIVO GENERAL Poner en practica los mtodos bioqumicos para la purificacin parcial de protenas, basados en sus propiedades de solubilidad. OBJETIVO PARTCULAR Aislar caseina de la leche a partir de su punto isoelctrico Aislar la albumina de la clara de huevo por precipitacin con sulfato de amonio. Familiarizar al alumno con el uso de la centrfuga.

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MATERIALES Y METODO
1 1 2 1 2 4 1 1 1 1 1 1 4 2 1 1 1 MATERIALES Probeta de 100 mL Probeta de 50 mL Vasos de Precipitados de 250 mL Vaso de Precipitados de 100 mL Pipetas Graduadas de 5 mL Tubos de Centrifuga de 50 mL Agitador de Vidrio Matraz Kitazato Parrilla Electrica Piceta Potencimetro Centrfuga clnica Viales de Vidrio Pipetas Pasteur Embudo Buchner Embudo de Vidrio Palangana MATERIALES Gasa REACTIVOS HCl NaCl (NH4)2SO4 Acido Actico Glacial Acetato de Sodio Etanol Acetona ter Etlico ALUMNOS 120 mL de Leche Cruda de establo (no Industrializada) 1 Huevo Fresco

Soluciones Solucin de HCl al 20% (v/v) Solucin de cido actico 1.0M Solucin amortiguada de (NH4)2SO4

Preparacin: Agregar 780 g de (NH4)2SO4 a un litro de agua y calentar por agitacin. Adicionar 12.3 g de acetato de sodio. Enfriar y aadir 9 mL de cido actico glacial. Dejar que sedimenten los cristales, use solo el sobrenadante.

METODO A. Obtencin de la Caseina 1. El da anterior a la prctica, dejar enfriando la leche para que se separe la parte lipidica. 2. Al iniciar la prctica, eliminar los lpidos que se encuentran en la superficie con una pipeta Pasteur 3. Despus de haber eliminado los lpidos, tomar 3 mL de la leche y guardar en el refrigerador en un vial previamente etiquetado. 4. Colocar 100 mL de la leche descremada en un vaso de precipitados de 250mL junto con el agitador magntico y agitar suavemente sobre la parilla. 5. Calibrar el potencimetro con las soluciones patrn de pH7 y pH4 6. Introducir el electrodo en el vaso con leche, cuidando no golpearlo con el agitador magntico. 7. Adicionar lentamente, con una pipeta Pasteur, la solucin de HCl al 20% hasta ajustar el pH a 4.6. 8. En el punto isoelctrico se formar un precipitado voluminoso. En ese momento se detiene la agitacin y se deja reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

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9. Mezclar la suspensin por unos cuantos minutos y distribuirla en tubos de centrfuga, procurando recuperar todo el precipitado. 10. Equilibrar los tubos por parejas y centrifugar a 2000 rpm durante diez minutos. 11. Verter el sobrenadante en una probeta y anotar el volumen total. Tomar 3 mL de ste y guardarlo en un vial previamente etiquetado. El resto se desecha. 12. el precipitado de todos los tubos se coloca en un vaso. Agregar 20 mL de agua y agitar sobre una parrilla con un agitador magntico, hasta obtener una suspensin homognea. Este lavado es para eliminar el HCl. 13. Colocar la suspensin en un solo tubo de centrfuga efectuar el proceso de centrifugacin a 2000 rpm durante diez minutos. Desechar el sobrenadante y repetir los lavados con agua dos veces ms. 14. Al eliminar el agua del ltimo lavado adicionar 10 mL de etanol al precipitado y homogeneizar con un agitador de vidrio. Volver a centrifugar para eliminar el etanol. 15. Finalmente, lavar con acetona y ter etlico de la misma forma que se hizo con el alcohol. 16. Recuperar el precipitado y colocarlo en papel aluminio, en forma extedida, para que se seque y forme un polvo. B. Obtencin de Albmina. 1 Colocar la clara de huevo en una probeta y medir su volumen, evitando que se rompa la yema 2 Verter la clara en un vaso de precipitados, agregar la dcima parte de su volumen de cido actico 1.0 M y agitar. 3 Filtrar la albmina acidificada a travs de cuatro capas de gasa, agitando fuertemente con una varilla de vidrio para acelerar el proceso. 4 Al filtrado aadir un volumen igual de la solucin de sulfato de amonio amortiguado, y agitar. Dejar reposar la solucin durante 15 minutos en un bao de hielo. 5 Separar el precipitado que contiene ovoalbmina y ovomucina centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos. 6 Al sobrenadante que contiene la albmina, aadir pequeas cantidades de la disolucin de sulfato de amonio: se notar una ligera turbidez que desaparecer al agitar. Siga vertiendo sulfato de amonio y agite hasta que la turbidez ya no desaparezca, agregar un poco ms para permitir que la albmina precipite. 7 Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas 8 Eliminar el sobrenadante por centrifugacin. 9 Suspender la albmina en 5 mL de acetona y recuperar filtrando en un embudo Buchner. 10 Colocar el residuo en un papel aluminio y dejar que seque completamente al aire. Guardar en un vial etiquetado. Las soluciones utilizadas en esta prctica pueden eliminarse en la tarja, manteniendo la llave del agua abierta para diluir y al terminar lavar la tarja.

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RESULTADOS 1 Cuntos gramos de casena obtuvo? 2 Qu porcentaje representa del volumen inicial? 3 Cuntos gramos de albmina obtuvo? 4 Qu porcentaje representa del volumen de la clara? ANALISIS DE RESULTADOS Entregar al profesor los resultados obtenidos para su recopilacin grupal. El anlisis de los resultados aplicara para todos los equipos. Despus de alcanzar los resultados individuales; compare el CV obtenido entre los equipos. 1. Qu volumen de leche utiliz para la extraccin de casena? 2. El precipitado de casena apareci exactamente a `H 4.6 o requiri acidificar ms? Explique. 3. Para que tuvo que lavar la casena con agua? 4. Los lavados con los solventes orgnicos eran necesarios? Por qu? 5. Segn la literatura, Cuntos gramos deba obtener? Fue bueno el rendimiento? 6. Cul fue el volumen total de la clara de huevo? 7. Cul es la razn de agregar cido actico y filtrar a travs de gasas? 8. Aproximadamente a que concentracin de sulfato de amonio precipita la ovomucina y la ovoglobulina, de acuerdo el volumen de sulfato de amonio que adicion? y Cul es la concentracin de sulfato de amonio a la que precipita la albmina? 9. De acuerdo con lo reportado en la literatura. Cunta albmina tiene el huevo?. Comprelo con su resultado. CUESTIONARIO 1. Qu tipo de protenas son al casena y la albmina estructural y funcionalmente? 2. Qu mtodos se conocen para aislar y purificar protenas? 3. Qu es el punto isoelctrico de una protena? 4. Por qu las protenas precipitan con altas concentraciones de sales? 5. Qu efecto tienen los solventes orgnicos sobre las protenas? 6. En que se basa la centrifugacin para separar partculas de diferente tamao? 7. Cuntos tipos de centrfugas se conocen? 8. Todos los mtodos de extraccin de protenas las desnaturalizan? 9. Es posible saber si una protena est pura? Cmo? 10. Ser costeable purificar protenas industrialmente?

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BIBLIOGRAFIA 1. Badui, D. S. 1990. Qumica de los Alimentos. Editorial Alambra Mexicana S. A., Mxico 2. Clark J. M. Jr 1964. Experimental Biochemistry. W. H. Freeman and Company E.U.A. 3. Rendina, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica aplicada. Nueva Editorial Interamericana, S. A. Mxico. 4. Voet, D. y Voet, G. J. 1995 Bioqumica, Omega Ediciones, Barcelona. 5. Vogel A. I. 1983. Textbook of Cuantitative Inorganic Anlisis. 4 Edicin, Editorial Richard Clay (The Chauser Press) Ltd. Bungay, Gran Bretaa. 6. Mathews C. K., Van Holde K. E., Ahern K. G. 2003. Bioqumica. Addison-Wesley, Espaa. 7. http://web.indstate.edu/theme/nwking/biomolecules.htmls. 8. http://www.ehu.es/biomdeculas/PROT/PROT2.htm 9. http://docencia.izt.uam.mx/acbq/

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