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POTENCIAL DE TCNICAS REPRODUCTIVAS

PARA LA CONSERVACIN DEL JAGUAR
Ronaldo G. Morato y R.C. Barnabe

A B S T R A C T. Considering that genetic variability maintenance is dependent on reproduction, assisted reproduction techniques are important tools for the preservation of endangered species. Semen collection, evaluation and cryopreservation, endocrine status,
artificial insemination, oocyte recovery and in vitro maturation and in vitro fertilization are discussed. The preliminary results and the potential application of the assisted
reproduction techniques for jaguar conservation are presented here.
R E S U M O . Considerando que a manuteno da diversidade gentica dependente da
reproduo, a aplicao de tcnicas de reproduo assistida uma importante ferramenta
na preservao de espcies selvagens ameaadas de extino. Colheita, avaliao e criopreservao de smen, monitoramento da funo endcrina, inseminao artificial, colheita e maturao de ocitos in vitro e fecundao in vitro so discutidos. Resultados preliminares e o uso potencial das tcnicas de reproduo assistida na preservao da ona
pintada so aqui apresentados.
R E S U M E N . Considerando que el mantenimiento de la variabilidad gentica depende de

la reproduccin, las tcnicas de reproduccin asistida son herramientas importantes

para la conservacin de especies en peligro de extincin. En este trabajo se discuten la colecta, evaluacin y criopreservacin de semen, el estado endocrino, la inseminacin artificial, la recuperacin y maduracin in vitro de oocitos, y la fertilizacin in vitro. Se presentan aqu los resultados preliminares y la aplicacin potencial de las tcnicas de
reproduccin asistida para la conservacin del jaguar.

INTRODUCCIN

El jaguar (Panthera onca), el gato ms grande del continente americano, habita

diferentes regiones desde el norte de Mxico hasta Argentina (Oliveira, 1994).
P A L A B R A S C L A V E : Jaguar, reproduccin in vitro, cautiverio, conservacin, criopreservacin.

[ ]

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Sin embargo, el nmero de animales en condicin silvestre ha disminuido debido

a una variedad de factores. El principal de ellos es la prdida y fragmentacin del
hbitat, lo que ha llevado a la reduccin de las poblaciones a niveles crticos que
pueden conducir a la prdida de la diversidad gentica, cuyas consecuencias han
sido bien documentadas por muchos autores (Barone et al., 1994a; OBrien et
al., 1985; OBrien et al., 1986; OBrien y Evermann, 1988; Ralls et al., 1979;
Roelke et al., 1993).
Se ha reportado que las poblaciones cautivas de jaguar son en su mayora genricas en los zoolgicos brasileos (Morato y Gasparini, 1994) y estadounidenses (registro de control gentico de jaguar), lo que disminuye el uso potencial de
los zoolgicos como fuentes genticas.
Considerando la importancia de mantener la diversidad gentica, la reproduccin de jaguares en estado silvestre y cautivos de origen conocido debe convertirse en un componente integral de los esfuerzos de preservacin.
Las tecnologas reproductivas asistidas, como la inseminacin artificial (IA),
la fertilizacin in vitro (FIV) y la transferencia de embriones (TE), pueden ser vistas como herramientas importantes para salvaguardar al jaguar; esto con base
en sus aplicaciones altamente exitosas en el ganado domstico, en el ser humano (Wildt et al., 1993) y en el progreso reciente obtenido en especies de gatos
salvajes.
La Organizacin Mundial de Zoolgicos y el Grupo de Especialistas en Reproduccin en Cautiverio de la Unin Internacional para la Conservacin de la
Naturaleza consideran las tcnicas de reproduccin artificial como herramientas
tiles para el manejo de poblaciones porque pueden 1) simplificar el intercambio gentico entre dos o ms sitios de programas ex situ; 2) permitir la reproduccin de animales con desventajas fsicas o en su comportamiento reproductivo;
3) hacer posible el crecimiento rpido de las poblaciones; 4) ayudar a corregir
proporciones sexuales disparejas; 5) ayudar a regular el nmero de cras por individuo, y 6) hacer posible el intercambio de material gentico entre poblaciones
in situ y ex situ.
En aos recientes, se han producido cras utilizando IA en los chitas (Acinonyx jubatus; Howard et al., 1992), la pantera nebulosa (Neofelis nebulosa;
Howard et al., 1996), el tigre (Panthera tigris; Donoghue et al., 1993), el gato
leopardo (Prionailurus bengalensis; Wildt et al., 1992), el puma (Puma concolor;
Barone et al., 1994b) y el ocelote (Leopardus pardalis; Swanson et al., 1996), y
el uso de FIV y TE han producido cras en el tigre Donoghue et al., 1990) y en
el gato del desierto indio (Felis silvestris; Pope et al., 1989). Sin embargo, un rgimen de reproduccin asistida que funciona para una especie puede fallar con
otra debido a caractersticas fisiolgicas especficas que existen incluso entre es-

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pecies cercanamente relacionadas dentro de la misma familia y gnero (Wildt

et al., 1992).
Aqu describimos el avance de las tcnicas de reproduccin que han sido utilizadas en varias especies de gatos y su aplicacin actual y potencial para la conservacin del jaguar.

MTODOS

Colecta de semen, evaluacin y criopreservacin

La colecta de semen se ha realizado en 28 especies de gatos (Howard et al., 1984)
utilizando el protocolo estndar desarrollado por Wildt et al. (1983), que consiste en la aplicacin de 80 estmulos divididos en 3 series de la siguiente manera:
30 estmulos (10 estmulos en 2, 3 y 4V: serie 1), 30 estmulos (10 estmulos a
3, 4 y 5V: serie 2) y 20 estmulos (10 estmulos a 5 y 6V: serie 3).
El procedimiento de coleccin de semen se hace en animales anestesiados. Para
esta investigacin, fue utilizada una combinacin de tiletamina-zolazepam en
una proporcin de 10 mg/kg (Morato, 1997). Debe evitarse el uso de algunas
drogas porque pueden interferir con la electroeyaculacin induciendo la contaminacin con orina (p. ej. acepromazina; Martin, 1978) o disminuyendo el volumen total en la eyaculacin (p. ej. atropina; Platz y Seager, 1978). Tambin puede haber contaminacin con orina cuando el voltaje excede el mximo necesario
para la electro-eyaculacin o cuando la sonda est desplazada hacia el crneo
(Howard, 1993).
Se utiliz una sonda de 29 2.3 cm (Morato et al., 1998) y el electroeyaculador es el mismo que se usa para bovinos.
El volumen total y el pH de cada muestra de semen fueron evaluados al momento de la colecta. La movilidad estimada (0-100%) y la tasa de progresin (estado 0-5) se basan en observaciones de cuatro campos microscpicos por separado magnificados a 100x. La concentracin de espermatozoides se determin con
un hemacitmetro de Neubauer, para lo cual se diluy 1:3 una alcuota del semen colectado. La evaluacin morfolgica de 200 clulas espermticas individuales se llev a cabo con un microscopio de contraste de fases (1000x; Howard,
1993; Morato et al., 1998; Wildt et al., 1993). El resultado de las evaluaciones
de 54 colecciones de semen de jaguares cautivos se presenta en el cuadro 1.
Desde 1995 hemos colectado y evaluado el semen de 3 jaguares libres, capturados para estudios de radiotelemetra. Los resultados para cada animal se
muestran en el cuadro 2.

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Cuadro 1. Caractersticas del semen colectado de jaguares en cautiverio

(promedio DE) en los zoolgicos de So Paulo y de Sorocaba,
de julio de 1995 a julio de 1996
Parmetro
Volumen(ml)
Concentracin de espermatozoides (106/ml)
Movilidad (%)
Estado (0-5)
Normal (%)
Anormal
Primario
Macroceflico (%)
Microceflico (%)
Biceflico (%)
Cabezas de forma angosta (%)
Cabeza redonda (%)
Acrosoma anormal (%)
Acrosoma en forma de botn (%)
Porcin media anormal (%)
Sin porcin media (%)
Cola apretadamente enrollada (%)
Biflagelado (%)
Secundario
Porcin media doblada sin gotita (%)
Porcin media doblada con gotita (%)
Cola doblada sin gotita (%)
Cola doblada con gotita (%)
Gotita proximal (%)
Gotita distal (%)
Cuello doblado (%)

Promedio DE
7,42 3,69
6,20 3,03
62,60 11,00
2,71 0,52
46,70 5,80

0,50 0,89
1,30 1,25
1,00 1,58
18,40 6,49
1,60 1,23
3,60 2,00
1,80 1,40
1,50 1,36
0,20 0,42
4,70 3,20
0,50 0,97
2,95 1,90
2,90 2,40
4,30 2,42
1,95 1,80
2,95 2,32
2,40 2,47
0,75 1,00

La criopreservacin de las muestras de semen se ha hecho utilizando el protocolo estndar para especies de gatos descrito por Platz y Seager (1978). En
breve, despus de diluir el esperma con el medio de Ham F10 la mezcla se centrifuga a 300 g por 10 min., el sobrenadante se remueve y el botn de esperma
se resuspende con PDV, un criodiluyente de semen (20% de yema de huevo,
11% de lactosa, 4% glicerol). Despus, el esperma se transfiere a tubos (0.25
ml) que son colocados en refrigeracin (4-7 C) por 30 min. Posteriormente son
congelados en vapor de N2 y luego sumergidos en N2 lquido para su almacenamiento.
La evaluacin del semen descongelado ha demostrado su calidad pobre con
30% de motilidad y estado promedio dos para los jaguares cautivos y libres.

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Cuadro 2. Caractersticas del semen de jaguares de vida libre capturados en Brasil de 1995 a 1998
para realizar estudios de radiotelemetra

Nmero de colectas
Edad estimada (aos)
Volumen eyaculado (ml)
Conteos totales de espermatozoides ( 106ml)
Movilidad de los espermatozoides (%)
Estado (0-5)
Espermatozoides anormales (%)
Volumen testicular (cm3)

Macho 1

Macho 2

Macho 3

1
10
65
283
86
4
28
63.8

1
4
5.0
442
60
3
41
59.7

1
2.5
2.2
17
86
3-4
36
54.5

Otros procedimientos para comprobar el funcionamiento del esperma son el

homlogo (gato) o el hmster heterlogo de zona-libre (Howard, 1993) y el
ensayo de penetracin de vulos bovinos (Nelson et al., 1999). Nuestros datos
hasta el momento, revelan una tasa de penetracin para el esperma de jaguar descongelado de 27% (Paz, com. pers.). Estos ensayos tambin son efectivos para estudiar factores que influyen en la FIV (Howard,1993). Paz (com. pers.) ha demostrado que la tasa ptima para la penetracin de vulos por espermatozoides de
jaguar se logra despus de 30 min de pre-incubacin a temperatura ambiente y
3 h de co-incubacin (5% CO2 a 38 C). Los oocitos de gato domstico pueden
ser utilizados para estimar la capacidad de los espermatozoides para ligarse a la
zona pelcida y para penetrarla (Howard, 1993). La combinacin de ensayos de
hmster de zona libre o de bovinos y el ensayo de zona intacta de gato, puede ser
til para analizar tres estados crticos de las interacciones espermatozoide-vulo:
ligamiento a la zona pelcida, penetracin de la misma y descondensacin del
ncleo del espermatozoide dentro del vitelo (Howard, 1993; Howard et al.,
1991).

Monitoreo de la funcin testicular y de los ovarios

Es importante entender la fisiologa reproductiva bsica para hacer un manejo
eficaz de especies cautivas y libres (Lasley y Kirkpatrick, 1991). En animales domsticos, tales estudios pueden ser realizados con colectas de muestras de sangre
y mediciones de los niveles de las hormonas esteroideas en el suero por medio de
ensayos radioinmunes. Sin embargo, para especies como el jaguar, la colecta de
muestras de sangre en serie puede ser estresante y cara, ya que es necesaria una inmovilizacin con mtodos qumicos. El estrs puede alterar la produccin las de

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hormonas cuyos niveles se registran (Loskutoff et al., 1982). An ms, las gonadotropinas y las hormonas esteroideas sexuales son liberadas en ondas por pulsos,
produciendo variaciones en los niveles del suero durante el da (Reichlin, 1992).
Un mtodo alternativo para vigilar el estado de las hormonas reproductivas
es la colecta de orina y heces fecales. Esto usualmente puede lograrse sin contener o capturar los animales. El anlisis de metabolitos de esteroides sexuales de
orina o heces ha sido til para determinar el estado reproductivo en muchas especies (Lasley y Kirkpatrick, 1991). Sin embargo, la aplicacin de esta tcnica requiere de estudios adicionales para entender el metabolismo y la excrecin de
hormonas esteroideas en la familia, el gnero y la especie de inters. Utilizando
al gato domstico como modelo para la familia Felidae, Shille et al. (1990) observaron que > 90% de los metabolitos esteroideos son excretados en las heces.
Despus de esto, Brown et al. (1994) fueron capaces de cuantificar los metabolitos de estradiol y progesterona en gatos no domsticos. En 1996, Brown et al.
extrajeron y midieron testosterona en gatos domsticos y en el gato de Pallas (Felis manul ), demostrando la utilidad de esta tcnica para estudios longitudinales
de la funcin reproductiva de los machos.
Actualmente estamos colectando muestras fecales de machos y hembras de
jaguar en cautiverio en los zoolgicos de So Paulo, Sorocaba, Campinas y Ro
de Janeiro, y de animales en libertad en los parques estatales Porto Primavera y
Morro do Diabo con objeto de 1) estudiar el ciclo del estro en animales en cautiverio y en libertad; 2) estudiar la funcin testicular en jaguares cautivos y libres;
3) analizar la influencia de las estaciones en la actividad reproductiva en jaguares
machos y hembras, cautivos y en libertad; 4) analizar la relacin entre el comportamiento sexual y los perfiles hormonales en los jaguares macho y hembra, y
5) diagnosticar las fallas testiculares y de ovarios.

Recuperacin de oocitos, maduracin in vitro, FIV y transferencia de embriones

La recuperacin de oocitos se basa en dos tcnicas: 1) colecta post mortem o despus de la ovariectoma, y 2) aspiracin de folculos va laparoscopa.
En el primer caso, los oocitos de ovarios pueden ser recuperados despus de 36
h a partir de ovarios almacenados ex situ en un medio fisiolgico (Johnston et al.,
1991). Anteriormente, Johnston et al. (1989) reportaron que los oocitos foliculares de gatos pueden madurar a la metafase II cuando son recuperados de 24 a
32 h despus del almacenamiento original.
En el segundo caso, previo a la laparoscopa se aplica un tratamiento exgeno de gonadotropinas para inducir la actividad de los ovarios. Un tratamiento

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Cuadro 3. Resultados preliminares de la estimulacin de los ovarios

en las hembras de jaguar tratadas con 50UI pFSH seguido de
25UI pLH, por va intramuscular
Mes

Nm. hembras superovuladas/

nm. de hembras tratadas

Mayo
Agosto
Noviembre

2/2 (100%)
1/1 (100%)
1/1 (100%)

Nm. total de folculos3

de 2 mm de dimetro
29*
18
29

* Resultados para tres ovarios visualizados.

con gonadotropina corinica de equinos (GCe) seguido por gonadotropina corinica de humanos (GCh) ha tenido xito en tigres (Donoghue et al., 1990), chitas
(Howard et al., 1992), panteras nebulosas (Howard et al., 1996), pumas (Barone et al., 1994b) y ocelotes (Swanson et al., 1996). Sin embargo, tratamientos
mltiples con GCe/GCh pueden disminuir progresivamente la sensibilidad de los
ovarios debido a la formacin de inmunoglobulinas que las neutralizan (Swanson
et al., 1995). Recientemente, Amanda Miller, en el Instituto Eplley (Centro Mdico de la Universidad de Nebraska), encontr que las gonadotropinas de tigre
(FSH y LH) parecen ser homlogas a las gonadotropinas porcinas (no publicado).
Esta informacin proporcion un nuevo protocolo de tratamiento para tigres,
utilizando FSH (FSHp) y LH (LHp) de puercos, lo que permiti estimulaciones repetidas cada 100 das para la recuperacin de oocitos maduros (N. Loskutoff, com.
pers.). Con base en los resultados de la estimulacin de ovarios en tigres, empezamos un estudio en colaboracin con el Zoolgico de Henry Doorly, la Asociacin Pro-Carnvoros/Centro Nacional de Predadores (CENAP)/Instituto Brasileiro
de Meio Ambiente (IBAMA) y el Departamento de Reproduccin/FMVZ/USP utilizando FSHp y LHp para la estimulacin de ovarios en el jaguar. Los resultados preliminares se muestran en el cuadro 3.
De los oocitos recuperados, 17 (61%) fueron clasificados como buenos, 6
(21%) como satisfactorios, y 4 (14%) como pobres (vase Pope et al., 1997).
Uno de ellos (4%) haba degenerado.
La investigacin que se est realizando permitir acumular datos suficientes
para hacer recomendaciones sobre el uso de FSHp y LHp en los jaguares, incluyendo dosis y tiempo de administracin.
La FIV ha sido exitosa para muchas especies de gatos; sin embargo, por el momento no hemos sido capaces de producir embriones por FIV para los jaguares.
Hemos considerado la baja calidad del semen y el momento de la recuperacin
del oocito como factores limitantes. Este ao se realizarn nuevos ensayos y nuestros objetivos son analizar diferentes tiempos para la recuperacin de los oocitos

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y probar diferentes protocolos para la criopreservacin del semen. Otro paso es

la produccin de cras una vez que barreras como la tcnica de criopreservacin
de embriones y el tiempo de la transferencia del embrin sean superadas, y lograr
con ello el xito completo de la tcnica de FIV.

CONCLUSIONES

Las tcnicas de reproduccin asistida han sido exitosas para muchas especies de
gatos. Para los jaguares estamos colectando y evaluando semen exitosamente utilizando protocolos estndares. Tambin estamos probando un nuevo protocolo
de congelacin de semen de jaguar, pues hemos observado que el protocolo de
congelacin utilizado para muchas especies de gatos no es el ptimo para este caso. Conforme se acumulen los datos sobre la fisiologa bsica del jaguar y los resultados de la estimulacin de los ovarios y resucitacin de los oocitos, estaremos
en condiciones de escoger el mejor momento para los procedimientos de reproduccin artificial como IA, FIV y TE. Aunque el tratamiento de pFSH y pLH ha inducido exitosamente la estimulacin de los ovarios en jaguares, los resultados han
sido variables y todava no estamos en condiciones de recomendar este protocolo,
incluso considerando el alto porcentaje de oocitos de buena calidad as recuperados. La produccin de embriones por FIV contina siendo un reto para nuestro equipo. Con base en los resultados exitosos utilizando las tcnicas de reproduccin asistida para muchas especies de gatos, creemos que IA, FIV y TE pueden
ser herramientas muy importantes para la preservacin del jaguar. Para mejorar
los resultados e incrementar el entendimiento de la reproduccin, los trabajos en
colaboracin sern muy importantes.

AGRADECIMIENTOS

Esta es una publicacin de la Asociacin Pro-Carnvoros/CENAP/IBAMA (nm. 6).

Reconocemos y agradecemos a Elizabeth Crichton, Naida Loskutoff y Douglas
Armstrong su asesora y asistencia. Este trabajo fue apoyado por la Fundaao de
Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP, nm. 97/ 02051-7 y nm.
97/9160-0), el Zoolgico Henry Doorly de Nebraska, y Companhia Energtica
de So Paulo (CESP).

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Reproduccin asistida en jaguares

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