Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica) No. 63 p .

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Avances en el Fomento de Productos Fitosanitarios No-Sintticos

Produccin, uso y control de calidad de

Introduccin
El uso excesivo de plaguicidas provoca efectos negati- En muchos casos,el uso de estos hongos se combi-
vos en el suelo, el agua y el ambiente. Adems ha con- na con otras medidas de control.Por ejemplo,en el cul-
tribuido a aumentar los problemas de plagas debido al tivo de caf, la aplicacin de entomopatgenos para el
desarrollo de resistencia y a la destruccin de los ene- control de la broca del caf (Hypothenemus hampei) se
migos naturales. Muchos plaguicidas tambin afectan complementa con prcticas culturales. En el caso de
la salud de las personas. repollo, adems del hongo entomopatgeno usados
Para reducir estos efectos se procura la imple- para el control de la palomilla del repollo (Plutella
mentacin de sistemas agrcolas sostenibles, basados xylostella) se aplican productos botnicos como nim y
en el conocimiento de las relaciones entre los cultivos, microbianos como Dipel.
el ambiente y los organismos presentes en el campo.
Una de las alternativas es el uso de organismos ento- Hongos entomopatgenos
mopatgenos, los cuales tienen la capacidad de redu- Estos hongos se encuentran en la naturaleza, en ras-
cir las poblaciones de plagas. Existen varios tipos de trojos de cultivos, estircol,en el suelo, las plantas, etc.
organismos entomopatgenos, tales como virus, hon- Logran un buen desarrollo en lugares frescos, hme-
gos, bacterias y nematodos. Actualmente, se han iden- dos y con poco sol.
tificado y estudiado diversas especies de hongos que Los hongos entomopatgenos constituyen el gru-
afectan plagas de cultivos de importancia econmica; po de mayor importancia en el control biolgico de in-
muchos de ellos son utilizados exitosamente en pro- sectos plagas. Prcticamente, todos los insectos son
gramas de control biolgico. Algunos de stos ento- susceptibles a algunas de las enfermedades causadas
mopatgenos son reproducidos masivamente y se por estos hongos. Se conocen aproximadamente 100
venden comercialmente. gneros y 700 especies de hongos entomopatgenos.
En Nicaragua, productores de caf, repollo, pl- Entre los ms importantes estn: Metarhizium, Beau-
tano y chile dulce han logrado reducir el dao causa- veria,Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Ery-
do por las plagas mediante el uso de estos agentes nia, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella,
microbianos sin afectar la salud humana ni el am- Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium.
biente.Adems sus cosechas estn libres de plaguici-
Accin de los hongos entomopatgenos sobre
das sintticos.
En Nicaragua se ha desarrollado una metodolo- la plaga
ga para la produccin semi-industrial de B. bassiana y En general, las fases que desarrollan los hongos sobre
M.anisopliae.Tambin se formulan productos con ba- sus hospedantes son:germinacin,formacin de apre-
se en estos hongos para el control de plagas en diver- sorios, formacin de estructuras de penetracin, colo-
sos cultivos como caf, repollo, pltano y algodn. nizacin y reproduccin.El inculo o unidad infectiva
Adems se ha desarrollado una tecnologa de multi- est constituido por las estructuras de reproduccin
plicacin artesanal de hongos entomopatgenos. sexual y asexual, es decir las esporas y conidias.

1 Universidad nacional Agraria de Nicaragua. Managua, Nicaragua. esave@ibw.com.ni

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 El proceso se inicia cuando la espora o conidia se hongo son cubiertos completamente por micelio, el
adhiere a la cutcula del insecto;luego se produce un tu- cual inicialmente es de color blanco pero se torna ver-
bo germinativo y un apresorio, con ste se fija en la cu- de cuando el hongo esporula.
tcula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de pe- Verticillium lecanii. Este hongo pertenece al mismo
netracin) se da la penetracin al interior del cuerpo grupo que los anteriores, se encuentra frecuentemen-
del insecto. En la penetracin participa un mecanismo te atacando fidos y escamas en zonas tropicales y
fsico y uno qumico, el primero consiste en la presin subtropicales. Adems ha sido encontrado sobre in-
ejercida por la estructura de penetracin,la cual rompe sectos del orden Coleoptera,Diptera, Hymenoptera y
las reas esclerosadas y membranosas de la cutcula. El sobre caros. Los insectos infectados por este hongo
mecanismo qumico consiste en la accin enzimtica, tienen una apariencia blanquecina.
principalmente proteasas,lipasas y quitinasas,las cuales Nomureae rileyi. Este hongo ataca ms de 32 especies
causan descomposicin del tejido en la zona de pene- de insectos de los rdenes Coleoptera, Lepidoptera y
tracin, lo que facilita la penetracin fsica. Orthoptera. Con mayor frecuencia se encuentra ata-
Despus de la penetracin, la hifa se ensancha y cando lepidpteros, por ejemplo Spodoptera en maz.
ramifica dentro del tejido del insecto, colonizando El cuerpo de los insectos muertos por este hongo pre-
completamente la cavidad del cuerpo del insecto. A sentan un micelio blanco, que puede tornarse verde
partir de la colonizacin se forman pequeas colonias con la esporulacin.
y estructuras del hongo, lo que corresponde a la fase
final de la enfermedad del insecto.
Plagas ms importantes controladas mediante
Otra forma mediante la cual el hongo puede cau-
sar la muerte del insecto, es mediante la produccin hongos entomopatgenos
de toxinas. Los hongos entomopatgenos tienen la ca- Debido a las caractersticas de la especie y/o de la cepa,
pacidad de sintetizar toxinas que son utilizadas en el mbito de hospedantes, patogenicidad, virulencia y con-
ciclo de las relaciones patgeno- hospedante. Entre diciones ambientales, existen cepas especficas utiliza-
estas toxinas se han encontrado dextruxinas, demetil- das para el control de diferentes plagas.Algunas de las
dextruxina y protodextruxina, las cuales son sustan- plagas ms importantes en Nicaragua controladas con
cias de baja toxicidad, pero de mucha actividad txica hongos entomopatgenos se presentan en el Cuadro 1.
sobre insectos, caros y nematodos. Aunque muchos organismos pueden ser eficaces
para el control de plagas, no todos pueden ser utiliza-
Hongos entomopatgenos ms utilizados dos como agentes de control microbiano. Para que un
Beauveria bassiana. Este hongo pertenece a la clase microorganismo patgeno de insectos pueda ser utili-
Deuteromycetes, orden Moniliales, Familia Monilia-
Cuadro 1. Plagas de importancia econmica controladas me-
ceae (Barnet & Hunter 1972).Se ha informado atacan-
diante hongos entomopatgenos en Nicargua.
do a ms de 200 especies de insectos de diferentes r-
denes,incluyendo plagas de gran importancia agrcola. Cultivo Plaga Hongo
Entre las plagas ms importantes controladas por este entomopatgeno
hongo estn la broca del caf, la palomilla del repollo Caf Broca B. bassiana
y el picudo del pltano (Cosmopolites sordidus). Minador M. anisopliae
Los insectos muertos por este hongo presentan Repollo Plutella B. bassiana
una cubierta blanca algodonosa sobre el cuerpo, la Pltano, algodn Picudos B. bassiana*
cual est formada por el micelio y esporas del hongo. Chile, tomate M. anisopliae
Metarhizium anisopliae. Al igual que B. bassiana, es- Tempate Chinches B. bassiana
te hongo pertenece a la clase Deuteromycetes, orden Arroz M. anisopliae
Moniliales, Familia Moniliaceae (Barnet & Hunter Ajonjol
1972). Caa de azcar, Salivazo M. anisopliae
Este patgeno ataca naturalmente ms de 300 es- pastos
pecies de insectos de diversos rdenes. Algunas plagas Papa Gallina ciega B. bassiana
que son afectadas por este hongo son la salivita de la Granos Bsicos M. anisopliae
caa de azcar (Aeneolamia varia), y chinches plagas Caa de Azcar
de diversos cultivos. Los insectos muertos por este Diversos Afidos y escamas V. lecanii

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zado como agente de control biolgico debe tener al- dustrial y multiplicacin artesanal. A continuacin se
gunas caractersticas como: seguro para los seres hu- describen el proceso seguido en este pas para cada
manos, no patognico a los cultivos, genticamente es- uno de estos tipos de produccin.
table, eficaz a bajas concentraciones, eficaz para el Multiplicacin artesanal. Se inicia con un cultivo
control de un amplio mbito de plagas, compatible puro al que se le denomina "hongo patrn" o "semi-
con prcticas de cultivo, incluyendo el uso de otros lla". Este material es suministrado por el laboratorio
productos, fcil de usar y almacenar, capaz de sobrevi- a los talleres artesanales. Posteriormente, en los talle-
vir en condiciones adversas y la relacin beneficio- res se deposita arroz en bolsas de polipropileno y se
costo de su uso positiva. pone a hervir por una hora durante tres das consecu-
El proceso de desarrollo de un agente de control tivos. El arroz en bolsas es inoculado con el hongo pa-
microbiano conlleva varias etapas desde el aislamien- trn y se deja en condiciones ambientales hasta que el
to hasta su uso, las cuales deben tener una secuencia hongo logra colonizar el arroz. Cuando la bolsa de
determinada. De acuerdo a Campbell (1989), la se- arroz es colonizada completamente, se lava con agua.
cuencia general para el aislamiento y estudio de El caldo o mezcla obtenido del lavado del arroz, se
agentes de control biolgico es la siguiente: aisla- aplica para el control de las plagas.
miento e identificacin del organismo,pruebas de efi- Produccin semi-industrial. Este tipo de proceso
cacia y estabilidad, pruebas de seguridad ambiental, se realiza en varias fases, que van desde la obtencin
preservacin de cepas, posibilidades de formulacin, del cultivo puro hasta la formulacin del producto. En
pruebas sobre estabilidad de almacenamiento, eva- general el proceso est organizado en dos etapas: la
luacin del costo del producto, investigacin de mer- etapa de cepario y la de produccin. El tiempo em-
cadeo, comercializacin y distribucin del agente de pleado en desarrollar el proceso de produccin es de
control biolgico. aproximadamente un mes. La etapa de cepario com-
Debido a que los hongos entomopatgenos son prende el aislamiento de la cepa y la obtencin del
organismos vivos,para lograr un mejor uso como agen- cultivo puro. Adems se considera el mantenimiento,
tes de control de plagas, es muy importante entender reactivacin y preservacin de las cepas. La etapa de
aspectos como:a. los factores que propician el desarro- produccin comprende la preparacin de los sustra-
llo de una epizoota para predecir y manejarla en fun- tos, inoculacin e incubacin de matrices y bolsas, el
ciones del manejo de las plagas,b.la dinmica de la in- proceso de secado (bandeja),la cosecha del hongo y la
teraccin de las plagas, los patgenos y el ambiente. preparacin de las formulaciones. A continuacin se
Tambin se debe conocer la patogenicidad de la cepa describen algunas de estas etapas.
contra la plaga a controlar, as como la cantidad de es- El aislamiento consiste en la obtencin del hon-
poras necesarias para provocar una epizoota en el go a partir de la fuente de inculo, la cual puede ser
campo despus de la aplicacin del hongo.Por esta ra- insectos, plantas; o medios artificiales como PDA (ca-
zn, al realizar las aplicaciones del hongo se debe estar jas de Petri , tubos de ensayo, entre otros.) o de pre-
seguro que se est utilizando la cantidad necesaria de servacin en seco como la slica gel. A partir del ais-
conidias.La eficacia del control de plagas mediante en- lamiento del hongo se procede a la inoculacin de un
tomopatgenos depende del contacto entre la plaga y medio de cultivo, para la obtencin de un cultivo pu-
el hongo, ya que es una medida de supresin directa, ro. Debido a que se trata del paso inicial del proceso
por lo cual la calidad del producto aplicado es clave. de produccin un error afecta todo el proceso.Por tal
razn debemos estar seguros que el hongo aislado co-
Produccin de hongos entomopatgenos rresponde al hongo que nos interesa,adems debe es-
La produccin de hongos entomopatgenos se basa tar libre de contaminantes y tener buen vigor para su
en la multiplicacin masiva del hongo y sus estructu- crecimiento.
ras reproductivas en un sustrato natural. Hasta la fe- El aislamiento de hongos entomopatgenos pue-
cha se han evaluado diferentes tipos de sustratos na- de hacerse de dos maneras: por dilucin seriada y di-
turales, principalmente arroz, trigo, maz, frijol y soya, recto. El aislamiento por dilucin seriada es el mto-
pero lo ms utilizados son arroz y trigo. do ms utilizado, consiste en colocar un insecto
Existen tres mtodos de produccin de hongos esporulado en un recipiente que contiene 10 ml de
entomopatgenos: artesanal, semi-industrial e indus- agua destilada estril con 0,1 % de Tween 80. La sus-
trial. En Nicaragua se realiza la produccin semi-in- pensin resultante se debe agitar bien por 1 min, pa-

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ra que las conidias se desprendan del cuerpo del in- Para la incubacin de matrices y bolsas se utiliza arroz
secto.Como resultado se obtiene una suspensin con- entero precocido como sustrato natural, el cual es hu-
centrada del inculo ms otras partculas; esta sus- medecido y esterilizado previamente para lograr un
pensin es la solucin madre. A partir de esta buen crecimiento del hongo. Para la preparacin del
solucin, se preparan diluciones en serie (101, 102, arroz, se coloca un recipiente con agua en la estufa.
103, 10-4,105, 106). La primera dilucin (101)se ob- Cuando el agua comienza a hervir se vierte el arroz y
tiene transfiriendo con una pipeta estril 1 ml de la se mantiene durante 5 min (el arroz deber tener una
solucin madre a un tubo que contiene 9 ml de agua consistencia suave). Posteriormente, el arroz se pone a
destilada estril con 0,01 % de Tween 80, ste se agi- escurrir en una zaranda hasta que est totalmente fro
ta fuertemente durante 1 min. Luego se coloca 1 ml y seco, con el objetivo de procurar que las matrices no
de esta suspensin en otro tubo de ensayo con 9 ml de adquieran humedad. Para la preparacin de la matriz
agua destilada estril ms 0,01% de Tween 80, obte- se usan recipientes de vidrio de 500 ml.Se utilizan 100
niendo as la segunda dilucin. Este operacin se re- g de arroz en cada recipiente. Las matrices son esteri-
pite varias veces hasta lograr obtener una serie de di- lizadas en el autoclave, durante 4-5 min,a 121 C y 1,2
luciones (10 1 hasta 10 -6). Para realizar la siembra y bares de presin. Despus stas se agitan para evitar
obtener los cultivos del hongo se deben usar las lti- aglomeraciones de los grnulos de arroz, para lograr
mas diluciones (10-4, 105, 106). un crecimiento homogneo del hongo sobre las matri-
El aislamiento directo consiste en la obtencin di- ces una vez inoculadas.
recta del hongo a partir del cuerpo del insecto, pasn- El objetivo de la matriz es reproducir el inculo
dolo luego a un medio nutritivo. Esta tcnica es des- para la inoculacin de las bolsas. Para realizar la ino-
ventajosa debido a que las muestras que se toman del culacin de las matrices se prepara una suspensin de
insecto pueden estar sucias y contaminar el aislamien- inculo a partir del cultivo puro (PDA), este inculo
to. Por esta razn se recomienda hacer una desinfec- debe ser de buena calidad, o sea mostrar un buen cre-
cin externa del insecto con hipoclorito de sodio (3- cimiento y estar libre de contaminantes. El inculo de
5%), enjuagndose con agua destilada estril. Este las cajas es raspado con cuidado hasta obtener un pol-
tipo de aislamiento puede ser de dos formas: a. ras- vo de conidias del hongo. Estas se colocan en 60 ml de
pando partculas del hongo en un insecto desinfecta- agua destilada estril, para formar una suspensin de
do, utilizando un asa bacteriolgica y pasndola en un conidias, que deber presentar aproximadamente una
medio nutritivo o b. con una pinza seca y estril se to- concentracin de 1 x 108 conidias.
ma el insecto esporulado desinfectado y se agita con La inoculacin de las matrices se realiza con una
movimiento verticales y horizontales, sobre la superfi- jeringa usada para uso veterinario, la cual debe ser es-
cie del medio de cultivo. terilizada a 121C y 1,2 bar de presin. Se inoculan 15
Para obtener los cultivos puros se hace un reaisla- cc de la suspensin del hongo por cada matriz que
miento del hongo a partir del cultivo o fuente de in- contiene 100 g de arroz precocido. La cantidad de in-
culo original. El inculo se siembra o deposita en ca- culo obtenido a partir de una caja de Petri,es suficien-
jas de Petri que contienen el medio de cultivo PDA. te para inocular cuatro matrices.
Este cultivo se conoce como puro porque nicamente Una vez preparadas y debidamente inoculadas, se
est el hongo que se desea producir, sin contaminan- incuban las matrices en un cuarto oscuro a 24 - 28 C,por
tes. El cultivo puro es la fuente de inculo para iniciar aproximadamente 8 das.Durante este perodo el hongo
el proceso de produccin, ya que es utilizado para la se desarrolla y producen estructuras reproductivas.
inoculacin de matrices. Las bolsas constituyen el medio de produccin
La incubacin del cultivo se realiza despus de la definitivo, ya que el hongo que se obtiene al final del
inoculacin, para lo cual las cajas de Petri se colocan en proceso es el que crece durante esta etapa. La canti-
los lugares de crecimiento, a una temperatura entre 24 dad de arroz utilizada en la bolsa depende del tamao
y 28 C,durante 4 - 6 das. En ese perodo se observa el de la bolsa, generalmente se usan 200 g por bolsa Las
crecimiento del micelio. Se deben realizar observacio- bolsas son inoculadas con una suspensin de esporas
nes cada 48 horas para eliminar los contaminantes. obtenidas a partir de la matriz, para lo cual se deben
Despus de obtener el cultivo puro se inicia el preparar tanto las bolsas como el inculo.
proceso de produccin propiamente dicho, para lo Para la preparacin de las bolsas se depositan 200
cual se utiliza el arroz como sustrato de produccin. g de arroz entero en bolsas plsticas de polipropileno

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y se les agregan 100 ml agua (destilada o potable), s- dedos y las conidias se desprenden de en forma de
tas se sellan debidamente para ser esterilizadas en el polvo.
autoclave a 1,2 bar de presin y 121C, durante 4 a 5 La cosecha del hongo como parte del proceso de
min. Despus de esterilizar las bolsas, se debe agitar produccin semi-industrial, consiste en separar del
con el objetivo de evitar aglomeraciones, para que el sustrato (arroz) de las estructuras del hongo (conidias
inculo se distribuya uniformemente en el arroz y se y/o esporas) para su posterior formulacin. El polvo
obtenga un crecimiento homogneo. Para la prepara- que se obtiene contiene esporas y/o conidias y micelio
cin del inculo, a cada una de las matrices (coloniza- ms las partculas del sustrato de arroz. Aunque exis-
das por el hongo) se les agregan 750 ml de agua desti- ten equipos mecnicos para la cosecha de estos hon-
lada estril al 0,1% de extravn y se agita el gos, en Nicaragua an no han sido evaluados, por lo
contenido, hasta obtener una suspensin de conidias, que actualmente este proceso se realiza de forma ma-
aproximadamente de 600 ml de suspensin. Cada una nual, utilizando tamices y frotacin. Este mtodo de
de las bolsas de 200 g de arroz es inoculada mediante cosecha solo es prctico para la produccin a pequea
20 cc de la suspensin,para lo cual se utiliza una jerin- escala. El contenido de las bandejas (arroz coloniza-
ga veterinaria previamente esterilizada. Con la sus- do),se deposita en un tamiz de 1 mm, luego por agita-
pensin de inculo obtenida de cada matriz se inocu- cin y frotacin, se separa el polvo de los granos de
lan aproximadamente 30 bolsas de 200 g. arroz. El material retenido por el tamiz se descarta y
Las bolsas inoculadas se colocan en los cuartos de el polvo recolectado se deposita en recipientes para
crecimiento donde permanecen entre 4 y 6 das, du- evaluar el rendimiento.
rante este perodo se revisan las bolsas diariamente, En condiciones ambientales, las conidias cosecha-
eliminando aquellas que presentan crecimiento lento das pueden ser afectadas por la luz, humedad y altas
y no uniforme, dbil y las que estn contaminadas. temperaturas; por lo que una vez cosechado el hongo
El objetivo del proceso de secado es la elimina- se debe mantener en refrigeracin preservar su viabi-
cin de la humedad del hongo y su reproduccin. El lidad por ms tiempo. Durante todo el proceso de pro-
arroz contenido en las bolsas es depositado en bande- duccin,el control de calidad constituye un factor cla-
jas plsticas que presentan orificios en el fondo. Las ve porque permite garantizar el proceso de
bandejas se dejan a temperatura ambiente para que se produccin (rendimiento), adems que el producto
sequen. Al inicio las bandejas se mantienen selladas y obtenido es de calidad y se evita la prdida de mate-
posteriormente se abren.El hongo est listo para la co- riales y reactivos.
secha cuando el arroz tiene una humedad de 4 y 6%.
La incubacin del hongo presente en las bandeja Evaluacin de rendimiento
se inicia con la limpieza de estos recipientes, para lo Al finalizar el proceso de produccin se procede a
cual se humedecen con alcohol y se flamean con un me- evaluar el rendimiento,el cual se refiere a la cantidad
chero.Se seleccionan las bolsas que muestran un conte- de gramos de polvo cosechado y al nmero de coni-
nido de buena calidad,el cual se deposita en las bande- dias/g de polvo cosechado. A partir de este rendi-
jas,colocando el contenido de 10 bolsas por bandeja. miento se procede a estimar el rendimiento neto, pa-
El perodo de incubacin es de aproximadamen- ra lo cual es necesario conocer la viabilidad del hongo
te 15 das y se desarrolla en 2 fases: a. tapado de ban- cosechado.
deja, despus de depositado el arroz en las bandejas El proceso de evaluacin del rendimiento se de-
stas se sellan con cinta de papel pegante Maskin-Ta- sarrolla tiene los siguientes pasos: a. determinacin
pe con el objetivo de formar una cmara de oscuri- del peso del polvo cosechado para lo cual se pesa la
dad con alta humedad relativa para que el hongo con- cantidad de polvo cosechado por bandeja o por kilo
tine su proceso de crecimiento y esporulacin. Esta de arroz. Este rendimiento depende de la especie de
fase dura aproximadamente 6 das. b. Destapado de hongo, de la cepa y del mtodo de produccin. En el
bandejas: una vez que el hongo cubre completamente proceso de semi-industrial este rendimiento puede
los espacios del sustrato, se abren las bandejas para lo- variar entre 200 y 300 g de polvo/kg de arroz, aproxi-
grar eliminar rpidamente la humedad y acelerar el madamente.Por ejemplo, B. bassiana cepa Bb-64 pro-
proceso de secado, el cual se realiza al aire libre y tar- duce 270 - 280 g de polvo/kg arroz; la cepa Bb-114
da de 12 a 15 das aproximadamente. El hongo est lis- aproximadamente 220 g/kg arroz y la cepa NB apro-
to para la cosecha cuando el arroz se frota entre los ximadamente 310 g/kg arroz. b. conteo de conidias/g

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de polvo cosechado,para lo cual se utiliza una cma- taje es colocado en una cmara hmeda, la cual con-
ra de conteo (Neubauer). Este rendimiento est de- siste en una caja de Petri con papel filtro humedecido
terminado por la cepa y por el estado de la misma y y se mantiene a temperatura 24 - 26 C.
vara desde 5 X 10 3 hasta 2,5 X 10 11 conidias/g de pol- Las mediciones se realizan entre las 20 y 24 horas
vo. Generalmente, las cepas de B. bassiana tiene me- despus de realizado el montaje. Se realizan las obser-
jor rendimiento que las de M. anisopliae y entre las vaciones al microscopio utilizando el objetivo de 25 o
cepas de una misma especie tambin existen diferen- 40X. Las variables que se evaluan son: nmero de co-
cias de rendimiento. Para el conteo de conidias se nidias germinadas, nmero de conidias no germinadas
preparan diluciones en serie (101, 102, 103, 10-4, y el total de conidias. Como mnimo deben haber 200
105, 106) del hongo hasta obtener una que permita conidias en cada montaje.
realizar el conteo. Una vez que se tiene toda la informacin de ren-
La primera dilucin se obtiene colocando 1 g de dimiento (nmero de conidias/g y viabilidad), se de-
polvo cosechado en un tubo de ensayo que contiene 9 termina la cantidad de hongo cosechado (polvo) nece-
ml de agua destilada estril con Tween 80 al 0,1%, la sarios para alcanzar la dosis de campo que es
siguiente dilucin se obtiene transfiriendo con una pi- equivalente a 1012 conidias/ha. Toda esta informacin
peta estril 1 ml de la primera dilucin a un tubo que sobre el rendimiento es fundamental para la formula-
contiene 9 ml de agua destilada estril con 0,01 % de cin del hongo.
Tween 80, este se agita fuertemente durante 1 min
hasta lograr obtener una tercera suspensin de 10-3. Elaboracin de formulaciones
De esta manera se va procediendo hasta encontrar la La formulacin del hongo es el proceso mediante el
dilucin adecuada. Cuando se obtiene la dilucin pa- cual el ingrediente activo, es decir las conidias del
ra realizar el conteo, usando una pipeta Pasteur se to- hongo, se mezclan con materiales inertes, tales como
ma una alcuota de la suspensin y se llena la cmara vehculos, solventes, emulsificantes y otros aditivos.
de conteo. Posteriormente, usando un microscopio se Estos materiales inertes ayudan a que el hongo traba-
hace el conteo de conidias, este paso se repite varias je mejor. Todo esto se hace con el fin de lograr una
veces hasta obtener un rendimiento promedio. buena homogeneidad y distribucin de las partculas
La cmara de conteo consiste en una lmina de del hongo, para poder ser manipuladas y aplicadas
cristal un poco ms gruesa que la de un portaobjeto, la adecuadamente.
cual presenta una ranura en forma de H y contiene Para ser formulado, la viabilidad del hongo no de-
dos cmaras entre stas. Para facilitar el conteo, el fon- be ser menor de 95% y el contenido de humedad de-
do de la cmara tiene un rayado "Neubauer" y pre- be estar entre 4 y 6 %.A temperatura ambiente las co-
senta nueve cuadros principales (C.P) de 1 mm por la- nidias mantienen su viabilidad por ms tiempo
do, de los cuales se puede contar el contenido de las cuando el hongo ha sido formulado que cuando se al-
cinco, los cuatro de las esquinas y el central.Para pro- macena el polvo sin formular.
pgulos grandes se puede utilizar los cuadrados prin- Hay dos tipos de formulaciones: a. seca o polvo mo-
cipales, pero para los ms pequeos como los de B. jable en la cual se utiliza un vehculo,el cual puede ser
bassiana y M. anisopliae se usan los cuadrados secun- de origen mineral o vegetal,que ayuda a absorber la hu-
darios del cuadro principal (C.P) central. medad de las conidias y mantiene la viabilidad por un
Evaluacin de la viabilidad del hongo (porcenta- tiempo considerable. b. lquida o emulsificable que uti-
je de germinacin): Su objetivo es obtener la concen- liza un lquido solvente y un emulsificante. El lquido
tracin del hongo, a partir de la cual se preparan las utilizado tiene la funcin de mantener suspendidas las
dosis a utilizar en el campo. Para conocer la viabilidad conidias en el medio para lograr una mezcla homog-
del hongo se esterilizan las cajas de Petri, con papel nea que garantice una buena aplicacin.Adems este l-
filtro y portaobjetos todos en conjunto, en el autocla- quido debe evitar la absorcin de agua por las conidias
ve a 1,2 bar de presin y 121 C. Posteriormente se y mantener su viabilidad.Ambas formulaciones son de
prepara un medio de cultivo y se esteriliza entre 15-17 fcil manejo y su uso depende de la disponibilidad.
min, posteriormente con una pipeta Pasteur se depo- Los materiales utilizados en la formulacin deben
sitan dos alcuotas del medio de cultivo en un porta presentar algunas caractersticas tales como:a. No de-
objeto y con otra pipeta, se depositan sobre stas, al- ben tener actividad biolgica (efecto sobre animales o
cuotas de la suspensin del hongo. Despus este mon- plantas). b. Debe ser inocuo al ambiente. c. Debe pre-

100
sentar caractersticas fsicas adecuadas para mezclarse minantes ms comunes estn los hongos y las bacte-
con las conidias. d.Debe facilitar la aplicacin del pro- rias; por las caractersticas de crecimiento algunos de
ducto. e. No debe afectar la actividad del hongo y f. ellos son ms difciles de eliminar que otros.
Debe ser econmicamente rentable. La diversidad de contaminantes es mayor en la
La viabilidad de los conidias se mantiene mayor etapa de cepario que en la etapa de produccin (matri-
tiempo en la formulacin lquida que en la slida. Sin ces,bolsas y bandejas).Se pueden presentar problemas
embargo, cuando en la formulacin lquida se utilizan de contaminacin en matrices y bolsas. Sin embargo,
aceites minerales o derivados de petrleo, sta no es en bandejas no hay posibilidad de presencia de conta-
aceptada en produccin orgnica debido al tipo de minantes porque el hongo coloniza completamente el
aceite que contiene. sustrato de arroz y utiliza todos sus nutrimentos.
Estudios realizados indican que las conidias pier- Control de calidad de la cepa. El objetivo del control
den su viabilidad a partir de los 10 15 das cuando se de calidad en esta etapa del proceso de produccin es
mantienen a temperatura ambiente, en cambio la via- detectar la presencia de contaminantes en los medios
bilidad se mantiene por ms de 60 das en las mismas de cultivo, para su eliminacin y obtencin de cultivos
condiciones, cuando las conidias son formuladas. puros, con buenas caractersticas de crecimiento y de
El producto formulado debe ser empacado o en- eficacia para el control de la plaga Debido a que en la
vasado en recipientes que no permitan la entrada de etapa de cepario se trabaja con medios de cultivo de
luz porque la radiacin ultravioleta afecta la germina- alto valor nutritivo, existen mayores posibilidades de
cin de las conidias y la actividad del hongo. Adems crecimiento de microorganismos no deseados, princi-
el recipiente debe estar cerrado hermticamente para palmente hongos y bacterias presentes en el ambiente
evitar la absorcin y penetracin de agua. o en otras fuentes de contaminacin.
Por tratarse de productos a base de organismos vi- El control de calidad en la etapa de cepario debe
vos la calidad (viabilidad) se pierde cuando se mantie- realizarse con mucho rigor, debido a que es el inicio
nen en condiciones desfavorables durante mucho tiem- del proceso de produccin,y la seleccin incorrecta de
po.Uno de los factores que ms afecta a los hongos son la cepa y del cultivo puro as como la presencia de
las altas temperaturas, por esta razn si se van a alma- contaminantes afectar los siguientes pasos del proce-
cenar por mucho tiempo se recomienda mantenerlos so, y por consiguiente la calidad y el rendimiento del
en refrigeracin.Si se almacenan por perodos cortos se producto obtenido.
pueden mantener en condiciones ambientales pero en Contaminantes ms comunes. Se considera contami-
lugares frescos, evitando la radiacin directa del sol. nante a todo microorganismo no deseado que se desa-
La aplicacin de los hongos entomopatgenos, rrolla en el medio en el cual se cultiva el hongo ento-
formulados en polvo o en aceite, es semejante a la de mopatgeno. Los contaminantes pueden estar
cualquier otro producto. Por ejemplo, la formulacin presentes en el ambiente y en los materiales emplea-
en polvo es vertida en un el recipiente con agua y se dos en el laboratorio cuando no se cumplen las normas
agita bien por varios minutos para obtener una mez- de trabajo para evitarlo. Estos afectan al hongo por-
cla uniforme. Finalmente, la mezcla se deposita en la que compiten con los nutrimentos del medio y por el
bomba y se asperja sobre el cultivo. El hongo aplicado espacio,adems los contaminantes pueden comportar-
se establece en el campo, ya sea en el suelo, las plantas se como hiperparsitos,es decir alimentarse del hongo,
o sobre la plaga. adems pueden producir sustancias que inhiben el cre-
cimiento y la formacin de estructuras reproductivas.
Control de calidad Entre los hongos contaminante ms comunes es-
En el proceso de produccin de hongos entomopat- tn los gneros: Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
genos el control de calidad constituye un factor clave. Pestalotia.
Este consiste en la evaluacin rigurosa de la calidad Fusarium: Las colonias de este hongo pueden tener
en cada uno de los pasos del proceso de produccin. diferentes coloraciones o presentar pigmentaciones
Su objetivo evitar los problemas de contaminacin y en el medio en que se encuentran. Estas coloraciones
garantizar la calidad del hongo producido. pueden ser naranjas, rosadas, amarillas, crema, viol-
Existen una variedad de microorganismos conta- ceas y producen,macro y micro conidias.
minantes que pueden afectar el proceso, algunos de Penicillium: Conidiforos largos, septados, lisos o ru-
los cuales son patgenos al hombre. Entre los conta- gosos, individuales o en sinemas, ramificado cerca del

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pice en uno, dos o ms verticilos, que le dan aspecto que se diferencia del olor caracterstico de los ento-
de una escoba, ramas terminadas en filides o clulas mopatgenos.
frtiles productoras de conidias, las cuales son produ- Control de calidad de los cultivos puros. Los cultivos
cidas basipetalamente y unidas en cadenas. Las coni- puros utilizados como fuente de inculo para la matriz,
dias son globosas a elpticos, lisos o equinulados. deben ser sometidos a un riguroso control de calidad.
Aspergillus flavus: Es un hongo cancergeno, tiene co- Estos se organizan por lote para dar seguimiento a las
nidiforos hialinos rugosos o reticulados y con vescu- caractersticas de crecimiento que presenten contami-
las globosas, cabezuelas conidiales globosas verde o nantes.La prueba para bacterias contaminantes se rea-
verde amarillentas, esterigma en una o dos series a ve- liza inoculando el hongo con asa bacteriolgica me-
ces hasta en una misma vescula. Conidias globosos a diante rayado en la caja de Petri que contiene agar
ovales. nutriente. Para ello se introduce el asa debidamente
Pestalotia: Las colonias son blancas y estn salpicadas esterilizada, sobre diferentes puntos de la caja con cul-
por unas gotas de exudado negro brillante en las que tivo puro del hongo entomopatgeno,luego se inocula
se encuentra millares de conidias del hongo, pueden por medio de un rayado con el asa sobre la superficie
tener de tres a cuatro septos y son de forma clavada a de las cajas de Petri que contienen el agar nutriente.
obclavada o fusoides a veces tienen coloracin plida A las cajas inoculadas se les da un control cons-
uniforme. Lo ms caracterstico es la presencia de va- tante y se etiquetan con la informacin apropiada (fe-
rias setas a un extremo y un pedicelo ms o menos cha del control,cepa, numeracin de cada una, nme-
corto al otro extremo. ro de pase, tipo de crecimiento, etc.). Las
Los gneros de bacterias contaminantes ms comunes observaciones sobre el crecimiento de bacterias, se ha-
son: Serratia, Erwinia, Pseudomonas y Bacillus. cen entre las 24-48 horas despus de montada la prue-
Serratia: Es una bacteria muy daina para el proceso ba, descartando las cajas de Petri que muestran pre-
de produccin de hongos entomopatgenos, porque sencia de bacterias. En el caso de hongos
no forma colonias sino que cubre por completo el cul- contaminantes se realiza una limpieza del cultivo, eli-
tivo puro donde se encuentra, tomando una colora- minado las colonias por completo.
cin roja y por lo tanto es difcil de erradicar. Control de calidad en la etapa de produccin. En la
Todos estos contaminantes se presentan de mane- etapa de produccin, principalmente en matrices y
ra general a excepcin de Pestalotia que se presenta bolsas la diversidad de contaminantes es menor que
principalmente en cultivos de Verticillium. en el cepario. Los principales problemas de contami-
Para evitar el crecimiento de bacterias al medio nacin son ocasionados por bacterias y generalmente
se le debe de agregar un antibitico como penicilina, ocurren debido a mal manejo del sustrato, por ejem -
cloranfenicol y regular el pH adicionando cido lcti- plo aglomeraciones de arroz o exceso de humedad. El
co. Cuando el dao por bacterias es elevado se reco- tipo de control que se realiza puede ser descriptivo o
mienda asperjar el lugar de trabajo con formalina pa- visual.El descriptivo consiste en llevar en forma deta-
ra erradicarla y esterilizar todo el material que llada, informacin referente a la cepa, registro de la
presente forma de colonias rojas. caja de Petri con su respectivo control de calidad, fe-
El reconocimiento de algunos hongos y bacterias cha de inoculacin,lote, etc..El control visual consiste
contaminantes se realiza el crecimiento caracterstico, en la observacin del crecimiento del entomopatge-
por ejemplo, la presencia de puntos con diferentes for- no en las bolsas.
mas de coloracin. Si el crecimiento del entomopat- Control de calidad de matriz. Las matrices se prepa-
geno es lento y seco y se forman colonias cuya colora- ran de inculos de hongos provenientes de cultivos
cin es rojo, amarillento, verde plido, cremas, puros. Por esta razn se debe hacer una adecuada se-
entonces se trata de hongos. leccin del cultivo a utilizar. Adems cada caja se le
Cuando la contaminacin es por bacterias, el en- debe hacer el control de calidad apropiado. Este se
tomopatgeno no logra crecer completamente en el inicia seleccionando adecuadamente los materiales,
sustrato y se forma una masa suave, y pueden apare- principalmente cajas con cultivos puros que presentan
cer en el sustrato manchas de color rojo, cremas y/o buen crecimiento de conidias, libres de contaminantes
amarillentos. Adems las bacterias presentan un olor de hongos y bacterias.
fuerte y desagradable. Los hongos contaminantes pre- Durante el proceso de incubacin,la matriz se re-
sentan un olor caracterstico a fermentacin fuerte, el visa diariamente a partir del tercer da despus de la

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inoculacin, para detectar la presencia de contami- buen crecimiento, buena esporulacin y buen vigor. El
nantes, principalmente bacterias. Si el crecimiento del proceso del control de calidad se efecta entre 5 y 6
hongo es lento y no uniforme o el sustrato adquiere das despus de la preservacin,con el objetivo de de-
una consistencia blanda,ocurre una coloracin amari- terminar el estado del cultivo. Si ste se encuentra en
llenta, ya sea focalizada o generalizada, entonces se mal estado, es necesario descartar todo el material
debe descartar la matriz y esterilizarla para destruir el preservado. Se siembran cristales de slica gel en un
inculo contaminante. medio de cultivo con el propsito de observar el tipo
Control de calidad de la bolsa. Los problemas de con- de crecimiento del entomopatgeno y detectar la pre-
taminacin en bolsa son similares a los que ocurren en sencia de contaminantes (bacterias y hongos).
matriz, pero se pueden presentar con mayor frecuen- Procedimiento para el control de calidad
cia, debido a problemas de humedad o problemas en 1. Anotar en un registro algunas caractersticas de co-
la inoculacin. Durante la fase de bolsa se debe reali- loracin de los cristales de slica gel, si contiene hu-
zar un control sistemtico para evitar problemas de medad, tubo muestreado, la fecha de preservacin
contaminacin y seleccionar adecuadamente el mate- anterior, etc.
rial. Este control se realiza mediante la observacin 2. De los tubos preservados se toman de 10 a 15 cris-
del crecimiento, el cual puede ser de varios tipos: Dis- tales de slica gel y se siembran en 2 a 3 cajas de Pe-
parejo: crecimiento focalizado sobre diferentes pun- tri con PDA.
tos del sustrato, el material debe ser descartado por 3. A las cajas de Petri se les coloca una etiqueta que
completo del lote en produccin. Este tipo de creci- lleva la informacin: la fecha del da del control de
miento puede deberse a la presencia de contaminan- calidad, el cdigo de la cepa, la fecha de preserva-
tes y/o a una mala manipulacin durante la inocula- cin y nmero de la caja.
cin. Lento: este tipo de crecimiento puede ser 4. Posteriormente las cajas son colocadas en una incu-
focalizado o parejo. Puede estar asociado a una mala badora o se dejan a temperatura ambiente.
agitacin del sustrato despus de efectuada la inocula- 5. Las cajas deben ser revisados tres das despus de la
cin, factores ambientales, estado de la cepa, presen- inoculacin para observar el tipo de crecimiento. El
cia de contaminantes o calidad del inculo. Homog- crecimiento del hongo debe ser caracterstico del
neo. Este es el criterio apropiado para la seleccin de aislamiento preservado.
la bolsa que entrar en produccin. Este crecimiento
presenta las caractersticas de ser uniforme sobre todo Literatura consultada
el sustrato de arroz y adems es rpido. Alves, SB. 1986. Controle microbiano de insectos. Sao Pablo,
Control de calidad del producto cosechado. El con- Brasil,Editora Manole. 407 p.
Badilla, F. Potencial del control biolgico en el manejo de pla-
trol de calidad del producto cosechado se realiza me- gas agrcolas y forestales. Sin publicar.
diante la evaluacin de rendimiento en nmero de co- Campbell, R. 1989. Biological control of microbial plant
nidias por gramo de polvo cosechado y la viabilidad pathogen.Cambridge University Press. 199 p.
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Biological Techniques Series. Academic Press. California,
dera de calidad aquel rendimiento que no sea inferior USA.408 p.
al rendimiento promedio de la cepa y que la viabilidad Leucona, RE. 1995. Microorganismos Patgenos Empleados
no sea menor al 95%. Si una cepa presenta un rendi- en el Control Microbiano de insectos Plaga.Argentina 338
miento muy bajo no debe utilizarse porque su rentabi- p.
Roberts DW. 1989. World Picture of biological control of
lidad sera muy baja. Cuando el rendimiento es muy insects by fungi. Inst. Oswaldo Cruz, Ro de Janeiro p.89-
bajo se debe a que la cepa es muy vieja y ha ido per- 100.
diendo sus caractersticas, por lo que se recomienda Rogg, HW. 1998. Gua Prctica de Produccin Masiva del
reactivarla en el insecto hospedante. Las evaluaciones Entomopatgeno Beauveria bassiana para el Control
Biolgico de Insectos Plaga y Vectores en Bolivia.
de rendimiento (conidias por gramo de polvo) se de- Universidad Autnoma "Gabriel Ren Moreno" Instituto
ben realizar al momento de la cosecha y antes de la de Investigaciones Agrcolas "El Vallecito" Bolivia.36 p.
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control de calidad del material preservado se inicia Hongos Entomopatgenos para el control de plagas agrco-
con la seleccin adecuada del cultivo puro, el cual de- las. Managua,Nicaragua.En prensa.49 p.
be ser reciente y debe presentar caractersticas de

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