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    11 Guia para Practicas de Laboratorio DCVA ACTUAL

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    Esteban Garces
    Este documento presenta las instrucciones para establecer suspensiones celulares vegetales. Incluye introducir trozos de callo en medios líquidos para iniciar las suspensiones, mantenerlas en agitación, y evaluar su crecimiento mediante métodos como el número de células, peso fresco y turbidez. El objetivo es inducir la multiplicación celular usando fitohormonas para acelerar el proceso, realizando la práctica con estricta asepsia para prevenir contaminaciones.

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    Esteban Garces
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    Este documento presenta las instrucciones para establecer suspensiones celulares vegetales. Incluye introducir trozos de callo en medios líquidos para iniciar las suspensiones, mantenerlas en agitación, y evaluar su crecimiento mediante métodos como el número de células, peso fresco y turbidez. El objetivo es inducir la multiplicación celular usando fitohormonas para acelerar el proceso, realizando la práctica con estricta asepsia para prevenir contaminaciones.

    Descripción original:

    Cultivo Tejidos

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    11 Guia Para Practicas de Laboratorio DCVA ACTUAL

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    Este documento presenta las instrucciones para establecer suspensiones celulares vegetales. Incluye introducir trozos de callo en medios líquidos para iniciar las suspensiones, mantenerlas en agitación, y evaluar su crecimiento mediante métodos como el número de células, peso fresco y turbidez. El objetivo es inducir la multiplicación celular usando fitohormonas para acelerar el proceso, realizando la práctica con estricta asepsia para prevenir contaminaciones.

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    CDIGO: SGC.DI.

    505
    GUIA PARA LAS PRCTICAS DE VERSIN: 2.0
    FECHA ULTIMA REVISIN:
    LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

    Departamento de Ciencias de
    DEPARTAMENTO: CARRERA: Ingeniera en Biotecnologa
    la Vida y la Agricultura
    PERODO
    ASIGNATURA: Cultivo de Tejidos Vegetales Abril Agosto 2017 NIVEL: 6to
    LECTIVO:
    DOCENTE: Ing. Cristian Pea M.Sc. NRC: 2592 - 2605 PRCTICA N: 11

    LABORATORIO DONDE SE DESARROLLAR LA PRCTICA Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales


    TEMA DE LA
    Establecimiento de suspensiones celulares
    PRCTICA:
    INTRODUCCIN:

    Los cultivos de clulas y tejidos vegetales representa el conjunto de tcnicas usadas para el crecimiento de clulas, tejidos u rganos
    vegetales in vitro, bajo condiciones aspticas, controladas y libres de microorganismos. Se basa en la totipotencia, es decir la
    capacidad de una clula vegetal para generar una nueva planta completa (Ferl & Paul, 2000). Las suspensiones celulares consisten
    en clulas libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentes
    mediante el suministro continuo de nutrimentos.
    Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha utilizado el medio MS y el medio B-5 de Gamborg.
    Cabe destacar que, en ocasiones las clulas en suspensin necesitan de suplementos orgnicos, aminocidos, Carbohidratos,
    extracto de levadura y Agua de Coco, la auxina ms utilizada es el 2-4 D.
    Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante la incubacin de trozos de callos friables en medios lquidos que estn
    en movimiento continuo. Continuamente se emplean frascos Erlenmeyer, en los cuales se deposita el medio lquido con los trozos
    de calos dispersos en l, hasta llenar aproximadamente 1/5 de la capacidad de los frascos, stos se ponen a incubar en un agitador
    giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua y a 25C.
    Para mantener las suspensiones celulares se pueden usar diferentes sistemas de cultivo, los cuales se pueden clasificar bsicamente
    en tres tipos: cerrados, continuo cerrados y abiertos.
    Cabe destacar que hay numerosos mtodos para determinar el crecimiento de las suspensiones celulares. Los ms utilizados son:
    Nmero de clulas
    Volumen celular
    Peso fresco
    Peso seco
    Turbidez
    ndice mittico
    En cuanto a las aplicaciones de suspensiones celulares, constituyen una tcnica muy valiosa, particularmente en:
    En estudios sobre el ciclo celular
    Estudios fisiolgicos y bioqumicos
    Formacin de metabolitos secundarios y aislamiento de mutantes
    Embriognesis somtica.

    OBJETIVOS:
    Inducir a la multiplicacin de clulas utilizando suspensiones celulares con el fin de acelerar el proceso.
    Evaluar el uso de fitohormonas para la multiplicacin de clulas utilizando suspensiones celulares.

    MATERIALES:
    REACTIVOS: INSUMOS:
    Agua estril
    2 frascos de medio lquido por estudiante de medio
    Papel toalla estril
    MS enriquecido con: 2.5mg/L de 2,4-D y 40g/L de
    Camisetas estriles
    azcar (no usar agar)
    Mechero
    Alcohol al 90%
    Mango y bistur
    Sabln diluido
    Pinzas estriles
    CDIGO: SGC.DI.505
    GUIA PARA LAS PRCTICAS DE VERSIN: 2.0
    FECHA ULTIMA REVISIN:
    LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

    EQUIPOS:
    Plancha de agitacin
    Cmara de flujo.
    Estereomicroscpio

    MUESTRA:
    Callos de zanahoria (u otra especie vegetal) sin contaminacin, obtenidos de la prctica 4. Utilizar un explante con
    formacin de callo por persona (suficiente material para dos frascos).

    INSTRUCCIONES:
    Utilice ropa de proteccin: mandil, cabello recogido, zapato cerrado, uas cortas y sin pintar.
    Verifique la disponibilidad de los materiales, equipos y reactivos a usar en la prctica

    ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

    PREPARACIN DE LA SALA DE SIEMBRA (55 minutos)

    1. Antes de iniciar la prctica y despus de terminada se debe desinfectar el piso con Kalipto (10 minutos)
    2. Limpiar las cmaras de siembra con papel toalla estril y alcohol al 90%. (Nunca usar NaClO) (5 minutos)
    3. Introducir en la cmara todo el material a utilizar en la siembra: mecheros de alcohol, juego de pinzas y bistur, papel toalla
    estril, plstico adherente, ligas, botellas de agua estril, vasos de precipitacin vacos (5 minutos)
    4. Prender las lmparas UV de las cabinas de flujo durante (20 minutos).
    5. Apagar el UV y encender el flujo de aire durante (15 minutos).
    6. Para la siembra los estudiantes deben vestir su camiseta o mandil, gorro, mascarilla y zapatones nuevos o estriles.
    7. Todo el material que se introduzca posteriormente a las cabinas de flujo debe ser desinfectado previamente con los
    atomizadores de alcohol al 70%.

    SIEMBRA DEL MATERIAL (10 minutos por persona)

    1. Retirar con mucho cuidado los callos del antiguo medio (un explante con callo por persona), fraccionarlos con ayuda de
    bistur y pinzas, hasta obtener agregados pequeos. Colocar los agregados en dos frascos de medio lquido estril por
    persona.
    2. Al abrir, y antes de sellar el frasco, flamear la boca. Sellar el frasco con 2 capas de plstico para cocina y ligas. Incubar
    sobre un agitador orbital en oscuridad a 80 rpm y evaluar contaminacin y crecimiento una semana despus.

    Se debe flamear las pinzas y bistur cada vez que se utilicen, adems al sacar las manos o brazos del rea de siembra en
    la cabina se deben desinfectar con alcohol al 70% o savln para poderlos introducir nuevamente.

    RESULTADOS OBTENIDOS:

    Evaluar la concentracin de fitoreguladores utilizados para las suspensiones celulares.


    Observar semanalmente la respuesta de las suspensiones celulares evaluando: Luego de la primera semana aumento en
    la densidad de clulas y/o aumento en el tamao de los agregados, contaminacin. (Tomar fotos en el momento de siembra
    y en cada evaluacin realizada)

    CONCLUSIONES:
    El estudiante es capaz de realizar la prctica con total asepsia de tal manera que las clulas sigan en un ambiente libre de
    virus y bacterias
    El estudiante conoce el principio o fundamento terico sobre suspensiones celulares y lo aplica en la ejecucin de esta
    prctica.
    CDIGO: SGC.DI.505
    GUIA PARA LAS PRCTICAS DE VERSIN: 2.0
    FECHA ULTIMA REVISIN:
    LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

    RECOMENDACIONES:
    Es importante proveerse de los materiales y reactivos necesarios para cada una de las prcticas de laboratorio
    Utilizar eficientemente el tiempo dentro de la cmara de flujo, ya que el material a utilizar es un cultivo asptico y
    cualquier tipo de contaminacin encontrada se deber a la manipulacin del usuario.
    FIRMAS

    F: . F: . F:

    Nombre: Ing, Cristian Pea M.Sc. Nombre: Nombre:


    COORDINADOR DE REA DE COORDINADOR/JEFE DE LABORATORIO
    DOCENTE CONOCIMIENTO

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