https://bteduc.com/guias_es/68_Extraccion_de_ADN_(experimento_ambiguo).

pdf

http://cienciasnaturales.iesvegadelturia.es/wp-content/uploads/2016/03/4.-
Extracci%C3%B3n-de-ADN.pdf

https://es.slideshare.net/johnnyocanabegabt/prctica-10-extraccin-de-adn

http://www.monografias.com/trabajos91/informe-experimento-extraccion-adn/informe-
experimento-extraccion-adn.shtml

http://bibmed.ucla.edu.ve/edocs_bmucla/MaterialDidactico/Micro/BioCelular/Practica/extrac
cion_adn.pdf

http://alexamolinavalenzuela.blogspot.mx/2012/03/practica-numero-1-extraccion-y.html

http://genetica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/Laura%20Mart%C3%ADnez%20Mart%
C3%ADn2015_4_19P21_19.pdf

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

https://www.scientificamerican.com/article/find-the-dna-in-a-banana-bring-science-home/

http://leadersk.tripod.com/photo.htm

http://www.biologyjunction.com/extracting_dna.htm

OBJETIVOS

Extraer ADN mediante un procedimiento simple. Las membranas celulares y nucleares de las
células del tomate son disgregadas con detergente, en solución salina, liberando los ácidos
nucleicos que precipitan con el agregado de etanol frío.
Realizar la extracción de ADN de tejidos animales y vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su
composición con sencillas técnicas.
- Observar la estructura fibrilar del ADN.
- Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades qu?mico-f?sicas del ADN

OBJETIVO GENERAL

Extraer DNA y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

Utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto natural.

Observar la estructura del ADN

OBJETIVO GENERAL

Extracción del DNA de tejido vegetal y animal.

Objetivos específicos
Establecer las propiedades básicas del DNA.

Preparar los tejidos vegetal y animal para su extracción.

Observar la estructura fibrilar del DNA macro y microscópicamente.

Reconocer la importancia del DNA como unidad vital de los seres vivos.

Comprender

Describir

Interpretar

Demostrar

Explicar

Obtener

Concluir

Definir

Establecer

Elaborar

Establecer

Valorar

INTRODUCCION

La apreciación de la importancia de la genética para la medicina requiere un conocimiento de

la naturaleza del material hereditario, cómo se almacena en el genoma humano y cómo se
transmite de célula a célula durante la división celular y de generación en generación durante
la reproducción. El genoma humano se compone de grandes cantidades de ácido
desoxirribonucleico (DNA), que contiene en su estructura la información genética necesaria
para especificar todos los aspectos de la embriogénesis, el desarrollo, el crecimiento, el
metabolismo y la reproducción: esencialmente, todos los aspectos que hacen que un ser
humano sea un organismo funcional.

Toda célula nucleada del cuerpo contiene su propia copia del genoma humano, que –según las
últimas estimaciones– posee alrededor de 25.000 genes. Los genes, que por ahora definiremos
simplemente como unidades de información genética están codificados en el DNA, que se
estructura en una serie de orgánulos con forma de bastón denominados cromosomas, que se
localizan a su vez en el núcleo de cada célula. La influencia de los genes y de la genética en los
estados de salud y enfermedad es muy amplia, y sus raíces están en la información codificada
en el DNA del genoma humano. Nuestros conocimientos de la naturaleza y la identidad de los
genes, así como de la composición del genoma humano, han aumentado de manera
exponencial durante los últimos decenios, en un proceso que culminó en 2003 con la
determinación de la secuencia del DNA de la práctica totalidad del genoma humano.
-

En 1953 se produce un hecho trascendental en la historia de la biología, cuando la revista

Nature publicó el trabajo sobre estructura del ADN (ácido desoxiribonucleico) de James D.
Watson y Francis H. C. Crick. Este trabajo dio comienzo a una revolución en el campo de la
biología y marcó el inicio de la biología molecular. Desde entonces y hasta estos días el
conocimiento acerca de los mecanismos moleculares relacionados con la herencia biológica ha
alcanzado un desarrollo insospechado en épocas anteriores.

El conocimiento de la estructura molecular del ADN ha permitido esclarecer los mecanismos

relacionados con la duplicación del ADN, la síntesis de los ARN (ácido ribonucleico) y de las
proteínas, la recombinación genética y la mutagénesis, asi como los complejos mecanismos
que permiten la autorregulación de todos estos procesos. Por si esto fuera poco, a partir de
ese descubrimiento se han desarrollado poderosos procedimientos experimentales que han
rebasado el marco de la genética molecular y han incidido de forma fundamental en el
conocimiento: de la estructura y las funciones celulares; de los procesos del desarrollo
filogenético y ontogenético; de la relación entre el genoma y el ambiente y de las bases
moleculares de las enfermedades.

-En el proceso de comprensión del ADN y sus complicadas funciones, transcurren 199 años
desde que Hooke descubre la célula y Mendel describe las leyes de la herencia, y sólo 45 años
más para que Tschemark, De Vries y Correns redescubran dichas leyes y se reconozca su
revolucionario significado. En adelante, la descripción de enfermedades genéticas y sus
patrones hereditarios cobraron importancia (Egozcue et al., 1987).

Hacia 1953, Watson, Crick y Wilkins postularon la estructura en doble cadena del material
hereditario (ADN), donde se almacena la información genética. A inicios de la década de los
setenta se conocían los fundamentos de la Genética Molecular de procariontes, en especial de
la Escherichia coli y del fago lambda. La secuencia de bases en el ADN de estos
microorganismos es colineal y casi la totalidad codifica para proteínas. El ADN de los distintos
organismos varía en su cantidad y tamaño, y normalmente es mayor mientras más alta es la
escala evolutiva. El ADN humano contiene aproximadamente 3 x 109 pares de bases (pb) y se
estima que existen unos 23000 genes de tamaños diversos entre 1000 y 200000 pb
nitrogenadas (Krebs et al., 2009).

El 90% del ADN está concentrado en el núcleo, el resto corresponde al ADN mitocondrial. El
ADN nuclear es una doble cadena de desoxirribosa, fósforo y bases nitrogenadas, purinas
(adenina, guanina) y pirimidinas (citosina, timina), apareadas en forma de escalera (A-T y G-C),
con una orientación eléctrica antiparalela 5’-3’ y 3’-5’ originada en los enlaces de los carbonos
de la desoxirribosa con el fósforo. La unión AT es de dos enlaces químicos, mientras que la
unión C-G es de tres, lo que confiere al ADN diferentes propiedades citogenéticas. Se conoce
que la eucromatina es funcional y rica en C-G, además, sus triples enlaces dificultan la entrada
de colorantes, por lo que no se tiñe, en cambio la heterocromatina es no funcional, rica en A-T
y se colorea. Esta generalización es aplicable a los cromosomas metafásicos bandeados, en los
cuales las bandas claras o reversas (R) serán eucromatina rica en genes activos y las bandas
obscuras (G o Q) heterocromatina rica en genes inactivos (Alberts et al., 2002).

COMPOSICIÓN
El DNA es una macromolécula de ácido nucleico polimérico constituida por tres tipos de
unidades: un azúcar con cinco carbonos, la desoxirribosa; una base que contiene nitrógeno, y
un grupo fosfato (fi g. 2-2). Las bases son de dos tipos, purinas y pirimidinas. En el DNA hay dos
bases de purina, adenina (A) y guanina (G), y dos bases de pirimidina, timina (T) y citosina (C).
Los nucleótidos están constituidos por una base, un grupo fosfato y un azúcar, y se polimerizan
en cadenas largas de polinucleótidos debido a los enlaces 5’-3’ fosfodiéster que se forman
entre las unidades adyacentes de desoxirribosa (fi g. 2-3). En el genoma humano, estas
cadenas de polinucleótidos (que conforman una doble hélice, fi g. 2-4) están constituidas por
millones de nucleótidos y su tamaño oscila entre aproximadamente 50 (el cromosoma más
pequeño, el 21) y 250 millones de pares de bases (el cromosoma más grande, el 1).

La estructura anatómica del DNA transporta la información química que permite la transmisión
exacta de la información genética desde una célula hasta sus células hijas, y de una generación
a la siguiente. Al mismo tiempo, la estructura primaria del DNA especifi ca las secuencias de
aminoácidos de las cadenas de polipéptidos de las proteínas, tal como se describe en el
capítulo siguiente. El DNA presenta características idóneas que le permiten poseer estas
propiedades.

La confi guración original del DNA, descrita por James Watson y Francis Crick, es la de una
doble hélice (v. fi g. 2-4). Esta estructura helicoidal tiene un cierto parecido con una escalera
en espiral de dirección en el sentido de las agujas del reloj, en la que las dos cadenas de
polinucleótidos siguen direcciones opuestas y se mantienen unidas por los enlaces de
hidrógeno existentes entre los pares de bases: la A de una de las cadenas se une a la T de la
otra, y la G se une a la C. La naturaleza específi ca de la información genética codifi cada en el
genoma humano se corresponde a la secuencia de las bases C, G, A y T existentes en las dos
cadenas de la doble hélice que se disponen en cada uno de los cromosomas, tanto en el núcleo
celular como en las mitocondrias (v. fi g. 2-1). Dada la naturaleza complementaria de las dos
cadenas de DNA, el conocimiento de la secuencia de las bases de nucleótidos existentes en
una de las cadenas permite automáticamente la determinación de la secuencia de las bases
existentes en la otra cadena. La estructura de cadena doble de las moléculas de DNA las
permite llevar a cabo una replicación precisa mediante la separación de las dos cadenas,
seguida por la síntesis de dos nuevas cadenas complementarias, según la secuencia de las
cadenas originales que actúan como una plantilla.

Asimismo, siempre que es necesario, la complementariedad de las bases permite una

reparación efi ciente y correcta de las moléculas de DNA que han sufrido alteraciones.

Para poder estudiar esta molécula con detalle se precisa generalmente su aislamiento de la
célula, y para ello es necesario un conjunto de material e instrumentos de laboratorio
complejos. Lo que este experimento pretende es un acercamiento simple y sencillo a la técnica
de extracción de DNA que se puede realizar en cualquier hogar con materiales de la vida
cotidiana.

Muchos estudios de Biología Molecular comienzan con la extracción de ácidos nucleicos. La

lisis celular libera las moléculas en una fase acuosa que es separada de los restos celulares por
centrifugación. Las proteínas son removidas de la fase acuosa con solventes orgánicos (fenol,
cloroformo). El ADN, que permanece en la fase acuosa, precipita junto al etanol y
posteriormente es purificado y resuspendido en un buffer adecuado.

1. Triturar el tejido para separar las células.

2. Lisis de las membranas celulares con detergente, en una solución salina para liberar los
ácidos nucleicos y las proteínas.

3. Digestión de las proteínas por acción enzimática de proteasas (Opcional).

4. Precipitación con etanol frío. El ADN es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en
presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El
etanol formará una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa.

5. Observación de agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la interfase entre la

solución acuosa y el alcohol. Los agregados moleculares obtenidos son una mezcla de
proporción variable de ácidos nucleicos, proteínas y pectina, un carbohidrato presente en la
lamela intercelular y en la vacuola de las células vegetales.

1º.- La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene que
romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula.
A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los
jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las
rompen.

2º.- La sal evita la unión de las proteínas al ADN.

3º.- Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero
cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el
agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes
celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

Since DNA is the blueprint for life, everything living contains DNA. DNA isolation is one of the
most basic and essential techniques in the study of DNA. The extraction of DNA from cells and
its purification are of primary importance to the field of biotechnology and forensics.
Extraction and purification of DNA are the first steps in the analysis and manipulation of DNA
that allow scientists to detect genetic disorders, produce DNA fingerprints of individuals, and
even create genetically engineered organisms that can produce beneficial products such as
insulin, antibiotics, and hormones.

DNA can be extracted from many types of cells. The first step is to lyse or break open the cell.
This can be done by grinding a piece of tissue in a blender. After the cells have broken open, a
salt solution such as NaCl and a detergent solution containing the compound SDS
(sodiumdodecyl sulfate) is added. These solutions break down and emulsify the fat & proteins
that make up a cell membrane. Finally, ethanol is added because DNA is soluble in water. The
alcohol causes DNA to precipitate, or settle out of the solution, leaving behind all the cellular
components that aren’t soluble in alcohol. The DNA can be spooled (wound) on a stirring rod
and pulled from the solution at this point.

El DNA se encuentra en el interior del núcleo de las células eucariotas rodeado de

proteínas (histonas) que lo mantienen unido y compactado. Para poder aislarlo y

observarlo se deben deshacer la membrana plasmática y la envoltura nuclear y también se

precisa la desnaturalización de las proteínas. A continuación se explicará qué pasos del

procedimiento explicado anteriormente son los encargados de realizar estas funciones y

también se aclarará el por qué de cada paso.

- Trituración del plátano: Incrementar el área superficial del plátano ayuda a hacer la

superfície de la membrana más fácil de disolver y también permite una absorción más

efecitva del calor y de las soluciones que se añadirán.

- Detergente: Las membranas de las células están formadas por dos capas de lípidos

con proteínas transmembrana a través de estas. El detergente ayuda a romper la bicapa de

fosfolípidos de las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear (Imagen 1). Los lípidos

de la membrana se descomponen debido al detergente que deshace las uniones que

mantienen la membrana junta. Cuando el detergente se pone en conacto con los lípidos

éstos se separan de la membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la

del detergente y eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos.

- Baño caliente: Este paso se utiliza para liberar el DNA de sus barreras protectoras.

La incubación se utiliza para acelerar el proceso de rotura de las membranas y para

ayudar a disolver la bicapa de fosfolípidos mediante la desnaturalización de las proteínas

de membrana y rotura de los enlaces que mantienen los fosfolípidos unidos. El calor

“ablanda” la membrana.

- Baño frio: El agua fría ayuda a mantener el DNA intacto durante el proceso de

extracción. El enfriamiento de la solución ayuda a prevenir la desnaturalización que

podría destruir el DNA si se expusiera al calor de manera prolongada (protege el DNA de

enzimas que pueden destruirlo como las DNAasas ya que la refrigeración ralentiza las

reacciones enzimáticas).

- Homogeneización continua: Con este procedimiento conseguimos que la

temperatura (tanto el calor como el frío) actúe sobre todo el contenido del extracto, y no

sólo sobre las partes en contacto con el vaso de precipitados. También se consigue que la

solución detergente pueda actuar sobre todo el triturado de plátano.

- Filtración: Este paso permite separar los restos de los tejidos del plátano y de las

células que hemos roto en los pasos anteriores. Ese maerial no nos interesa y quedará

retenido en el colador (los restos más grandes) o en el filtro (restos más pequeños). El

líquido filtrado que conseguimos es el que contiene el DNA libre de la membrana nuclear.

- Zumo de piña: Las moléculas de DNA están rodeadas de proteínas del tipo

histonas, y para obtener un extracto más puro de DNA es necesario eliminarlas. Para ello

hay que utilizar enzimas proteolíticos. El zumo de piña contiene bromelaína, una enzima

capaz de hidrolizar las proteinas y por tanto capaz de separar el DNA de las histonas

(Imagen 3). Este proceso ayuda a que el DNA se desempaquete y es más fácil su

extracción.

- Alcohol congelado: El DNA es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a

muy baja temperatura hace que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un

precipitado justo entre la capa con etanol líquido y la capa con el extracto. El DNA es el

único componente de la solución que no es soluble en el etanol, y se hace visible porque

las diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al precipitar debido a la acción de

fuerzas físicas. El alcohol es menos denso que el agua del extracto y por eso flota sobre la

capa del extracto.

- Sal en la solución de extracción: La molécula de DNA es soluble en agua y por

tanto invisible, pero si se pone en contacto DNA que haya estado en un medio salado y

alcohol frío el DNA se vuelve insoluble y precipita. Por lo tanto el agua salada ayuda a la

precipitación en el alcohol. La sal también ayuda a separar el DNA de las histonas.

PROCEDIMIENTO

1.- En el vaso de precipitado pequeño echa 3 cucharaditas de detergente lavavajillas.

2.- Añade una cucharada de sal.

3.- Añade 25 mililitros de agua destilada. Es necesario utilizar la pipeta para extraer la cantidad
de agua adecuada 4.- Mantener en un baño de hielo esta disolución. 5.- Corta la zona central
del vegetal elegido en cuadrados. 6.- Tritura los trozos del vegetal (en el vaso de precipitado
grande) con un poco de agua en la batidora (la mezcla de células y agua debe ser opaca),
 accionando 2 veces las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células.
7.- Mezcla en el recipiente grande el triturado celular con la disolución inicial del vaso. 8.- Agita
vigorosamente la mezcla durante al menos 5 minutos, sin formar espuma. 9.- Haz pasar el
líquido obtenido por un colador. 10.- Retira 5 ml. de la mezcla a un tubo de ensayo y añade
con la pipeta 5 mililitros de alcohol enfriado a 0º C. Se debe dejar escurrir lentamente el
alcohol por la cara interna del tubo de ensayo, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará
flotando sobre la mezcla. 11.- Deja reposar durante 5 minutos hasta que se forme una zona
turbia entre las 2 capas. (Mientras esperas este tiempo, puedes ir recogiendo y limpiando
todos los recipientes empleados anteriormente). 12.- Introduce una varilla justo debajo del
alcohol (la zona turbia que queda entre las 2 capas). Remueve la varilla hacia delante y hacia
atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. 13.- Pasado
un minuto, retira la varilla atravesando la capa de alcohol, con lo cual el ADN quedará adherido
a su extremo, con el aspecto de un copo de algodón mojado.

1. Cortar el tomate en trozos pequeños. 2. Colocar los trozos del tomate en una bolsa de
plástico y amasar bien. Si el tomate no estuviera suficientemente maduro o sacara poco jugo,
agregar hasta un volumen equivalente de agua. 3. Agregar la sal gruesa y el detergente a la
masa de tomate. Mezclar bien. 4. Luego de 5 a 10 minutos, filtrar la masa de tomate con un
colador de tela. 5. Distribuir 10 ml del líquido filtrado en cada uno de los tubos de ensayo. 6.
Inclinar levemente el primer tubo y muy despacio dejar escurrir 10 ml de etanol 95% sobre el
líquido. El etanol formará una segunda capa por encima de la solución. 7. Esperar 10 minutos
sin mezclar las capas y observar el ADN que precipita en la interfase de las dos capas y llega
hasta la superficie. 8. Retirar el ADN con una varilla de madera o con una aguja de crochet.

-
1.- Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo
triturado:
 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo.
 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura.
 5 g de bicarbonato sódico.
 5 ml de detergente líquido o champú.
2-. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina
(cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.
3.- Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10
segundos. Y así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente.
4.- Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar
vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del caldo
molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5
minutos y después pipetear el sobrenadante.
5.- Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico
enfriado a 0ºC. Se tiene que dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente,
teniendo éste inclinado. El alcohol va a quedar flotando sobre el tampón.
6- Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el
tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de
mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el
ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado.

-
Macerar el hígado con un poco de agua destilada. * Colocar una pequeña muestra (10 ml) en
un vaso de precipitado y agregarle 10 ml de solución ácida (fijador). Mezclar con el agitador. *
Filtrar la muestra a través de un papel filtro. Desechar el filtrado (sobrenadante). * Recuperar
la muestra (coágulo seco) del papel, pasándola nuevamente al vaso. * Agregar 10 ml de
solución salina (NaCl), mezclar. Poner en baño María durante 3 minutos sin agitación. * Filtrar
decantando la fase líquida. Desechar el coágulo y recuperar el filtrado en el otro tubo de
ensayo. * A la muestra CALIENTE, agregar paulatina y lentamente de 1 a 2 ml de alcohol
absoluto o isopropilico frío. * Observar las hebras de ADN y la interfase que se forma entre el
alcohol agregado y la muestra.

A) Rompimiento de membranas y pared celulares.

Toma una muestra del tejido (5 gr Aprox) que hayas eligido y homogenízalo, es
decir muelelo con el mortero, si el tejido es muy duro, si el tejido es muy duro
licualo en seco.

B) Digestion

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox), en un tubo de eppendorf de 1 ml

y agrégale el Buffer de extracion (Tris- HCL 0.05 M, EDTA, 0,02 M, NaCl 0.35 M,
Urea 7 M) a temperatura de cuarto (500 ul aprox).
Cuando hayas agregado el Buffer de extracción a tu muestra, agítala e incúbala
por 10 minutos con agitación esporádica.

C) Separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agrégale 500 ul. de

Fenol/Cloroformo/Isopropanol frio usa guantes y no inhales los vapores.
Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo,
deja reposar a temperatura ambiente por 5 min.
Extrae la fase acuosa (500 ul.) con una micropipeta, si no se separan las fases
centrifuga a 3000 rpm por 10 min, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.
Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

D) Precipitación de Ácidos nucleicos DNA y RNA

A la fase acuosa que extrae (500 ul), colocala en un tubo de eppendorf limpio
y agrégale 400 ul de etanol (100 %) frio y 75 ul de NaCl 3 M. Mezcla
por inversión, suave y observa como se precipita el DNA.

D) Recuperacion de la pastilla.
Centrifuga tu tubo por 5 min a 3000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.
E) Resuspension.
Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.