UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONIA

FACULTAD DE INGENIERIA Y CIENCIAS

AMBIENTALES
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL

PRÁCTICA DE LABORATORIO N.º 04 y 05

SEMBRÍO EN PLACAS PETRI.

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS.

CURSO : MICROBIOLOGÍA
DOCENTE : ING. DARWIN JOSUÉ ESTACIO ALBORNOZ
ESTUDIANTE : YUMBATO ANGULO RICHARD

CICLO : V

YARINACOCHA_PERU

2018

II. INTRODUCCION
En la práctica, el cual fue dada en el laboratorio de microbiología pudimos
experimentar la manera adecuada de como es que hace un cultivo microbiológico,
para la cual se utilizó una muestra 25 gr de jugo de papaya, a la cual con un proceso
de filtrado se le extrajo 1ml. Mediante el cual se hizo la dilución en tres tubos de
ensayo que contenían pectona ya preparada, teniendo como fin reducir la
concentración.
Alrededor de 15 ml de agar preparado fueron echados en las placas Petri hasta
solidificarse (15-20 minutos).
Paso siguiente con la ayuda de una aza de siembra y un respectivo control de no
haber contaminación se ejecutó los métodos de sembrío (dispersión, econométrico
y estrías), para luego poner las placas ya cultivadas en una estufa por alrededor de
24-48 horas. Ya estando crecidas las bacterias en las placas Petri se procede a su
identificación por los rasgos impresos, y también se procede a identificar las
bacterias mediante tinción, utilizando reactivos como: cristal de violeta, Lugol,
alcohol y safranina para finalmente poder visualizar la forma verdadera de las
bacterias mediante un microscopio
II. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general
 Ejecutar satisfactoriamente el sembrío en placas Petri y el reconocimiento de
bacterias.
1.2. Objetivo especifico

 Lograr hacer el sembrío con distintos tipos de métodos.

 Hacer el empleo de normas de bioseguridad durante el proceso de sembrío.
 Realizar de manera eficiente los cálculos de las dosificaciones a utilizar el
medio de cultivo.
 Identificar el tipo de bacterias encontradas según el tipo de colonias
encontradas.
 Identificar el tipo de bacterias mediante el método de tinción de Gram.

III. MARCO TEÓRICO

3.1. CULTIVO MICROBIOLÓGICO

Un cultivo es un método para la multiplicación de microorganismos, tales como
bacterias, hongos y parásitos. (Cristian Alvares)

3.2. MEDIO DE CULTIVO

Es una solución líquida o gelatinosa que contiene los nutrientes necesarios para el
crecimiento de los microorganismos.

Todos los microorganismos requieren agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno, calcio,

fósforo y hierro como elementos vitales. Los microorganismos exigentes requieren
además factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas y otras
sustancias que no son capaces de sintetizar. (Rosalba Amaya)

3.2.1. CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

 Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los

microorganismos (tales como aminoácidos, carbohidratos, polialcoholes,
vitaminas, minerales).
 Tener un pH que permita un desarrollo óptimo, por lo general las bacterias
patógenas necesitan un pH neutro o ligeramente alcalino (7.0 – 7.4), en cambio
las levaduras y hongos requieren un pH ácido (5.0).
 Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas.
 Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé,
tapones de goma, tapas metálicas o roscas. (Wikipedia)
3.2.2. UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

 Aislamiento de bacterias desde una muestra o material patógeno (secreción

purulenta, orina, órgano, fecas, etc.) o de un alimento (leche, carne, etc.)
 Estudio morfológico de las colonias.
 Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o
cepario).
 Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades
bioquímicas en medios diferenciales.
 Obtención de toxinas o investigación de sus características.
 Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos biológicos
(vacunas, antígenos, bacterinas, toxoides, etc.). (Wikipedia)

3.2.3. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

 Por su consistencia
A. Líquidos
También se llaman caldos de cultivo, no contienen agar y se preparan en matraces
pequeños. (Rosalba Amaya)

B. Semisólidos
Contienen 0.5% de agar y se preparan en matraces pequeños. se utilizan para
estudiar la movilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje de agar, por lo
que no solidifican totalmente a la temperatura ambiente. Ejemplo: Agar MIO, Agar
SIM. (Rosalba Amaya)

C. Sólidos
Contienen de 1.5 a 2% de agar y se preparan en cajas Petri (placa) o en tubos de
ensayo. se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formación de colonias sobre
la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfología de las colonias, lo
que no permiten los medios líquidos. Se diferencian porque tienen una sustancia de
sostén, que puede ser agar-agar. - Ejemplo: Agar Común, Agar SS, Agar Cerebro
Corazón, Agar Saboureaud, etc. (Wikipedia)
  Por su composición
A. Definido
Se conoce su composición exacta, se utiliza cuando ya se conocen los
microorganismos que se van a cultivar. (Rosalba Amaya)

B. Complejo
No se conoce su composición, pueden tener sangre, leche, extracto de levadura o
carne; se utiliza cuando no se conocen a los microorganismos o no se conocen sus
requerimientos nutricionales. (Rosalba Amaya)

C. Mínimo
Un medio mínimo en microbiología es un medio de cultivo que contiene los
nutrientes mínimos indispensables para el crecimiento de una colonia, por lo general
sin la presencia de aminoácidos, y son a menudo utilizados por los microbiólogos y
genetistas para cultivar microorganismos de tipo salvaje. (Wikipedia)

 Por su función
A. Selectivos
Promueve o inhibe el crecimiento de los microorganismos. Un medio selectivo es
un medio de cultivo en el que sólo puede crecer un tipo de microorganismo (hongos,
bacterias entéricas, protozoos). Un ejemplo de medio selectivo sería usar
un medio rico en un antibiótico, como la ampicilina, para permitir únicamente el
crecimiento de las bacterias resistentes a éste. (Wikipedia)

B. Diferenciales
Permiten distinguir entre diferentes tipos de microorganismos. Un medio
diferencial consiste en un medio de cultivo que es capaz de distinguir dos
microorganismos por su crecimiento diferencial en el mismo, usando las
propiedades metabólicas de ambos en presencia de un determinado nutriente y de
un indicador que evidencia, por ejemplo, un pH ácido en su entorno. (Wikipedia)

C. De Enriquecimiento
Contiene factores de crecimiento, un nutriente esencial que el microorganismo no
puede sintetizar. (Rosalba Amaya)
3.3. AGAR
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios
de cultivo. (Wikipedia)

3.3.1. Agar Nutritivo

El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para
todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativamente
altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas.

En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una

sustancia espesa, con colonias difícilmente observables. (Wikipedia)

3.3.2. Peptona
Son polipéptidos formados durante la degradación enzimática de las proteínas,
además son la principal fuente de nitrógeno en el medio orgánico para el cultivo de
bacterias, Para uso en laboratorio, la peptona se presenta como un polvo amorfo, o
bien como escamas o masas irregulares, esponjosas, de color blanco amarillento o
amarillo parduzco; con olor característico que recuerda al de la carne asada; de
sabor amargo (peptona pancreática) o amargo y salado (peptona pépsica). Es muy
higroscópica y por tanto se altera con facilidad en contacto con aire húmedo.
(Ricardo Tatto)

La aplicación principal de las peptonas, extractos y otras materias primas es la

producción de medios de cultivo ya sean deshidratados, líquidos o medios sólidos.
(Ricardo Tatto)

3.4. TINCIÓN DE GRAM

La tinción de Gram es una técnica diferencial comúnmente empleada en el
diagnóstico microbiológico, fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884.

La mayor parte de las muestras sometidas a examen cuando se sospecha infección

bacteriana deben ser extendidas en frotis sobre laminillas de vidrio, teñidas y
examinadas en el microscopio. Los reactivos empleados en la tinción de Gram son
el cristal violeta (colorante básico), Lugol (mordiente), alcohol cetona (decolorante)
y safranina (colorante de contraste).
 El cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared celular bacteriana,
con ayuda del mordiente (Lugol) que refuerza la unión del colorante. (Francisco
Aguilar).

En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que

NO se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color
rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas". (Universidad Nacional del
Santo)

3.4.1. Bacterias Gram positivas

Las bacterias Gram positivas, debido a la estructura y composición bioquímica de
su pared celular retienen el complejo cristal violeta-Lugol y aun después del
tratamiento con el decolorante conserva el colorante básico, por lo que se observan
de color púrpura o violeta al microscopio. (Francisco Aguilar)

3.4.2. Bacterias Gram negativas

Las bacterias Gram negativas pierden el colorante básico cuando son tratadas con
el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipídico de la pared
celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la pérdida
del complejo cristal violeta-Lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el
colorante de contraste, razón por la cual estas bacterias se observan de color rojo
al microscopio. (Francisco Aguilar)

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos

Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis (Neisseria
meningitis) y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos
Gram-negativos incluyen un gran número de especies. ". (Universidad Nacional
del Santo)

IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

4.1. MATERIALES
 Espátula  3 pipetas
 Matraz de Erlenmeyer  4 tubos de ensayos
 Vaso de precipitado  Portaobjetos
 Embudo  Plumón indeleble
 Papel filtro  3 placas Petri
  Probeta  Aza de siembra
 Algodón  Rejilla metálica
 Luna de reloj  Bombilla de goma

4.2. EQUIPOS
 Cocina eléctrica  Estufa
 Autoclave  Mechero
 microscopio

4.3. REACTIVOS
 Peptona  Lugol
 Alcohol  Cristal de violeta
 Agar nutritivo  Agua
 Safranina  Jugo de papaya
 Alcohol acido

V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1. SEMBRÍO EN PLACAS PETRI

En una bolsa ciplox se tuvo una muestra de 25 gr de jugo de papaya, la cual con la
ayuda de un embudo y un papel filtro se logró tomar la parte mas liquida de la
muestra.

Usamos una balanza analítica y una luna de reloj para pesar 0.03 gr de peptona, la
cual fue mesclada con 30 ml de agua (homogenizado en un matraz de Erlenmeyer)
se puso un tapón de algodón en la boquilla y se cubrío herméticamente con papel
aluminio para que reciba un choque de temperatura con el mechero, hasta llegar a
un punto de ebullición.

Usamos del mismo modo una balanza analítica y una luna de reloj para pesar 1.428
gr de agar nutritivo el cual fue mesclado con 51 ml de agua (en un matraz de
Erlenmeyer).se puso un tapón de algodón en la boquilla, se cubrió herméticamente
con papel aluminio, para de esa manera pasar por el mechero hasta una
temperatura de ebullición.
Luego de haber hervido tanto el agar como la peptona, se pasó a autoclavarla a una
temperatura de 121°c por 45 minutos.

La peptona ya auto clavada se trasvasó con una pipeta en tres tubos de ensayos
que contuvieron 9ml cada uno.

Y del líquido filtrado de la papaya se tomó 1 ml y se procedió a hacer las diluciones.

Para el primer tubo se añadió 1 ml de la muestra (10-1), en la segunda se trasvasó
del primer tubo un 1ml de contenido hacia el segundo tubo y se homogenizó (10-2),
del segundo tubo se trasvasó un 1ml de contenido hacia el tercer tubo y se
homogenizó (10-3). (cabe resaltar que para cada dilución debemos mantener los
tubos de ensayo bien cerradas con algodón, tanto antes como después de las
diluciones)

Para el agar ya auto clavado se trasvasó directamente un aproximado de 15 ml a

cada placa Petri (3 placas Petri) y se cerró rápidamente para evitar la contaminación,
se espera alrededor de 15-20 minutos hasta que el agar se solidifique.

Se tomó una aza de siembra según método de sembrío, y con la ayuda constante
de un mechero de vidrio se lo esterilizó y se sumergió a la dilución 10-1, se sacó
rápidamente y se aplicó el método de dispersión. Este proceso se repitió haciéndose
un total de tres métodos (dispersión (10-1), estrías (10-2) y econométrico (10-3) ).

Finalmente se dejo las placas Petri ya sembradas en una estufa, la cual fue
programada a una temperatura de 37°C y fue dejada por 24-48 horas para el
respectivo crecimiento de las bacterias.

5.2. IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS EN PLACAS PETRI

Ya dejadas 24 horas por lo menos, se revisó la estufa para detectar si se obtuvo el
crecimiento de las bacterias.

Y en las cuales se pudo ver en las placas que había un cierto grado de
sobrepoblación (por efectos de contaminación). Además, se notó unos cúmulos que
se formaban, las cuales tenían una forma notoria a simple vista, para la cual se opto
por identificar a que tipo de bacterias pertenecían dichas colonias de acuerdo a la
morfología de formación que estas presentaron.
 5.3. IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS MEDIANTE TINCIÓN DE GRAM
Con la ayuda de un aza de siembra estéril (con un mechero), se sacó una pequeña
muestra de una colonia encontrada en las placas Petri, y se la puso en un
portaobjeto.

Se añadió dos gotas de cristal de violeta, se espero de 30 segundos a 1 minuto, se

lavó con agua y se secó con el mechero a 30-40 cm de distancia.

Se añadió 2 gotas de Lugol, se espero de 30 segundos a 1 minuto, se lavó con agua

y se secó con el mechero a 30-40 cm de distancia.

Se añadió Se añadió 2 gotas de alcohol acido, se esperó de 30 segundos a 1 minuto,

se lavó con agua y se secó con el mechero a 30-40 cm de distancia.

Se añadió dos gotas de safranina se esperó de 30 segundos a 1 minuto, se lavó con

agua y se secó con el mechero a 30-40 cm de distancia.

Se visualizo en el microscopio.

VI. RESULTADOS

 De las diluciones en tubos de ensayo

MUESTRA DILUCIÓN CARACTERÍSTICA OBTENIDA

(10-1 ) Concentración con alta turbidez

papaya (10-2 ) Concentración turbidez leve

(10-3 ) Concentración clara casi transparente

 De los métodos de sembríos aplicados en placas Petri

MUESTRA DILUCIÓN MÉTODO CARACTERÍSTICA

Crecimiento desordenado con

(10-1 ) Dispersión
poca sobrepoblación

Crecimiento desordenado con

papaya (10-2 ) Estrías
poca sobrepoblación

Crecimiento desordenado con

(10-3 ) econométrico
colonias dispersas.
  De las colonias encontradas

N° CARACTERÍST.
DILUCIÓN MÉTODO BACTERIA
COLONIAS

Staphylococcus Circular, entero,

(10-1 ) Dispersión 2
aureus plano, blanquecino.

Staphylococcus Circular, entero,

(10-2 ) Estrías 3
aureus plano, blanquecino

Planas,
blanquecinas, forma
(10-3 ) Econométrico 5 Bacillus sp
irregular, bordes
lobulados

 De la tinción de Gram

BACTERIAS POR TINCIÓN

GRAM
N° COLORACIÓN TIPO AGRUPACIÓN
POSITIVA

1 Violeta Coco Estafilococo X

2 Violeta Coco Streptococo X
3 Violeta Coco Coco X

VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

SEGÚN (MICROBITOS BLOG), Algunas cepas de S. aureus pueden producir un

pigmento carotenoide que les da un color amarillo, el color es más evidente
en agares nutritivos como agar sangre, agar chocolate, Agar infusión cerebro
corazón, agar nutritivo, entre otros.

 De acuerdo a la práctica, Podemos constatar o afirmar que en el agar nutritivo

según la forma de colonias encontradas logramos encontrar s. aureus.

SEGÚN (MICROBITOS BLOG), s. Aureus presentan Colonias medianas,

convexas, de color blanco, forma circular, bordes redondeados.

 En la práctica realizada obtuvimos rasgos visuales coloniales que nos

permitieron identificar el tipo de bacteria. En este caso se encontró s. aureus. El
cual tuvo formas que concuerdan como por ejemplo el borde: redondeado, entre
otras.
SEGÚN (MICROBITOS BLOG), Basillus sp presentan Colonias Grandes,
planas, blanquecinas, forma irregular, bordes lobulados, dan la apariencia de estar
secas, también se observa una protuberancia en el centro de las colonias lo cual les
da una apariencia de huevo estrellado.

 En la práctica pudimos encontrar bacillus sp. con los rasgos característicos de

la información encontrada, como por ejemplo la colonia percibida en la placa
Petri tenia una forma irregular, bordes lobulados, entre otros

SEGÚN (ARIANITA AYÓN), Las colonias son masas visibles de células que se
forman por división de una o varias células. El desarrollo de colonias sobre
superficies de agar permite identificar las bacterias porque las especies forman a
menudo colonias con una forma y aspecto característico.
 Efectivamente en nuestra practica pudimos encontrar distintas colonias, lo que
nos da un mayor sostén para afirmar que las bacterias a menudo forman
colonias identificables.

SEGÚN (MICROBITOS BLOG), Son cocos Gram positivos, se observa asociación

en racimos irregulares (similar aún racimo de uvas), carecen de flagelos, no
producen esporas y rara vez pueden tener cápsula.

 Por identificación de bacterias con el método de tinción de gram, visualizamos

microscópicamente cocos formados como racimos de uvas, por lo que
afirmamos que se trata de la bacteria staphylococos.

SEGÚN (ANABELLE COSTES), Los cocos son células que suelen ser ovaladas
cuando se observan aisladas, cada especie presenta agrupaciones diferentes:
Cocos, Diplococos, Streptococos, Staphylococos.
 Las bacterias que pudimos observar microscópicamente mediante el método de
tinción de Gram, fueron cocos, streptococos, staphylococos. Mas no diplococo.

SEGÚN (BRUNO MARCATTO), Los streptococos son bacterias esféricas Gram

positivas en parejas o cadenas, anaeróbicas facultativas.
 Los streptococos fueron visualizados microscópicamente, además a simple
viste se creería que el tinte de safranina fue el que perseveró, pero al poner una
ampliación de 100x se pudo ver que la bacteria tenia un color violeta claro.

SEGÚN (ATHZIRY CERVANTES), las bacterias Gram positivas permanecen

teñidas por el cristal de violeta, mientras que las bacterias Gram negativas
permanecen teñidas de color por la safranina.
 En las distintas bacterias obtenidas, se pudo visualizar que el color
perseverante fue el del cristal de violeta.
VII. CONCLUSIONES

 Se ejecuto satisfactoriamente el sembrío en placas Petri.

 Se logro el reconocimiento de bacterias.
 Se efectuó los distintos métodos de sembrío
 Se conto los equipos de protección para evitar la contaminación
 Los cálculos de reactivos fueron efectuados de manera adecuada.
 Se logro reconocer el tipo de bacterias presentes en el jugo de papaya.

VIII. RECOMENDACIONES
 Al someter a temperatura tanto el agar como la peptona, se tiene que mover
constantemente para evitar quemar y quebrar el matraz.
 Al realizar el sembrío debemos mantener el mechero prendido y siempre atrás
de la placa para evitar contaminación bacterial.
 Los materiales de vidrio a utilizar deben estar totalmente esterilizadas mediante

IX. BIBLIOGRAFÍA

 ALTAGRACIA DIAZ (2011), Cocos Gram negativos sección 05, slideshare.

 ALTAGRACIA DIAZ (2011), Staphylococos, slideshare.
 BRUNO MALDONADO (2012), Estreptococos, slideshare.
 ATHZIRY CERVANTESS(2013), tinción de bacterias, slideshare.
 https://microdonto.files.wordpress.com/2009/03/morfologia-de-las-colonias-
bacterianas.pdf (Revisado el 06/06/18 a las 6.30 pm)
 ARIANITA AYÓN (2013), Morfología colonial, slideshare.
 http://microbitosblog.com/2011/08/03/staphylococcus-aureus-epidermidis-
saprophyticus/ (Revisado el 06/06/18 a las 6.40 pm)
 http://microbitosblog.com/2010/06/14/morfologia-colonial-bacteriana/
(Revisado el 06/06/18 a las 6.45 pm)
 CHRISTIAN LEON SALGADO(2013), métodos de siembra y aislamiento,
slideshare.
 ROSALBA AMAYA (2010), Medios de cultivo y esterilización, slideshare.
 RICARDO TATTO (2014), peptona, slideshare.

 WIKIPEDIA (2018), Microbiología/Medios de cultivo, Libros libres para un

mundo libre.

 ROSALBA AMAYA (2010), medios de cultivo y esterilización, slideshare

 CRISTIAN ALVARES (2012), cultivo de bacterias; slideshare.
X. ANEXOS

 SEMBRIO EN PLACA PETRI.

AGAR Y PEPTONA UTLIZADA PESADO DE AGAR Y

PEPTONA

CALENTADO DE AGAR Y AUTOCLAVADO DE AGAR Y

PEPTONA PEPTONA

MECHERO UTILIZADO

 METODOS DE SEMBRÍO

SEMBRÍO POR
ESTRÍAS
 SEMBRÍO
ECONOMÉTRICO

SEMBRÍO POR
DISPERSIÓN

 TINCIÓN DE GRAM

PORTAOBJETO

VISION 10 X VISION 100 X