Colina Ra

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA

E.A.P. DE QUÍMICA
Análisis fitoquímico, determinación cualitativa y

cuantitativa de flavonoides y taninos, actividad
antioxidante, antimicrobiana de las hojas de
“Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst” de la
zona de Yucay (Cusco)
TESIS
Para optar el Título Profesional de Químico
AUTOR
Ana Cecilia COLINA RAMOS
ASESOR
Juana HUAMÁN MALLA
Lima - Perú
2016
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS – E.A.P. QUÍMICA

INDICE
I. RESUMEN .....................................................................................................10
II. INTRODUCCIÓN ...........................................................................................11
III. OBJETIVOS ................................................................................................13
3.1. Objetivo General....................................................................................13
3.2. Objetivos Específicos ...........................................................................13
IV. HIPÓTESIS .................................................................................................14
V. PRINCIPIOS TEÓRICOS ..............................................................................15
5.1. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I. M. Johnst .................................15
5.1.1. Descripción Botánica .........................................................................15
5.1.2. Distribución y Hábitat.........................................................................16
5.1.3. Propiedades Medicinales ..................................................................16
5.1.4. Clasificación Botánica .......................................................................17
5.2. Metabolitos Primarios y Secundarios .................................................18
5.2.1. Diferencias con los metabolitos primarios .........................................19
5.2.2. Funciones que cumplen los metabolitos secundarios en las
plantas…............................................................................................19
5.3. Flavonoides............................................................................................20
5.3.1. Clasificación.......................................................................................21
5.3.2. Funciones y Propiedades ..................................................................22
5.3.3. Aplicaciones Terapéuticas de los Flavonoides .................................23
5.3.4. Métodos de separación .....................................................................24
5.3.5. Método de cuantificación de Flavonoides Totales ............................25
5.4. Taninos ...................................................................................................27
5.4.1. Clasificación.......................................................................................27
5.4.1.1. Taninos Hidrolizables ....................................................................27
5.4.1.2. Taninos Condensados ..................................................................28
5.4.2. Funciones y propiedades de los taninos atribuidas en la planta ......28
5.4.3. Usos Industriales ...............................................................................29
5.4.4. Cuantificación de taninos ..................................................................29
5.4.4.1. Método de Lowenthal ....................................................................29

2


5.5. Análisis Fitoquímico .............................................................................30
5.6. Fenoles ...................................................................................................30
5.6.1. Determinación de Fenoles Totales mediante el Método de Folin-
Ciocalteu ............................................................................................30
5.7. Antioxidantes .........................................................................................31
5.7.1. Antioxidante .......................................................................................32
5.7.2. Clasificación de los antioxidantes .....................................................33
5.7.3. Radicales Libres ................................................................................34
5.7.4. Estrés Oxidativo ................................................................................34
5.7.5. Importancia de los antioxidantes para la salud .................................35
5.7.6. Determinación de la Capacidad Antioxidante ...................................36
5.8. Actividad Antimicrobiana .....................................................................37
5.8.1. Metabolitos secundarios con propiedad antimicrobiana ...................37
5.8.1.1. Flavonas ........................................................................................37
5.8.1.2. Isoflavonoides ...............................................................................37
5.8.1.3. Taninos ..........................................................................................37
5.8.1.4. Saponinas .....................................................................................37
5.8.2. Microorganismos utilizados ...............................................................38
5.8.2.1. Candida albicans ...........................................................................38
5.8.2.2. Salmonella enteritidis ....................................................................38
5.8.2.3. Escherichia coli .............................................................................38
5.8.2.4. Staphylococcus aureus .................................................................38
5.8.3. Determinación de la actividad antimicrobiana...................................39
5.9. Espectroscopia de Absorción Atómica ..............................................39
5.9.1. Fundamento.......................................................................................39
5.9.2. Minerales en las plantas ....................................................................40
5.9.2.1. Clasificación de los nutrientes minerales ......................................41
5.9.2.2. Manganeso....................................................................................41
5.9.2.3. Zinc ................................................................................................42
5.9.2.4. Hierro .............................................................................................42
5.9.2.5. Cobre .............................................................................................42
5.9.2.6. Metales pesados en las plantas ....................................................43

3


VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ........................................................45

6.1. Materiales, Equipos y Reactivos .........................................................45
6.2. Procedimiento .......................................................................................46
6.9.1. Recolección y Selección de la muestra ............................................46
6.9.2. Tratamiento de la muestra ................................................................46
6.9.3. Obtención de los Extractos con Polaridad Creciente .......................46
6.9.4. Análisis Fitoquímico de los extractos ................................................47
6.9.4.1. Saponinas .....................................................................................47
6.9.4.1.1. Prueba de espuma ..................................................................47
6.9.4.1.2. Reactivo de Salkowski ............................................................47
6.9.4.1.3. Variante A de la reacción de Salkowski ..................................47
6.9.4.1.4. Variante B de la reacción de Salkowski ..................................48
6.9.4.1.5. Reactivo de Liebermann-Burchard .........................................48
6.9.4.2. Flavonoides ...................................................................................48
6.9.4.2.1. Reactivo de Shinoda ...............................................................48
6.9.4.2.2. Reacción con cloruro férrico ...................................................48
6.9.4.2.3. Reacción con NaOH 20% .......................................................48
6.9.4.3. Taninos ..........................................................................................49
6.9.4.3.1. Reacción con gelatina-cloruro de sodio ..................................49
6.9.4.3.2. Reacción con cloruro Férrico o alumbre férrico ......................49
6.9.4.3.3. Reacción de precipitación con agua de bromo .......................49
6.9.4.3.4. Reacción con formaldehído ....................................................49
6.9.4.3.5. Reacción con acetato de plomo ..............................................50
6.9.4.4. Antocianinas - Betalaínas ............................................................50
6.9.4.4.1. Adición de álcali: NaOH 20% ..................................................50
6.9.4.4.2. Reacidificación: HCl 1N...........................................................50
6.9.4.4.3. Adición de amoniaco ...............................................................50
6.9.4.4.4. Adición de HCl 1N ...................................................................50
6.9.4.4.5. Alcohol isoamílico-agua ..........................................................51
6.9.4.5. Quinonas .......................................................................................51
6.9.4.5.1. Reacción con NaOH al 5%......................................................51

4


6.9.4.5.2. Reacción de Borntrӓnger ........................................................51
6.9.5. Método Espectrofotométrico para la Determinación Cuantitativa de
Flavonoides Totales expresados como Quercetina .........................52
6.9.5.1. Curva de Calibración del Patrón Quercetina ................................52
6.9.5.2. Determinación Cuantitativa de Flavonoides Totales ....................52
6.9.6. Método de Lowenthal para Taninos ..................................................53
6.9.6.1. Solución Estandarizada de Permanganato de Potasio 0.1N........53
6.9.6.2. Contenido de Taninos Totales ......................................................53
6.9.6.3. Contenido de no Taninos ..............................................................53
6.9.7. Fenoles Totales .................................................................................54
6.9.7.1. Curva de Calibración de Contenido de Fenoles Totales ..............54
6.9.8. Capacidad Antioxidante.....................................................................55
6.9.9. Determinación de la Actividad Antimicrobiana ..................................56
6.9.9.1. Obtención de cepas ......................................................................56
6.9.9.2. Medios de cultivo...........................................................................56
6.9.9.3. Determinación de la Actividad Antimicrobiana .............................56
6.9.10. Determinación de Humedad ..............................................................57
6.9.11. Determinación del contenido de ceniza ............................................57
6.9.12. Determinación de Metales mediante Absorción Atómica .................58
VII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................59

7.1. Rendimiento de los Extractos con Solventes de
Polaridad Creciente .............................................................................59
7.2. Análisis Fitoquímico de los Extractos Secos con
Polaridad Creciente .............................................................................60
7.2.1. Saponinas ..........................................................................................60
7.2.2. Flavonoides .......................................................................................61
7.2.3. Taninos ..............................................................................................62
7.2.4. Antocianinas – Betalaínas .................................................................63
7.2.5. Quinonas ...........................................................................................64
7.3. Método Espectrofotométrico para la Determinación Cuantitativa de
Flavonoides Totales expresados como Quercetina ........................66
7.4. Método de Lowenthal para Taninos ....................................................66

5


7.5. Fenoles Totales .....................................................................................67
7.6. Capacidad Antioxidante .......................................................................68
7.7. Determinación de la Actividad Antimicrobiana .................................71
7.8. Determinación del contenido de Humedad y Ceniza ........................75
7.9. Determinación de Metales mediante Absorción Atómica.................75
7.10. TABLA COMPARATIVA ........................................................................76
VIII. CONCLUSIONES .......................................................................................77
IX. RECOMENDACIONES ..............................................................................79
X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS ..............................................................80
XI. ANEXO .......................................................................................................88
11.1. Análisis Estadístico ..............................................................................................
11.1.1. Determinación de Flavonoides Totales .............................................88
11.1.2. Determinación de Taninos por el Método de Lowenthal...................88
11.1.3. Determinación de Fenoles totales .....................................................89
11.1.4. Determinación de la Actividad Antioxidante ......................................90
11.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana...................................90
11.2. Análisis Fitoquímico ............................................................................................
11.2.1. Saponinas ..........................................................................................92
11.2.2. Flavonoides .......................................................................................93
11.2.3. Taninos ..............................................................................................94
11.3. Determinación de Flavonoides Totales ...................................................
11.4. Determinación de la Actividad Antioxidante ..........................................
TABLAS
TABLA 1. Propiedades atribuidas a la Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M.

Johnst ........................................................................................................17
TABLA 2. Diferencias entre los metabolitos primarios y secundarios ........................19
TABLA 3. Valores de absorción para las Banda I y Banda II de los diferentes
tipos de flavonoides ...................................................................................26
TABLA 4. Alimentos antioxidantes y metabolitos secundarios que generan
esta acción .................................................................................................32
TABLA 5. Clasificación de los antioxidantes, según su origen 37 ...............................33
TABLA 6. Clasificación de los elementos esenciales según su concentración
en la planta ...................................................................................................41

6


TABLA 7. Concentración de los macro y micronutrientes expresados en
miligramo por kilogramo o ppm en las plantas ............................................44
TABLA 8. Rendimiento de los extractos con solventes de polaridad creciente .........59
TABLA 9. Ensayos para la determinación cualitativa de saponinas ..........................60
TABLA 10. Ensayos para la determinación cualitativa de flavonoides.......................61
TABLA 11. Ensayos para la determinación cualitativa de taninos .............................62
TABLA 12. Ensayos para la determinación cualitativa de
antocianinas - betalaínas .........................................................................63
TABLA 13. Ensayos para la determinación cualitativa de quinonas ..........................64
TABLA 16. Determinación cuantitativa de flavonoides totales expresados
como quercetina .........................................................................................66
TABLA 17. Determinación cuantitativa de taninos por el método de Lowenthal........67
TABLA 18. Determinación de fenoles totales en el las hojas de Muehlenbeckia
hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst ...................................................................68
TABLA 19. Valores de las absorbancias (nm), concentraciones (µg/mL) y
porcentaje de inhibición (%I) ......................................................................69
TABLA 20. Concentración inhibitoria (IC50) de DPPH en el extracto metanólico .......70
TABLA 21. Valores de los diámetros de los halos (Ǿ) ...............................................72
TABLA 22. Porcentaje de inhibición (%I) del extracto acuoso de las hojas de
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst .........................................72
TABLA 23. Valores del porcentaje de humedad y cenizas en las hojas de
TABLA 24. Concentración en partes por millón (ppm) de los metales presentes en
las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst .....................76
TABLA 25. Fenoles totales y capacidad antioxidante en las hojas de
TABLA 26. Resultados estadísticos para la determinación de
Flavonoides Totales .................................................................................88
TABLA 27. Resultados estadísticos para la determinación de Taninos .....................89
TABLA 28. Resultados estadísticos para la determinación de fenoles totales ..........89
TABLA 29. Resultados estadísticos para la determinación la capacidad
antioxidante ..............................................................................................90
TABLA 30. Resultados estadísticos para la determinación la actividad
antimicrobiana sobre Salmonella enteritidis ...........................................91
TABLA 31. Resultados estadísticos para la determinación la actividad antimicrobiana
sobre Staphylococcus aureus ....................................................................91

7


DEDICATORIA.
Dedico mi tesis de manera muy especial a mis queridos padres y hermano, por
brindarme su apoyo en todo este tiempo; a todas aquellas personas y amigos que
hicieron posible realizar esta investigación y sobre todo a mis queridos tíos Angela
Chafloque Aragón y Juan Carlos Gavancho, quienes me apoyaron en la recolección
y me mostraron las bondades de la naturaleza a través de esta planta.

8


AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, me gustaría agradecer a mis tíos Angela Chafloque Aragón y Juan
Carlos Gavancho, ya que gracias a ellos he conocido e investigado esta planta.
A la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por darme la oportunidad de

estudiar y ser una profesional.
A mi asesora de tesis, Mg. Juana María Huamán Malla por su esfuerzo y dedicación,
quien con sus conocimientos, experiencia y motivación me guió en esta
investigación.
Me gustaría agradecer a mis profesores durante toda mi carrera profesional porque

todos han aportado a mi formación y en especial a mis profesores Quím. Marcos
Guerrero y al Mg. Juan Carlos Woolcott Hurtado por sus consejos, sus enseñanzas y
sobre todo por su amistad.
Así mismo me gustaría agradecer a la directora de la Unidad de Servicios de

Análisis Químicos, María Angélica Rodríguez Best y al Dr. Julio Santiago por el
apoyo en esta investigación y sobre todo por sus concejos y amistad.
Y por último mi compañero de laboratorio y colega Jesús Ochoa por brindarme su

visión crítica y apoyo en esta investigación.
Siempre estaré agradecida con aquellas personas que formaron parte de mi vida
profesional, amigos que me brindaron su apoyo, amistad, consejos y fortaleza
cuando más lo necesitaba; sin importar donde estén quiero darles las gracias por
formar parte de mí y por todo aquello que me han brindado.
Para ellos: Muchas Gracias.

9


I. RESUMEN

La especie Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, es una planta oriunda del
Perú poco estudiada; esta investigación tiene la finalidad de contribuir al
conocimiento fitoquímico y microbiológico de las hojas, debido a que es usada en la
medicina tradicional de los pobladores de la provincia de Urubamba. Se desea
determinar la presencia de metabolitos secundarios como los flavonoides y taninos,
los cuales son compuestos fenólicos que tienen propiedades antioxidantes y
bactericidas.
Esta especie fue recolectada en el distrito de Yucay, provincia de Urubamba en el

departamento del Cusco.
Mediante la determinación de flavonoides totales, se cuantificaron los flavonoides

(1,70 mg de quercetina/g muestra); también se realizó la cuantificación de taninos
por el método de Lowenthal (1,03 mg ácido tánico/100 g de muestra).
Al corroborar la presencia de estos metabolitos secundarios, se llevó a cabo la

determinación de fenoles totales (1,17 mg ácido gálico/100 g de muestra) y
capacidad antioxidante (6,58 µg/mL) en las hojas, esto hace que se le atribuya
propiedades diuréticas y contra la fragilidad capilar entre otras.
Con la finalidad de dar una mayor contribución al conocimiento se realizaron

pruebas para determinar la actividad antimicrobiana sobre las cepas de Escherichia
coli, Candida albicans, Salmonella enteritidis y Staphylococcus aureus. Los
resultados fueron positivos para los dos últimos microorganismos.
Por último se determinó el porcentaje de humedad (64.34 %) y cenizas (3.3 %) en

las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, además de la
determinación de algunos micronutrientes (Hierro, Sodio, Zinc, Manganeso y Cobre)
y comprobando que metales pesados como: plomo y cromo, se encuentran en
proporciones menores a 0,5 ppm.

10


II. INTRODUCCIÓN

Las plantas medicinales constituyen una fuente de metabolitos secundarios, los que
le otorgan sus propiedades terapéuticas características, las cuales son de gran
importancia para el control de muchas enfermedades. Nuestro país, el Perú, cuenta
con una diversidad de flora única en el mundo, la misma que está representada por
más de 25,000 especies existentes aproximadamente, por otro lado 4000 especies
tienen diversos usos en la alimentación, salud, cosmética, tintura, como
aromatizante, saborizantes, insecticidas entre otros usos.1
La Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst es una de las plantas con

excelentes propiedades medicinales, sus hojas y tallos son empleados debido a sus
efectos: antiinflamatorio, analgésica, anestésica además de sus propiedades
cicatrizantes y antioxidantes 2. El nombre común que le dan los pobladores es de
Mullaca, dicha planta crece de forma silvestre en el departamento del Cusco,
exactamente en el Valle Sagrado, se puede encontrar en la carretera hacia
Urubamba y Maras.
A través de artículos se sabe que la Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst

presenta algunos metabolitos secundarios como Taninos, Flavonoides, Saponinas
triterpénicas y esteroidales además de su actividad antioxidante. Sus propiedades
medicinales van de la mano con el tipo de metabolito que presente la planta. 3
Los flavonoides son metabolitos secundarios que denotan un grupo muy amplio de
compuestos polifenólicos caracterizados por una estructura benzo-γ-pirano, los
cuales están distribuidos en el reino vegetal y se encuentran de forma universal en
las plantas vasculares, en forma de glicósidos; es frecuente encontrarlos en las
semillas, raíces, frutos, hojas, tallos y flores.
Los Flavonoides presentan una gran importancia para los seres humanos, ya que
son parte de nuestra dieta y se presentan a través de distintas fuentes; como
ejemplo podemos mencionar el perejil donde encontramos flavonas y flavonoles en
una concentración de 50 mg/100g, en los granos de cebada se encuentran
polímeros de flavanos en una concentración aproximada de 20 mg/100 g, en los
vinos blancos se tiene 50 a 75 mg/L de flavonoides. 4
Entre las diversas actividades que presentan los flavonoides, las que están
adquiriendo más importancia son la citotóxica, quimiopreventiva, mutagénica y
antimutagénica. Los flavonoides también están relacionados con la ecología
cumpliendo diversos roles como en la polinización, estimulantes de la oviposición y
también actuando como defensa contra los microorganismos e insectos. 5; 6

11


Es indudable la importancia que los Taninos han adquirido a través de los años, se
sabe que son metabolitos secundarios polifenólicos presentes en el reino vegetal.
Pueden encontrarse en todas las partes de las plantas: tallos, madera, hojas,
semillas y cúpulas. 7; 8
Los Taninos cumplen la función de protectores, evitando el ataque de insectos y

hongos; es por ello que se les atribuye propiedades fungicidas y bacteriostáticas.
Esta investigación está dirigida a determinar tanto cualitativamente como

cuantitativamente la presencia de Taninos y Flavonoides empleando métodos
volumétricos y espectrofotométricos respectivamente, además de demostrar su
actividad antimicrobiana y capacidad antioxidante, estas determinaciones tienen el
objetivo de demostrar el poder curativo que presenta dicha planta frente a problemas
musculares, actuando como un potente antiinflamatorio y analgésico. Mediante
entrevistas directas con los pobladores del distrito de Yucay, se llegó a conocer el
efecto y la importancia de la Mullaca como medicina natural, la cual es empleada por
pobladores frente a enfermedades como el asma, gingivitis entre otras.
En el Perú la Mullaca es una planta con pocas referencias bibliográficas; sin

embargo Brasil, Chile y Argentina presentan investigaciones, debido a las
propiedades que se le atribuyen.

12


III. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

Realizar un análisis fitoquímico, extracción, purificación y desarrollo de métodos de

valoración de los dos metabolitos secundarios más importantes presentes en la
especie Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, además de verificar su
actividad biológica y capacidad antioxidante.
3.2. Objetivos Específicos

 Clasificación botánica.
 Realizar el Análisis Fitoquímico a la Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M.
Johnst.
 Reconocer los principales metabolitos secundarios.
 Determinación del contenido de humedad de las hojas.
 Determinación del contenido de ceniza en las hojas.
 Determinación del contenido de minerales empleando el equipo de Absorción
Atómica.
 Extracción sucesiva de las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M.
Johnst con solventes de polaridad creciente.
 Desarrollar los métodos de extracción, purificación para taninos y flavonoides
presentes.
 Determinación cuantitativa del contenido de Taninos presentes en las hojas
de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst.
 Determinación cuantitativa del contenido de flavonoides presentes en las
hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst.
 Realizar el análisis antimicrobiano.
 Realizar el análisis antioxidante.
 Determinación de fenoles totales.

13


IV. HIPÓTESIS

La presencia de Flavonoides y Taninos serán los responsables de las propiedades

medicinales de la “Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M.Johnst”. La cantidad de
flavonoides y taninos será considerable debido al uso terapéutico que se le da en las
poblaciones rurales. La cantidad de fenoles totales corresponderán a la capacidad
antioxidante y antimicrobiana encontrada.

14


V. PRINCIPIOS TEÓRICOS
5.1. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I. M. Johnst
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I. M. Johnst es una especie botánica, que

pertenece a la familia Polygonaceae, dicha familia es reconocida en el Perú por
presentar diez géneros y 73 especies. Es conocida popularmente como mullaca,
quilo, mollaca, voqui, voqui negro. Se sabe que la Muehlenbeckia tiene una
distribución amfipacífica, con especies en Nueva Guinea, Australia, Nueva
Zelanda y Sudamérica. En Sudamérica la podemos encontrar en el Perú, Chile y
Argentina.9; 10
5.1.1. Descripción Botánica
Es un arbusto liso, con tallos rojizos, flexuosos de 1 a 2 m de altura. Presenta

hojas alternas, carnosas o coriáceas, pecioladas, lámina de forma variable,
triangulas, oblonga, lanceolada, truncadas o atenuadas en la base; pecíolos
de 0,2-0,5 cm, con un nervio central muy marcado de 1 a 4 cm de longitud.
Inflorescencias: pleiotirsos ramificados axilares o terminales de 3-5 cm,
dispuestas en glomérulos o racimos, cortadamente pecioladas de 1-2 mm de
color blanco, perigonio de 2-3 mm, aquenios triquetros de 3-4 por 2-3,5 cm
con superficie lisa o rugosa. Las masculinas de 2 a 3 mm de diámetro,
verdosas, a veces coloreadas de púrpura; las femeninas de 3 a 4 mm de
diámetro, verdosos o púrpura; la floración se produce desde Agosto a Enero.
El fruto 5 mm de longitud en aquenio, son comestibles. (FIGURA 1).
FIGURA 1. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M. Johnst colectada, Muehlenbeckia

hastulata (J.E.Sm.) I.M.Johnst con flor.

15


5.1.2. Distribución y Hábitat
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst se puede encontrar en el

distrito de Yucay, provincia de Urubamba en el departamento del Cusco,
además de otros departamentos como Arequipa, La Libertad y Pasco a
diferentes altura entre ellas a 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000 msnm.
Generalmente están situadas en valles secos, riberas y laderas rocosas,
además crece en climas templados y fríos (FIGURA 2). 11
FIGURA 2. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M. Johnst Yucay-Urubamba, Cusco.
5.1.3. Propiedades Medicinales
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst no se cultiva ni se ha

domesticado, sólo es recolectada para uso curativo. Las raíces y hojas en
infusión se emplean como diurético, antihemorrágico, sedante, afecciones
hepáticas (ictericia), para el tratamiento del reumatismo, además se le
atribuye propiedades purgativas y como hipotensor. Con respecto a usos
externos es útil para curar heridas y úlceras, debido a su propiedad
astringente. Las raíces presentan un efecto abortivo en los humanos y
animales debido a su motilidad uterina (TABLA 1). 12

16


TABLA 1. Propiedades atribuidas a la Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M.
Johnst 67
Propiedad Especificaciones
Fragilidad capilar Esta especie presenta una
concentración alta de rutina.
Laxante La infusión de la raíz tiene acción
laxante.
Teñido de lana Tiñe de anaranjado la lana mordentada
con sulfato de aluminio.
5.1.4. Clasificación Botánica
De acuerdo a la Clasificación de James Edward Smith e Ivan Murray

Johnston y examinada por el Departamento Académico de Botánica, de la
Facultad de Ciencias Biológicas:
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Caryophyllales
Familia Polygonaceae
Género Muehlenbeckia
Especie hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst.

17


FIGURA 2. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M. Johnst
5.2. Metabolitos Primarios y Secundarios

Cualquier organismo viviente contiene en su estructura productos químicos, en

su mayoría orgánicos. Estos compuestos químicos son el resultado de la
actividad metabólica, por ello es frecuente denominarlos metabolitos.13
Los compuestos orgánicos que se encuentran en los organismos vivos se

pueden dividir en dos tipos principales: primarios y secundarios. Los metabolitos
primarios son los más abundantes y se denominan así por formar parte de la
base fundamental de los procesos vitales, ya que intervienen en la
supervivencia, crecimiento y reproducción de las plantas; siendo parte de ellos,
las proteínas, los ácidos nucleídos y los tipos más frecuentes de carbohidratos y
lípidos. Por el contrario los metabolitos secundarios se dan de manera
restringida, generalmente en pequeñas cantidades, a diferencia de los
metabolitos primarios, la ausencia de algún metabolito secundario no le impide la
supervivencia siendo no esenciales para la vida como tal, aunque ello no
excluye la posibilidad de que puedan ser de utilidad para el organismo particular
que lo produce.13

18


5.2.1. Diferencias con los metabolitos primarios

Mediante la siguiente tabla presento las diferencias que existe entre los
metabolitos primarios y secundarios (TABLA 2).
TABLA 2. Diferencias entre los metabolitos primarios y secundarios

METABOLITOS PRIMARIOS METABOLITOS SECUNDARIOS

Productos del metabolismo Productos del metabolismo
general especial
Ampliamente distribuido en Biosintetizados a partir del

plantas y animales metabolismo primario
Distribución taxonómica no Distribución taxonómica

restringida restringida
Indispensables para la vida No indispensables para la vida
Aminoácidos de proteínas, Saponinas, Alcaloides, Taninos,

monosacáridos, lípidos, Flavonoides, entre otros.
glucósidos, entre otros.
5.2.2. Funciones que cumplen los metabolitos secundarios en las plantas
Las plantas al igual que los animales, las algas, los hongos y las bacterias,
realizan funciones fisiológicas en las que están implicadas rutas
metabólicas. Estas funciones son fundamentales para que estos
organismos se mantengan con vida; las plantas son poseedoras casi
exclusivas de otras rutas metabólicas por las que sintetizan una variedad de
sustancias llamadas metabolitos secundarios. 14
Todas las sustancias que el hombre ha obtenido a partir de las plantas y a

empleado para diferentes fines son productos del metabolismo secundario,
por ejemplo a través de los taninos los hombres curtieron pieles de animales
que luego utilizaron para cubrirse, los flavonoides otorgan propiedades
antioxidantes combatiendo el estrés oxidativo y son los aceites esenciales
metabolitos secundarios que dan el aroma a las flores. 14

19


Estos metabolitos cumplen funciones importantes en las plantas, como es
el mecanismo de defensa contra microorganismos patógenos e insectos
para una contención rápida frente a algún daño ya sea local o en sitios
lejanos al daño, esto es conocido como la respuesta sistemática. Otra de las
funciones es la interacción entre las plantas cuando se presentan fenómenos
de alelopatía, finalmente son responsables de los diversos colores de las
flores, así como también facilitar la polinización. 15
5.3. Flavonoides

Los flavonoides forman parte de una clase muy abundante de productos

naturales presentes en las plantas superiores, así también en helechos, pero no
en hongos, mohos ni bacterias. Químicamente, estas sustancias son de
naturaleza fenólica y se caracterizan por poseer dos anillos aromáticos
bencénicos unidos por un puente de tres átomos de carbono, con la estructura
general C6-C3-C6, los cuales pueden o no formar un tercer anillo.16
Los anillos son denominados A, B y C; los átomos de carbono individuales son

referidos por un sistema numérico, el cual emplea números ordinarios para los
anillos A y C y números primos para el anillo B (FIGURA 3). 1
Los flavonoides suelen presentar al menos tres hidroxilos fenólicos y se

encuentran generalmente combinados con azúcares en forma de glicósidos,
aunque también se presentan como agliconas libres. 1
8 1
2'
9 O 2 1'
7 3'
A C B
3 6' 4'
6 10
5 4 5'
O
FIGURA 3. Estructura básica del esqueleto flavonólico

20


5.3.1. Clasificación

Varios subgrupos de flavonoides son clasificados de acuerdo con la

sustitución del anillo C. En esta clasificación es importante el estado de
oxidación del anillo heterocíclico y la posición del anillo B (FIGURA 4).
Los tipos de flavonoides están relacionados por una ruta biosintética común,
la que incorpora precursores de las rutas del shiquimato y la de acetato-
malonato. Posteriores modificaciones ocurren en varios estados, lo que
resulta en la extensión de la hidroxilación, metilación, isoprenilación,
dimerización y glicosilación, produciendo O y C-glicósidos. La glicosilación
de los flavonoides produce que sean menos reactivos y más solubles en
agua. El azúcar que generalmente está presente en los flavonoides es la
glucosa, aunque también se puede encontrar galactosa, ramnosa y xilosa.
En el caso de los flavonoides C-glicósidos, los azucares pueden unirse al
núcleo bencénico del flavonoide por enlaces carbono-carbono, con la
diferencia de que el ataque se realiza sólo a las posiciones 6 y 8 del núcleo
del flavonoide. 1

FLAVONAS AURONAS

FLAVONOL
ANTOCIANIDINA

FLAVANONA LEUCOANTOCIANIDINA

21


FLAVANANOL CHALCONA

ISOFLAVONA
FIGURA 4. Estructura central del esqueleto flavonólico de los principales

subgrupos de flavonoides.
5.3.2. Funciones y Propiedades
Las propiedades físicas dependen de la clase y la forma del flavonoide (libre,

glicósido o sulfatado). Las flavonas, flavonoles y auronas, debido al sistema
conjugado son compuestos sólidos con colores que comprenden desde el
amarillo muy tenue hasta el rojo. Las antocianidinas son de colores rojo
intenso, morado, violeta y azul. Las flavanonas y flavanoles debido al
carbono quiral C-2 presentan el fenómeno de la rotación óptica. Los
glicósidos son en general sólidos amorfos, mientras que las agliconas y los
altamente metoxilados son cristalinos.17
La solubilidad depende de la forma en que se encuentra y el número y clase

de sustituyentes presentes. Los glicósidos, las antocianidinas y los sulfatos
son solubles en agua y alcohol. La agliconas flavonoides altamente
hidroxiladas son solubles en etanol, metanol y n-butanol, mientras que las
poco hidroxiladas lo son en solventes como éter etílico, acetato de etilo y
acetona. Las agliconas altamente metoxilados son solubles en solventes
menos polares como el éter de petróleo y el cloroformo. 17

22


Las funciones de los flavonoides en las plantas se pueden resumir en tres

grupos: papel de defensa frente a agentes agresores externos como es la
radiación UV, bacterias, hongos, insectos y frente a otros plantas; como
señal química o marcadores florales que sirven para guiar a las abejas y
otros insectos polinizadores hacia el néctar, facilitando la polinización
además de estimuladores de la oviposición; finalmente presentan su efecto
sobre las enzimas. Recientemente se ha demostrado el efecto de algunos
flavonoides en la inhibición de infecciones de origen viral en las plantas,
entre los que se encuentran la acción contra el virus del mosaico del tabaco
y el virus X (PVX) de la papa.1; 18; 19
Estos metabolitos secundarios son capaces de suprimir la formación de

radicales libres por enlaces con iones de metales pesados, los cuales
catalizan muchos procesos conllevando a la aparición de radicales libre.20
5.3.3. Aplicaciones Terapéuticas de los Flavonoides

El uso de los flavonoides en el tratamiento de las enfermedades ha estado

basado en el empirismo, ya que la práctica es mucho más antigua que la
ciencia química de estos compuestos. Los efectos farmacológicos han
llegado a ser conocidos con el descubrimiento de nuevos flavonoides de
origen vegetal, y a través de la variación de la estructura química de las
flavonas y derivados. 16; 21
Algunas de las propiedades terapéuticas que presentan son las siguientes:
 Actividad contra la fragilidad capilar (Citrus, rutina y derivados).

 Acción antiinflamatoria (taxifolina y bavaquinina).
 Acción antialérgica (baicaleina y sales derivadas de las cromonas).
 Antihepatotóxico (silimarina).
 Antiesclerótica y antiedematosa (rutina).
 Contra la arterioesclerosis.
 Contra la diabetes mellitus (quercetina).
 Expectorante.
 Contra la úlcera al estómago y el duodeno.
 Antiviral.
 Antimicrobiano.
 Acción diurética.

23


5.3.4. Métodos de separación

La extracción de los diferentes flavonoides se realiza a partir del material

vegetal fresco o también se puede realizar con el material vegetal seco (30°
C ó 40° C). Luego debe molerse finamente de esta forma facilitar la
extracción de los compuestos flavonoicos; estos se pueden extraer
indistintamente debido a la solubilidad que presenten en diferentes solventes
orgánicos.
Generalmente se puede realizar métodos de identificación cualitativos como:
 Ensayo de Shinoda, donde flavonoides con el núcleo benzopirona

producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o
alcohólicas se les adiciona magnesio seguido de HCl concentrado.
 Ensayo con Zn/HCl, se producen coloraciones rojo-violeta debido a la
presencia de dihidroflavonoles.
 Ensayo de Pacheco, los dihidroflavonoles producen un color rojo
característico, las flavonas, chalconas, auronas, flavonoles y
flavononas dan negativo.
 Ensayo del estroncio-amoniaco, empleado para distinguir entre
flavonas y flavonoles-3-O-sustituídos.
La etapa del aislamiento y purificación es importante en la separación e

identificación de los flavonoides presentes en el extracto. Se puede emplear
diferentes técnicas, una de ellas son las cromatográficas como es la
cromatografía de papel, la cromatografía de capa fina, la cromatografía de
columna y especialmente la cromatografía líquida de alta resolución. 1
Aunque el método más usual para un análisis preliminar es la absorción UV-

Vis; esta técnica es usada tanto para identificar el tipo de flavonoide como el
modelo de oxigenación. Los espectros de los flavonoides son determinados
usualmente en solución metanólico. El espectro típicamente consiste de dos
máximos de absorción en los rangos 240- 285 nm (Banda II) y 300-550 nm
(Banda I), (FIGURA 5).17
Muy poca es la aplicación de la técnica IR en el análisis de flavonoides

debido a que los espectros UV son mas informativos y requieren menos
material vegetal, sin embargo algunas absorciones características pueden
ser útiles como la absorción C=O entre 1680 y 1640, aromáticos entre 1600
y 1500 y –OH quelatado a 3500-3200. 22

24


FIGURA 4. Espectros de absorción UV-Vis de diferentes tipos de flavonoides

con modelos de hidroxilación equivalente.
5.3.5. Método de cuantificación de Flavonoides Totales

Los flavonoides son compuestos fenólicos ampliamente encontrados en

frutas, vegetales y extractos de plantas. Son importantes debido a los
efectos farmacológicos como vasodilatadores, antiinflamatorio, antiviral y
sobre todo por sus propiedades antioxidantes. 22; 23

25


Los flavonoides que poseen un gran número de grupos hidroxilos formando
glicósidos, son polares y se solubilizan en disolventes polares como el
metanol, etanol o agua; los más representativos son el kaemferol, la
quercetina y la miricetina .24
Mediante cromatografía de capa fina, cromatografía de gases, cromatografía

líquida de alta eficiencia y espectrofotometría, se cuantifican los flavonoides.
Los métodos por cromatografía de gases y de alta eficiencia aportan
información definitiva en la caracterización de las muestra pero presentan
limitaciones importantes debido a los costos del equipamiento, sin embargo
los métodos espectrofotométricos permiten cuantificar flavonoides con
estructuras similares; es por eso que la cuantificación de flavonoides totales
será expresado como quercetina. 24; 25; 26
La quercetina, presenta dos bandas de absorbancia características de las

flavonoles; la primera banda (Banda I) presenta un máximo de 368 nm
debido a las transiciones electrónicas que ocurre en el anillo B y en la
segunda banda (Banda II) presenta un máximo de absorbancia de 255 nm
que corresponde al anillo A (TABLA 3). 23
TABLA 3. Valores de absorción para las Banda I y Banda II de los diferentes

tipos de flavonoides 22
Banda II (nm) Banda I (nm) Tipo de flavonoide
250-280 310-350 Flavonas
250-280 330-360 Flavonoles (3-OH

substituido)
250-280 350-385 Flavonoles (3-OH libre)
245-275 310-330 Isoflavonas
275-295 300-330 Isoflavonas,

dihidroflavonoles
230-270 340-390 Chalconas
230-270 380-430 Auronas
270-280 465-560 Antocianidinas,

antocianinas

26


5.4. Taninos

Los taninos son metabolitos secundarios polifenólicos de origen vegetal, masa

molecular relativamente elevada y con sabor astringente. Pueden encontrarse
en todas las partes de la planta, por ejemplo en tallos, madera, hojas, semilla y
cúpulas. Dentro de los vegetales los taninos suelen encontrarse en las vacuolas
celulares, combinados con alcaloides, proteínas u otros. 27; 28
5.4.1. Clasificación

La clasificación de Freudenberg, tiene su fundamento en el tipo de estructura

base del tanino. Agrupando en dos clases: taninos hidrolizables y
condensados.27
5.4.1.1. Taninos Hidrolizables
Se hidrolizan por la acción de los ácidos, bases o enzimas en un

azúcar un polialcohol y un ácido fenolcarboxílico. Dependiendo del
ácido utilizado se produce una subclasificación, los galotaninos (ácido
gálico) y elagitaninos (ácido elágico). Se conoce que no precipitan con
soluciones de bromo y que al reaccionar con FeCl3 dan una coloración
azul (FIGURA 5). 27
FIGURA 5. Estructuras del ácido gálico y elágico respectivamente 27

27


5.4.1.2. Taninos Condensados

Los Taninos condensados, son derivados de unidades de flavan-3,4-

dioles, conocidos como proantocianidinas condensadas, al ser tratados
con ácidos en caliente se origina una polimerización progresiva hasta
dar taninos amorfos o taninos rojos. Al reaccionar con FeCl3 se produce
una coloración verde y precipita con soluciones de bromo. 27
5.4.2. Funciones y propiedades de los taninos atribuidas en la planta

Algunas de las funciones que desempeñan los taninos en las plantas27:
 Contribuye a la formación del súber.

 Juegan un papel protector, evitando el ataque de insectos y hongos, de
allí que se les atribuye propiedades fungicidas y bacteriostáticas.
 Cumplen el papel de moderador de los procesos de oxidación y de
acciones antifermentos.
 Considerados sustancias de reserva y materiales de desecho luego de
proteger a la planta en ciertas etapas del crecimiento, finalmente se
destruyen o depositan como producto del metabolismo en ciertos
tejidos muertos de la planta madura, como el súber externo, el leño y
las agallas.
 Capacidad de combinarse con diversas sustancias formando
complejos.
De las actividades farmacológicas de los taninos se destaca sus

propiedades astringentes, tanto por vía interna como tópica. Por vía interna
se emplean como antidiarreicos, favoreciéndose esta actividad debido al
efecto antiséptico, ya que precipitan las enzimas extracelulares secretados
por los microorganismos causantes de las infecciones. Además se les
atribuye propiedades vasoconstrictoras, por lo que se emplean en el
tratamiento de afecciones vasculares como varices o hemorroides y en
pequeñas heridas. Respecto al uso tópico están siendo empleados en
diversos problemas de la piel como dermatosis además en cosmética como
tónicos astringentes. Es conocido las propiedades antioxidantes,
comportándose como captadores de radicales libres.28

28


5.4.3. Usos Industriales

El empleo más antiguo de los taninos es en la industria de la curtiembre,

aunque en la actualidad se utilizan otros compuestos para curtir; los taninos
y las macromoléculas se combinan debido a los grupos fenólicos formando
puentes de hidrógeno a la vez se establecen enlaces covalentes que son los
que aseguran que la unión perdure a lo largo del tiempo. Para ello se
requiere que el tanino posea una masa molecular no demasiado elevada
para que pueda intercalarse entre los espacios interfibrilares y no muy
pequeña, ya que no formaría suficiente número de enlaces como para
asegurar la estabilidad de la unión en el tiempo. 28
Los taninos hidrolizables se emplean en las industrias de alimentos, se

puede remover impurezas proteínicas por precipitación con taninos. 27
5.4.4. Cuantificación de taninos

Debido a la clasificación de los taninos, en condensados e hidrolizables,

existen diversos métodos de cuantificación, por ejemplo el método de
Lowenthal, el método de Folin-Ciocalteu, método de Stiasny, el método de la
Proantocianidina, entre otros. Estos métodos están basados en tres
propiedades de los taninos: 29
 La habilidad de precipitar proteínas y alcaloides.

 Reactividad de sus anillos fenólicos.
 Productos de su despolimerización.
5.4.4.1. Método de Lowenthal

El método de Lowenthal es volumétrico y está basado en la oxidación

del tanino por acción de permanganato de potasio (KMnO4) en
presencia del añil sulfonado (índigo de carmín), sirviendo este como
indicador y como regulador de la reacción. Debido a la naturaleza del
ácido gálico y otros compuestos que estén presentes, se oxidan del
mismo modo que el tanino, por ello es necesario realizar una segunda
valoración después de separar el tanino, calculando éste por diferencia.
Para realizar esta operación puede emplearse caolín o una solución
recién preparada de gelatina. 27; 30; 31

29


5.5. Análisis Fitoquímico

Existen diferentes métodos cualitativos para la detección preliminar de los

diferentes metabolitos secundarios que pueden encontrarse en las plantas,
basados en la extracción de estos mediante solventes orgánicos de diferentes
polaridades y aplicando pruebas de coloración. 22; 32
Respecto a las pruebas cualitativas, estas son realizadas para identificar la

presencia de el o los tipos de metabolitos secundarios que presentan las
plantas, cabe mencionar la prueba de espuma en el caso de saponinas, la
reacción de los flavonoides con el reactivo de Shinoda, la reacción de los taninos
con gelatina- cloruro de sodio, entre otros.
5.6. Fenoles

Las plantas producen una variedad de metabolitos secundarios que contienen

un grupo fenol, los cuales presentan un grupo hidroxilo unido a un anillo
aromático y son solubles en solventes orgánicos, de acuerdo con su diversidad
química los fenoles cumplen funciones en la defensa de las plantas contra
herbívoros o patógenos, otros son parte del soporte mecánico, en la atracción de
polinizadores y en la reducción del crecimiento de las plantas competidoras
cercanas.33
5.6.1. Determinación de Fenoles Totales mediante el Método de Folin-

Ciocalteu

El método de Folin-Ciocalteau se basa en la capacidad de los fenoles para

reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de Folin- Ciocalteau contiene
molibdato y tungstato sódico, el cual reacciona con cualquier tipo de fenol,
formando complejos fosfomolíbdico- fosfotúngstico. La transferencia de
electrones a pH básico reduce los complejos fosfomolíbdico- fosfotúngstico
en óxidos. Cromógenos de color azul intenso, de tungsteno (W8O23) y
molibdeno (Mo8O23), siendo proporcional la cantidad de grupos hidroxilos
presentes a la intensidad del color azul, este compuesto puede ser
identificado y cuantificado por espectroscopia de UV-Vis debido a que puede
absorber a una longitud de 760 nm, además el contenido de fenoles totales
generalmente se expresa en equivalente de ácido gálico (FIGURA 7). 34

30


FIGURA 7. Mecanismo de acción del reactivo de Folin- Ciocalteu
5.7. Antioxidantes

Las plantas han desarrollado mecanismos de defensa frente a los estímulos del
ambiente; algunas respuestas de defensa se manifiestan sólo bajo alguna
condición inductiva y se observan durante la adaptación de las plantas al
ambiente frente a factores bióticos como patógenos, plagas y simbiontes, o por
factores abióticos como alta o baja temperatura, radiación, salinidad, entre otros.
Las respuestas inducidas también pueden ser de largo plazo y estas son las
responsables de la conocida plasticidad fenotípica de las plantas, produciendo
alteraciones en los programas de desarrollo. 35
Las respuestas que ocurren frente a cualquier factor ambiental dependen de la

acción de señalizadores que interaccionan con receptores específicos, los
cuales inducen la síntesis y acumulación de ciertos metabolitos secundarios,
fitoalexinas, proteínas u otros compuestos, por ello entre los sistemas de
respuesta se encuentra la síntesis de fitoquímicos y antioxidantes, siendo estos
compuestos que cumplen funciones importantes: 35
 Atrapadores de radicales libres.

 Estabilizadores.
 Protectores del DNA y proteínas frente al estrés por oxidación.

31


5.7.1. Antioxidante

Un antioxidante es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación

de un sustrato oxidable, actuando como donador de electrones (agente
reductor). Los niveles bajos o la inhibición de las enzimas antioxidantes
causan estrés oxidativo y pueden dañar o matar las células. 36
En los seres humanos los antioxidantes se obtienen mediante la ingesta de

alimentos frescos y crudos (frutas y vegetales), cabe mencionar que los
alimentos procesados contienen menos concentración de antioxidantes ya
que en el proceso de preparación se expone al alimento ante el oxígeno;
algunas fuentes ricas de antioxidantes (TABLA 4). 36
TABLA 4. Alimentos antioxidantes y metabolitos secundarios que generan esta

acción
ALIMENTO ANTIOXIDANTE- METABOLITO
SECUNDARIO
Uva
Cereza Flavonoides Hidrosolubles
Kiwi
Ciruela
Zanahoria
Tomate
Naranja Alfa y beta carotenos
Papaya
Lechuga
Té verde
Cacao Catequinas y Polifenoles
Lentejas
Garbanzos Isoflavonas
Vino tinto
Uvas Taninos
Cebolla roja
Manzana Quercetina

32


5.7.2. Clasificación de los antioxidantes
 Los antioxidantes exógenos actúan como donadores de electrones, ya

que se oxidan al neutralizar al radical libre, por lo que la reposición de
ellos debe ser continua, mediante la ingestión de los nutrientes que los
contienen.
 Los antioxidantes endógenos son normalmente bio-sintetizados por el
organismo (TABLA 5). 37; 38;39
TABLA 5. Clasificación de los antioxidantes, según su origen 37

ORIGEN COMPUESTOS ACCIÓN
 Neutraliza el
Vitamina E oxígeno singlete.
Vitamina C  Neutraliza
Exógenos Betacarotenos peróxidos
Flavonoides  Neutraliza el
Licopenos oxígeno singlete.
 Captura radicales
libres de hidroxilo
Enzimáticos Cofactor
Endógenos Supéróxidos dismutasa Cobre, sodio, manganeso
Catalasa Hierro
Glutatión peroxidasa Selenio
Barreras fisiológicas que

Glutatión enfrenta el oxígeno a su
No enzimáticos Coenzima Q paso desde el aire hasta
Ácido Tioctico las células
transportadoras de
metales.

33


5.7.3. Radicales Libres

Los radicales libres desde el punto de vista químico son cualquier especie
que contenga un electrón desapareado en su órbita más externa y que sea
capaz de existir en forma libre. Estos actúan como potentes agentes
oxidantes y son la causa del envejecimiento al combinarse con moléculas
como el DNA y proteínas. 36
Los radicales libres se forman debido a una ruptura homolítica y por

reacciones de transferencia de electrones que sufren las moléculas estables.
Se producen continuamente en el organismo debido a las reacciones
bioquímicas de oxido-reducción con el oxígeno. 36
Factores que favorecen su formación:
 Radiación ionizante (ultravioleta, térmica).

 Contaminación ambiental.
 Disminución de la capacidad antioxidantes enzimática.
 Humo de cigarrillo.
Los radicales libres del oxígeno presentan una función fisiológica en el

organismo, ya que participan en la fagocitosis, favorecen la síntesis de
colágeno, favorecen la síntesis de prostaglandinas, activan enzimas de la
membrana celular. Existe un término que incluye a los radicales libres y a
otras especies no radicálicas, pero que participan en reacciones que
conducen a la elevación de los agentes prooxidantes y son las especies
reactivas del oxígeno (EROS). 37; 40; 41
Las principales especies reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes

son: 37
 Radical hidroxilo (HO+)

 Peróxido de hidrógeno (H202)
 Anión superóxido (O )
 Oxígeno singlete (1O2 )
 Ozono (O3 )
5.7.4. Estrés Oxidativo

El estrés oxidativo (EO) ocurre cuando existe un desequilibrio en nuestras

células debido a un aumento en los radicales libres y una disminución de
antioxidantes del sistema endógeno. 42

34


La alteración de este equilibrio puede tener diversos grados de magnitud; en
el estrés oxidativo leve, las defensas antioxidantes restablecen dicho
equilibrio, pero en el estrés oxidativo grave se llega a graves alteraciones en
el metabolismo celular. El daño por estrés oxidativo puede ser reversible
como irreversible, eso dependerá de la edad del organismo, el estado
nutricional, la efectividad de la defensa antioxidante y factores genéticos que
codifican sistemas antioxidantes. 43; 44
5.7.5. Importancia de los antioxidantes para la salud

La presencia de antioxidantes naturales en nuestra dieta es importante,

porque al ser ingeridos ayudan a preservar la salud de las personas que los
consumen. La ingesta de 400 a 600 gramos por día de frutas y vegetales se
asocia con la reducción de la incidencia de enfermedades crónicas no
transmisibles. Sin embargo no todos los antioxidantes presentes en un
alimento serán absorbidos en igual magnitud al llegar al tracto gastro-
intestinal, eso dependerá de otros factores: 35; 45
1. La estructura química de cada antioxidante en cuestión (eficiencia de

absorción de los tocoferoles respecto a los carotenoides o a los
flavonoides).
2. De la matriz en la cual cada antioxidante se encuentre formando parte
del alimentos, es decir un fruto entero respecto a un jugo, liofilizado o
micro encapsulado.
3. Del estado en que se encuentra el alimento a ser ingerido, es decir si
se encuentra crudo o cocido, natural respecto al procesado.
El consumo de alimentos ricos en polifenoles, ya sean frutas, verduras,

legumbres y cereales son favorables para la conservación y normalización
de parámetros fisiológicos. Los flavonoides siendo los polifenoles más
abundantes en los alimentos una de las funciones principales es la de
antioxidantes, actuando como dadores de electrones a los radicales libres,
poniendo fin a la cadena de oxidación. 45
La deficiencia de antioxidantes conlleva a un estrés oxidativo y como

consecuencia de ello, la presencia de enfermedades crónicas degenerativas,
en donde hay una asociación directa o indirecta con la exposición a los
radicales libres. Alguna de estas enfermedades son: el Alzheimer,
Parkinson, lesión cerebral hipertensiva, distrofia muscular, esclerosis
múltiple, cáncer, degeneración de la retina, diabetes, infarto, envejecimiento,
entre otras. 42

35


5.7.6. Determinación de la Capacidad Antioxidante

Existe una variedad de métodos para determinar la capacidad antioxidante

de una sustancia. El método del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil ó DPPH
(Brand-Williams et al.; 1995), es el más usado y está basado en la
estabilidad de dicho radical la cual se le atribuye a la deslocalización del
electrón desapareado, esta deslocalización le otorga una coloración violeta
caracterizada por una banda de absorción alrededor de 517nm. 46; 47
Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que
puede donar un átomo de hidrógeno o con otra especie radical (R.) se
produce la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R con la consecuente pérdida
del color y por lo tanto la pérdida de la absorbancia. 46
Finalmente se calcula el valor de la concentración inhibitoria media (IC50) o

la concentración de compuestos antioxidantes que es capaz de inhibir el
50% del radical DPPH (FIGURA 8).
FIGURA 8. Reacción del radical ,1-difenil-2-picrilhidrazil con un antioxidante 48

36


5.8. Actividad Antimicrobiana

Las plantas superiores presentan metabolitos secundarios con buena actividad

antimicrobiana; los cuales actúan, en bajas concentraciones, como
mecanismos de defensa contra microorganismos, destruyéndolos o inhibiendo
su crecimiento. 49
5.8.1. Metabolitos secundarios con propiedad antimicrobiana
5.8.1.1. Flavonas

Las flavonas son estructuras fenólicas que contienen un grupo

carbonilo. Constituyen la familia más amplia de fenoles naturales. Su
actividad frente a los microorganismos probablemente se debe a que
forman complejos con las proteínas solubles y extracelulares y con las
células de la pared bacteriana. 50
5.8.1.2. Isoflavonoides

Actúan como fitoalexinas, las cuales pueden ser definidas como

compuestos antimicrobianos de pequeño peso moléculas o metabolitos
de estrés biológico. Pueden ser constitutivos o también ser inducidos
por ataque biológico o heridas. Los constituyentes varían entre las
especies y el habitad y distribución de la planta. Este tipo de
flavonoides inhiben la germinación de esporas de hongos y causan
daño a los sistemas de membrana. 50
5.8.1.3. Taninos

Sustancias de origen polifenólica, solubles en agua, alcohol y acetona.

Se han descrito más de 30 taninos que pueden inhibir hongos y
bacterias. 50
5.8.1.4. Saponinas

Son los componentes principales de varios extractos de plantas, tienen

actividad antiprotozoaria. Las saponinas se unen al colesterol y otros
esteroles de la membrana celular de los protozoos causando su
inestabilidad, lisis y muerte celular. 50

37


5.8.2. Microorganismos utilizados
5.8.2.1. Candida albicans

Es la especie patógena más frecuente en el hombre, estos hongos

viven como saprofitos sobre la piel y las mucosas del tracto respiratorio
y digestivo. Es una levadura, redonda u ovoide con 3 mcm de diámetro,
con o sin gemación. Se relaciona con los alimentos ya que es una
levadura presente en la fermentación de éstos, atacando alimentos
ricos en grasa, a pesar de ello otras especia de Candida tienen
importancia industrial produciendo ácidos orgánicos. 50
5.8.2.2. Salmonella enteritidis

Es una bacteria formada por bacilos Gram negativos, anaerobio

facultativo, con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula. El
género Salmonella es el agente causal de diferentes infecciones
intestinales. 51
5.8.2.3. Escherichia coli

Es un bacilo de 1-3 µm por 0.5 µm, que se presenta sólo en pares, en

cortas cadenas o formando grupos. En general es móvil, aunque
existen variantes inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo
general es no capsulado y Gram negativo. En agar forma colonias
circulares de 3 a 5 mm convexas y de coloración blanca un poco
amarillenta.
Este bacilo es aerobio y anaerobio facultativo; su temperatura óptima

de crecimiento es de 37°C el pH favorable es de 7. 50
5.8.2.4. Staphylococcus aureus

Son cocos Gram positivos de 0,5 – 1 mcm de diámetro, inmóviles,

aerobios o anaerobios facultativos, caracterizados por si agrupación en
forma de racimo.

38


Crecen a una temperatura óptima de 37 °C y se desarrollan en un pH
ligeramente alcalino de 7,6 la adición de glucosa favorece el
crecimiento. Staphylococcus aureus se ha identificado como una de las
principales causas de infección de heridas quirúrgicas.
5.8.3. Determinación de la actividad antimicrobiana

Se utilizó el método de difusión por discos (Bauer et at.), consiste en determinar

la presencia de un halo de inhibición formado en el cultivo bacteriano
demostrando así la actividad antimicrobiana del extracto acuoso. Consiste en
añadir el extracto acuoso en diferentes placas Petri, los cuales contienen el
medio agarizado sólido previamente inoculado con los microorganismos. 52
5.9. Espectroscopia de Absorción Atómica
5.9.1. Fundamento

La Absorción Atómica es una técnica capaz de detectar y determinar

cuantitativamente la mayoría de elementos químicos. Este método consiste
en la medición de especies atómicas por su absorción a una longitud de
onda en particular. La especie atómica se logra por atomización de la
muestra para llegar al estado fundamental del átomo, por lo que existen
diferentes técnicas. 53; 54
La técnica más usada es la atomización con flama, la muestra en forma

líquida es aspirada a través de un tubo capilar y conducida a un nebulizador
donde ésta se desintegra y forma un rocío o pequeñas gotas de líquido. Las
gotas formadas son conducidas a una flama, donde se originan la formación
de átomos, los cuales absorben la radiación emitida por la lámpara y la
cantidad de radiación absorbida está en función de su concentración, la
señal de la lámpara una vez que pasa por la flama llega al monocromador,
esta señal de radiación electromagnética llega a un detector y pasa a un
amplificador y por último a un sistema de lectura (FIGURA 9). 53; 54

39


FIGURA 9. Esquema, Espectroscopia de Absorción Atómica
5.9.2. Minerales en las plantas

Las plantas además de producir sustancias químicas que ocasionan efectos

fisiológicos, también son fuentes de vitaminas y oligoelementos como el
magnesio, calcio, fosforo, hierro, silicio, cobalto , sodio entre otros; cada
mineral cumple una función específica, y la carencia o exceso del mismo
puede producir signos en las hojas, tallo o salud de la planta. 55
Los nutrientes minerales esenciales para las plantas son aquellos: 56
1. Necesarios para la ocurrencia de un ciclo de vida completo.

2. Involucrados en funciones metabólicas o estructurales en las cuales no
pueden ser sustituidos.
3. Cuya deficiencia se asocia a síntomas específicos.
Las hojas y sus partes representan la inversión de los recursos nutricionales

de las plantas en procesos fisiológicos, ligados al intercambio gaseoso
(asimilación fotosintética del CO2, transpiración). La composición química
típica de la materia seca de una hoja puede ser 60% Carbohidratos, 25%
Proteínas, 5% Lípidos y 10% Minerales. El destino fisiológicos de estos
minerales es variado y dependen de las relaciones fuente-sumidero y de la
especificidad de las funciones desempeñadas por cada mineral. 56

40


5.9.2.1. Clasificación de los nutrientes minerales

Los elementos esenciales se puede clasificar según: 56
1. La concentración de la planta (TABLA 6).

2. La función bioquímica o biológica.
3. La movilidad y translocación en la planta.

TABLA 6. Clasificación de los elementos esenciales según su concentración en

la planta. 57
MACRONUTRIENTES MICRONUTRIENTES
Primarios Secundarios
Hierro (Fe)
Nitrógeno (N) Calcio (Ca) Cobre (Cu)
Fósforo (P) Magnesio (Mg) Zinc (Zn)
Potasio (K) Azufre (S) Cloro (Cl)
Manganeso (Mn)
Molibdeno (Mo)
Boro (B)
5.9.2.2. Manganeso

La función del manganeso está basada en la evolución del oxígeno

fotosintético. En las reacciones del Fotosistema II, la molécula de agua
es descompuesta por una deshidrogenasa que es activada por un ión
manganeso. Como producto de esta reacción se libera O2 y los átomos
de hidrógeno son enviados a la plastoquinona para iniciar el transporte
de electrones de la fotosíntesis. Además se sabe que es imprescindible
en la síntesis de la molécula de clorofila. 58
El manganeso es absorbido como un catión divalente (Mn2+) y su rango

de pH óptimo es de 5 a 7. La deficiencia del mismo se muestran
primero en las hojas jóvenes, donde se observa una clorosis
caracterizada por la aparición de manchas amarillentas y necróticas
entre las nervaduras. 58

41


5.9.2.3. Zinc

El zinc actúa tanto como un componente metal de enzimas, como un

cofactor funcional, estructural o regulatorio de un gran número de
enzimas. Es absorbido como un catión divalente (Zn2+) y su pH óptimo
es de 5 a 7. La deficiencia del mismo, causa la reducción del tamaño
de la planta en general, provocado por una reducción de los
entrenudos. 58
5.9.2.4. Hierro

La función del hierro en el metabolismo de la planta se debe a la

facilidad de este elemento para reducirse (Fe3+) y oxidarse (Fe2+). El
hierro forma parte de dos grupos de proteínas, las hemoproteínas y
hierro-azufre, de esta última la más importante es la ferredoxina, que
participa en las reacciones lumínicas de la fotosíntesis. 58
Por ser un elemento pesado y poco soluble, los principales síntomas de

deficiencia se presentan en las hojas y consiste en una clorosis con las
nervaduras principales y secundarias de color verde. 58
5.9.2.5. Cobre

Es absorbido en forma de ión cúprico (Cu2+) y puede ser absorbido

como una sal de un complejo orgánico como el EDTA. El cobre está
presente en tres diferentes formas en las proteínas: proteínas azules,
que no tienen actividad oxidativa y cuya función es de transferencia de
un electrón; proteínas no-azules, las cuales producen peroxidasas y
oxidan monofenoles a difenoles; y proteínas multicobre, que contiene al
menos cuatro átomos de cobre por moléculas y actúan como oxidasas.
58
La deficiencia de cobre en los cereales, provoca una clorosis o

amarillento y rizado de la lámina foliar; en cítricos, ocurre un
marchitamiento de los brotes nuevos y en ocasiones la lámina de la
hoja muestra coloraciones azuladas. 58

42


5.9.2.6. Metales pesados en las plantas

Son elementos químicos que presentan alta densidad y son tóxicos

inclusive en concentraciones muy bajas, por ejemplo alguno de estos
elementos son: el plomo (Pb), mercurio (Hg), cromo (Cr), cadmio (Cd),
entre otros. Estos metales se encuentran como componentes
naturales de la corteza terrestre, presentes en forma de minerales,
sales u otros componentes; se sabe que no pueden ser degradados o
destruidos fácilmente de forma natural ya que no presentan funciones
metabólicas específicas para los seres vivos.
Dentro de los metales pesados, denominados oligoelementos, son

requeridos en pequeñas cantidades y son necesarios para que los
organismos completen su ciclo vital (Cu, Cr, Fe, Mn y Zn).
Cuando el contenido de metales pesados en el suelo alcanza niveles

que rebasan los límites máximos permitidos causan efectos inmediatos
como inhibición del crecimiento normal y el desarrollo de las plantas, y
un disturbio funcional en otros componentes del ambiente así como la
disminución de las poblaciones microbianas del suelo (TABLA 7). 59; 60

43


TABLA 7. Concentración de los macro y micronutrientes expresados en
miligramo por kilogramo o ppm en las plantas.78
ELEMENTO CONTENIDO MINERAL NÚMERO DE ÁTOMO
(mg Kg-1 PS) RELATIVO AL Mo
MICRONUTRIENTE
Níquel (Ni) 0,05 1
Molibdeno (Mo) 0,1 1
Cobre (Cu) 6 100
Zinc (Zn) 20 300
Manganeso (Mn) 50 1 000
Hierro (Fe) 100 2 000
Boro (B) 20 2 000
Cloro (Cl) 100 3 000
MACRONUTRIENTES
Azufre (S) 1 000 30 000
Fósforo (P) 2 000 60 000
Magnesio (Mg) 2 000 80 000
Calcio (Ca) 5 000 125 000
Potasio (K) 10 000 250 000
Nitrógeno (N) 15 000 1 000 000
Oxígeno (O) 450 000 30 000 000
Carbono (C) 450 000 40 000 000
Hidrógeno (H) 60 000 60 000 000

44


VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

6.1. Materiales, Equipos y Reactivos

Reactivos y Materiales
Los reactivos, Folin-Ciocalteau y Quercetina Dihidratada fueron obtenidos de

MERCK. Los reactivos, carbonato de sodio y caolín PZ-400 fueron obtenidos de
RIEDEL – DEHAЁN AG. El indicador Índigo de Carmín y el reactivo 2,2-Difenil-
1-1picrilhidrazol (DPPH) fueron obtenidos de SIGMA – ALDRICH. Los reactivos,
permanganato de sodio y oxalato de sodio fueron obtenidos de BAKER
ANALYZED. La gelatina y agar nutritivo deshidratado, fueron obtenidos de
MOVILAB y BRITANIA S.A. respectivamente. El reactivo cloruro de sodio fue
obtenido de SCHARLAU CHEMIE S.A. Finalmente se menciona que los
solventes empleados fueron de grado reactivo analítico.
 Salkowski
 Liebermann – Burchard
 Shinoda
 Borntrӓnger
 Cloruro Férrico
 Agua de Bromo
 Acetato de plomo al 5%
 Hidróxido de sodio al 5%
 Fehling
 Alcohol isoamílico
 Dragendorff
 Mayer
 Wagner
 Otto
Equipos
 Espectrofotómetro UV - Vis (THERMO SCIENTIFIC HEλIOSϒ)

 Lámpara UV (COMPACT UV LAMP 254/365 nm)
 Espectrofotómetro de Absorción Atómica (AA – 6800 SHIMADZU)
 Balanza Analítica (SHIMADZU AUW120, max:120g – min: 10g)

45


6.2. Procedimiento

6.9.1. Recolección y Selección de la muestra

Las hojas de la especie Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst fue

recolectada en el distrito de Yucay, provincia de Urubamba, departamento
del Cusco, durante las épocas de Agosto a Noviembre.
Las hojas muestreadas fueron llevadas a la estufa para ser secadas a 32 °C

durante 72 horas; una vez secas fueron molidas y colocadas en frascos para
su mejor conservación y posterior estudio.
6.9.2. Tratamiento de la muestra

Se utilizó 120 gramos de hojas secas y molidas, las cuales fueron

desengrasadas con el solvente bencina de petróleo empleando un equipo
Soxhlet, posteriormente fue llevado a una estufa para ser secado durante 24
horas a 32 °C; el material desengrasado se guardó en un frasco para su
posterior utilización.
6.9.3. Obtención de los Extractos con Polaridad Creciente

Se realizó la extracción con solventes de polaridad creciente: n-hexano,

cloroformo, acetato de etilo, etanol y metanol respectivamente. Para obtener
dichos extractos se pesó 50 gramos de hojas, se colocó en un frasco ámbar
de boca ancha, se añadió 90 mL de n-hexano y se almacenó en la
oscuridad, a temperatura ambiente, durante una semana con agitación
frecuente; culminado el tiempo, se filtró empleando el equipo de bomba de
vacío. Finalmente el filtrado se concentró a 32°C en una estufa durante 4
días aproximadamente hasta peso constante.
El residuo del papel filtro se llevó a secar a 32°C en una estufa durante 48
horas, hasta peso constante, una vez seco se continuó con el siguiente
solvente.

46


6.9.4. Análisis Fitoquímico de los extractos

Se realizó el análisis fitoquímico (Screening) preliminar para determinar los

metabolitos secundarios mayoritarios presentes en la hojas de
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst. Posteriormente se realizó
dicho análisis a cada extracto obtenido con polaridad creciente, cabe
mencionar que los análisis respectivos de cada metabolito se realizaron por
triplicado. 61
6.9.4.1. Saponinas
6.9.4.1.1. Prueba de espuma

A una solución acuosa de hojas secas, se sometió a una agitación

vigorosa durante 30 segundos. La presencia de las saponinas es
indicada por la formación de una espuma persistente durante 3
minutos.
6.9.4.1.2. Reactivo de Salkowski

A 2 mg de los extractos de n-hexano, cloroformo y acetato de etilo se

añadió 1 mL de ácido sulfúrico concentrado y 3 gotas de anhídrido
acético, las coloraciones van del amarillo al rojo sangre, este reactivo
indica la presencia de saponinas que pueden ser triterpenoidales o
esteroidales.
6.9.4.1.3. Variante A de la reacción de Salkowski

Se disolvió 2 mg de cada extracto en cloroformo; se añadió 5 gotas de

anhídrido acético refrigerado más una gota de ácido sulfúrico
concentrado, por las paredes. La coloración es de rojiza-grosella para
saponinas triterpénicas y azul-verdosa para saponinas esteroidales.

47


6.9.4.1.4. Variante B de la reacción de Salkowski

Se disolvió 2 mg de de cada extracto en cloroformo; se le agregó 1 mL

de ácido sulfúrico concentrado. Si el color obtenido va del rojo azulado
hasta el púrpura se le considera saponinas esteroidales y si es rojo
colesterol.
6.9.4.1.5. Reactivo de Liebermann-Burchard

Se añadió 5 gotas de ácido acético más 2 mL de anhídrido acético/ ácido

sulfúrico (50:1). Si el color va del rosado al púrpura serán saponinas
triterpenoidales mientras que la esteroidales da azul -verdoso.
6.9.4.2. Flavonoides
6.9.4.2.1. Reactivo de Shinoda

A 1 mL del extracto etanólico y metanólico se añadió una limadura de

magnesio y 3 gotas de ácido clorhídrico concentrado. Se observa un
intenso burbujeo por la reacción de la limadura y la solución adquiere
una débil coloración naranja al principio; conforme va reaccionando la
coloración naranja se va intensificando, lo que indica la presencia de
flavonoides.
6.9.4.2.2. Reacción con cloruro férrico

Se añadió 2 gotas de cloruro férrico al extracto etanólico y metanólico.

La aparición de un color verde negruzco indica la presencia de
compuestos fenólicos.
6.9.4.2.3. Reacción con NaOH 20%

Se añadió 5 gotas de hidróxido de sodio al 20% al extracto etanólico y

metanólico, se obtiene un cambio de coloración.

48


6.9.4.3. Taninos
6.9.4.3.1. Reacción con gelatina-cloruro de sodio

A 1 mL del extracto etanólico y metanólico se añadió 3 gotas de

gelatina- cloruro de sodio, en un principio se forma una sustancia en
forma de nube en la solución, luego de centrifugar se observó un
precipitado de color blanco. Éste confirma la presencia de taninos.
6.9.4.3.2. Reacción con cloruro Férrico o alumbre férrico

A 1 mL del extracto etanólico y metanólico se le añade 2 gotas de

cloruro férrico, una coloración negra azulada indica la presencia de
taninos pertenecientes a los derivados del ácido pirogálico y si da una
coloración verde es derivado de la catequina.
6.9.4.3.3. Reacción de precipitación con agua de bromo

A 1 mL del extracto etanólico y metanólico se añadió 5 gotas de agua

de bromo. La formación de un precipitado indica la presencia de un
tanino catéquico o flobatanino.
6.9.4.3.4. Reacción con formaldehído

A 1 mL del extracto etanólico y metanólico se añadió 1 mL de

formaldehído y 2 gotas de ácido clorhídrico concentrado, se calentó en
bañomaría; si precipita totalmente el tanino pertenece a la clase
catéquica. Los taninos pirogálicos en las mismas condiciones dan
compuestos parcialmente solubles.

49


6.9.4.3.5. Reacción con acetato de plomo

A 1 mL del extracto etanólico y metanólico se añadió 1 mL de acetato

de plomo 5%, observa la presencia de un precipitado, este es separado
y se le añadió 5 gotas de ácido acético diluido y al filtrado se le agregó
2 gotas de cloruro férrico.
Todos los taninos naturales precipitan completamente con el acetato de

plomo en solución neutra, de modo que el filtrado no de reacción con
una sal férrica. El precipitado de taninos catéquicos o flobataninos, se
disuelve en ácido acético diluido, mientras que el precipitado de los
galotaninos es total o parcialmente insoluble.
6.9.4.4. Antocianinas - Betalaínas
6.9.4.4.1. Adición de álcali: NaOH 20%


hidróxido de sodio al 20%, la decoloración lenta de violeta, azul, verde
y amarillo indica fenolatos alcalinos. Una decoloración rápida a amarillo
es para el caso de betacianinas.
6.9.4.4.2. Reacidificación: HCl 1N

A la solución anterior se le añadió 1 mL de ácido clorhídrico 1N. La

regeneración del color rojo indica la presencia de antocianinas.
6.9.4.4.3. Adición de amoniaco


amoniaco, la decoloración rápida de violeta a amarillo para
antocianinas.
6.9.4.4.4. Adición de HCl 1N

La solución da un rojo más claro para antocianinas y un violeta más

oscuro para betacianinas.

50


6.9.4.4.5. Alcohol isoamílico-agua

A 1 mL del extracto etanólico y metanólico se añadió 1 mL de alcohol

isoamílico y agua; la fase alcohólica adquiere una coloración rojiza a
pH ácido para antocianina y en el caso de betacianina no ocurre se
observa tal coloración.
6.9.4.5. Quinonas
6.9.4.5.1. Reacción con NaOH al 5%

Se pesó 2 mg del extracto etanólico y metanólico, se añadió 0,2 mL de

etanol y 0,4 mL de NaOH al 5%, el cambio de coloración indica la
presencia de compuestos quinónicos.
6.9.4.5.2. Reacción de Borntrӓnger

A 2mg del extracto etanólico y metanólico, se añadió KOH 5% en

caliente, se filtró, en frío se aciduló con HCl al 20%, luego de agregar el
benceno se agito y se dejó en reposo. Luego se separó la fase
bencénica a la cual se la añadió NH4OH. La formación de una
coloración rosada a roja, indicaría la presencia de antraquinonas.

51


6.9.5. Método Espectrofotométrico para la Determinación Cuantitativa de
Flavonoides Totales expresados como Quercetina
6.9.5.1. Curva de Calibración del Patrón Quercetina

Se preparó una solución de quercetina (0,0025 gramos de quercetina

dihidratada en 25 mL de etanol al 96%) de 100 ppm. A partir de esta se
prepararón soluciones con las siguientes concentraciones: 4, 5, 10,12,
15, 16, 17 ppm. Se leyó a 255 nm en el espectrofotómetro UV-Vis.
6.9.5.2. Determinación Cuantitativa de Flavonoides Totales

La determinación cuantitativa de flavonoides totales, fue realizada

según el método descrito por Kostennikova Z. Se pesó 0,5 gramos, de
hojas desengrasadas, las cuales fueron transferidas a un balón de 250
mL y se añadió 20 mL de ácido sulfúrico al 10% más 20 mL de etanol
al 50%, se utilizó la técnica de reflujo por el lapso de 2 horas.
Culminado el tiempo se filtró empleando el vacío; el residuo se lavó con

30 mL de etanol al 50% para desecharlo finalmente. El filtrado fue
evaporado en bañomaría (40°C) hasta la mitad del volumen inicial, se
enfrió sobre un baño de hielo por 30 minutos y posteriormente se filtro,
lavando el precipitado formado con 40 mL de agua destilada fría (10-
15°C). Se eliminó el filtrado y los lavados, el residuo tanto del filtro
como del recipiente se disolvió con 70 mL de etanol al 96%, calentado
previamente a 50 °C; la solución fue transferida a una fiola de 100 mL y
se enrazó con etanol al 96%. Finalmente se leyó las absorbancias a
255 nm, este método fue realizado por triplicado (± Desviación
estándar). 62; 63
La expresión empleada para el cálculo fue la siguiente:
A P 5

52


Donde:
X = Contenido de flavonoides totales expresados como quercetina

(mg quercetina / g muestra)
Am = Absorbancia de la solución muestra (nm)
PR = Peso de la sustancia patrón o referencia (g)
AR = Absorbancia de la solución patrón o referencia (nm)
6.9.6. Método de Lowenthal para Taninos
6.9.6.1. Solución Estandarizada de Permanganato de Potasio 0.1N

Se realizó una titulación utilizando ácido tánico como patrón con

permanganato de potasio 0.1N. Se pesó 0,1 gramos de ácido tánico,
20 mL de índigo carmín como indicador y 750 mL de agua destilada.
Se tituló hasta la aparición del color amarillo oro. Se realizó un blanco
reactivo. 28
6.9.6.2. Contenido de Taninos Totales

Se pesó 2 gramos de hojas, aproximadamente, y se reflujo con 200 mL

de agua destilada por 4 horas. Posteriormente fue filtrado, se tomó una
alícuota de 25 mL y se transfirió a un matraz de 1000 mL más 20 mL
de índigo carmín y 750 mL de agua destilada. Se tituló con KMnO4
0.1N hasta observar una coloración amarilla dorada. Se realizó un
blanco reactivo; fue realizado por triplicado.
6.9.6.3. Contenido de no Taninos

Se tomó una alícuota de 100 mL de la solución acuosa obtenido luego

del reflujo, se añadió 50 mL de la solución de gelatina y 100 mL de
cloruro de sodio ácido (25 mL de ácido sulfúrico concentrado más 975
mL de cloruro de sodio saturado) y 20 gramos de caolín. Se agitó y se
dejó reposar durante 20 minutos.

53


Se tomó 25 mL de la solución anterior más 20 mL del indicador índigo
carmín y 750 mL de agua destilada. Se tituló con KMnO4 0.1N hasta
observar una coloración amarilla dorada. Se realizó un blanco reactivo;
fue realizó por triplicado. Los resultados se expresaron como gramos
de ácido tánico /100 gramos de muestra (± Desviación estándar). 28; 64
6.9.7. Fenoles Totales

6.9.7.1. Curva de Calibración de Contenido de Fenoles Totales

Los fenoles totales se determinaron mediante el método de Folin-

Ciocalteu, utilizando ácido gálico como patrón.
Se preparó una disolución de ácido gálico de 100 mg/L, de la misma

manera se preparó una disolución de carbonato de sodio al 20% y una
disolución 1N del reactivo de Folin Ciocalteu, por medio de una dilución
del reactivo comercial, el cual es 2N, en agua destilada; el reactivo se
protegió de la luz.
Utilizando la disolución patrón de ácido gálico, en viales de color ámbar

de 10 mL, se prepararón diluciones para obtener concentraciones de
0 mg/L, 1 mg/L, 3 mg/L, 6mg/L, 9mg/L; se tomó respectivamente 80 µL,
240 µL, 480 µL y 720 µL de la disolución patrón de ácido gálico de 100
mg/L y se adicionó a cada vial 250 µL del reactivo Folin Ciocalteu 1N,
se agitó durante 5 minutos, posteriormente se adicionó a cada vial
1250 µL de carbonato de sodio al 20%, se llevó a un volumen final de 8
mL con agua destilada y se dejó en reposo por 1h. Se preparó un
blanco con todos los componentes excepto la disolución de ácido
gálico. Culminado el tiempo se leyó la absorbancia a 760 nm en el
espectrofotómetro de UV-Vis. Se realizó por triplicado.
6.9.7.2. Preparación del extracto metanólico
Se pesó 12 gramos de hojas secas y desengrasadas, se dejó macerar

con metanol (60 mL) en un frasco ámbar a temperatura ambiente
durante 5 días agitándolo cada día, se filtro y el filtrado se concentró a
32 °C durante 2 días en una estufa hasta peso constante.

54


6.9.7.3. Determinación del contenido de fenoles totales en el extracto
metanólico
En una fiola de 100 mL se pesó 4 mg del extracto metanólico y se

enrasó con metanol; se tomó 1 mL de esta disolución y se mezcló con
3,5 mL de reactivo de Folin Ciocalteu, se dejó en reposo durante 5
minutos, después se añadió 3,5 mL de carbonato de sodio al 20%. Se
agitó fuertemente y se dejó en reposo durante 1 hora a temperatura
ambiente. Finalmente se leyó la absorbancia a 760 nm. Este
procedimiento se realizó por triplicado (± Desviación estándar).
6.9.8. Capacidad Antioxidante

Se pesó 27,6 mg de 2,2-difenilpicrilhidrazil (DPPH), el cual fue transferido a

una fiola de 50 mL, se llevó a volumen con metanol. Luego se tomó una
alícuota de 4 mL y se transfirió a otra fiola de 50 mL, el cual se llevó a
volumen con metanol.
A partir del extracto metanólico seco, se pesó 10 mg y se disolvió con 10 mL

de metanol (solución madre). Se prepararón soluciones de diferentes
concentraciones a partir de alícuotas de la solución madre, con la finalidad
de encontrar su respectivo factor de dilución; dicho factor se observó
mediante la variación del color de púrpura a amarillo.
Conociendo el factor de dilución, a partir de la solución madre se realizaron

diluciones sucesivas de 0,5; 1; 2; 2,5; 4; 5; 7; 8; 10; 15; 18 y 20 mg/L . En
viales ámbar se agregó 100 µL de cada dilución y 4900 µL de DPPH. Se
dejaron reposar en la oscuridad por 30 minutos a temperatura ambiente. Se
midió la absorbancia de cada dilución a 517 nm. 65
A A
%Inhibición
A
Donde:
 A DPPH = Absorbancia del DPPH

 A Muestra = Absorbancia de la muestra con DPPH

55


Además se determinó la concentración requerida para el 50 % de inhibición
del radical DPPH (IC50), calculada mediante la ecuación de la gráfica
Concentración vs % Inhibición. Los resultados son expresados como
porcentaje de IC50 en microgramos/mililitros (± Desviación estándar).
6.9.9. Determinación de la Actividad Antimicrobiana
6.9.9.1. Obtención de cepas

Las cepas utilizadas en la determinación de la actividad antimicrobiana

en el extracto acuoso de las hojas de Muehlenbeckia hastulata
(J.E.Sm) I.M. Johnst, están depositadas en el American Type Culture
Collection (ATCC).
 Escherichia coli (ATCC 25922)

 Salmonella enteritidis (ATCC 13076)
 Candida albicans (ATTC 10231)
 Staphylococcus aureus (ATCC 33862)
6.9.9.2. Medios de cultivo

Se utilizó medios de cultivo ricos que permitieron el crecimiento de los

microorganismos, siendo este agar nutritivo. Se añadió 31 gramos de
agar nutritivo a 1 L de agua destilada, se disolvió en caliente y se
esterilizó mediante el método calor húmedo (ebullición) durante 30
minutos. Se distribuyó en placas Petri previamente esterilizadas a
180 °C durante 45 minutos en una estufa. 66
6.9.9.3. Determinación de la Actividad Antimicrobiana

Se pesó 20 gramos de hojas secas y desengrasadas de Muehlenbeckia

hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst , se añadió 200 mL de agua destilada
previamente calentada a 40 °C, se dejó reposar durante 1 hora y se
filtró, posteriormente se llevó a concentrar a 32 °C durante 4 días. A
partir del extracto se prepararón soluciones de 5%, 15%, 25%, 50% y
75%.

56


Se prepararon los cultivos del microorganismo en caldo nutritivo y se
incubaron por un lapso de 24-48 horas a 37 °C para las bacterias y a
28-30 °C por 24 a 72 horas para hongos y levaduras. Luego empleando
un asa de siembra se inocularon los microorganismos en tubos con
agar nutritivo en plano inclinado y se incubaron por el mismo lapso de
tiempo; estos fueron usados como patrones. Finalmente a partir de los
microorganismos en plano inclinado, empleando un asa de siembra se
inocularon en caldo nutritivo para ser usados.
Con las placas Petri con el agar nutritivo, se realizaron 4 pocillos de 5

mm de diámetro, a partir de los microorganismos presentes en el caldo
nutritivo, con ayuda de un hisopo estéril se extrajo una alícuota y se
sembró por diseminación, sobre el agar nutritivo presente en la placa
Petri, se agregó 100 µL de cada extracto acuoso en cada uno de los
pocillos y se dejó incubar a 37°C durante 24 horas, finalmente se
determinaron los resultados mediante el desarrollo del diámetro del
halo de inhibición del microorganismo en estudio. Este procedimiento
fue realizado por triplicado para cada cepa y para cada concentración
(± Desviación estándar). 66
Diámetro de inhibición mm ‐ Diámetro del disco 5 mm

% Inhibición
Diámetro de inhibición

6.9.10. Determinación de Humedad

A partir de de las hojas frescas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm)

I.M. Johnst, se pesó 6 gramos en un crisol previamente pesado, se
llevó a la estufa a 110 °C durante 2 horas, posteriormente se trasfiere
el crisol a un desecador hasta que se encuentre a temperatura
ambiente, finalmente se llevó a pesar. Este procedimiento fue realizado
por triplicado.
6.9.11. Determinación del contenido de ceniza

Luego de haber sido pesado el crisol para determinar el contenido de

humedad en las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M.
Johnst, se llevó el crisol a la mufla a 550 °C durante 4 horas. Este
procedimiento se realizó por triplicado.

57


6.9.12. Determinación de Metales mediante Absorción Atómica

A partir de los estándares certificados de 1000 mg/L, se realizaron las

curvas de calibración de los siguientes metales: hierro (Fe), zinc (Zn),
sodio (Na), manganeso (Mn), cobre (Cu), plomo (Pb) y cromo (Cr).

Digestión por vía seca:
Se disolvió las cenizas completamente en 5 mL de ácido nítrico

concentrado y 5 mL de agua desionizada (primera digestión hasta casi
sequedad), para la total eliminación de materia orgánica se añadió 2
mL de ácido perclórico (segunda digestión). Se filtró y transfirió a un
matraz volumétrico de 100 mL; se realizó la determinación por el
método de absorción por flama. Este procedimiento se realizó por
triplicado.

58


VII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

7.1. Rendimiento de los Extractos con Solventes de Polaridad Creciente
Se llevó a cabo la determinación del rendimiento en cada extracto, para las

hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, utilizando solventes de
menor a mayor polaridad, siendo estos: n-hexano, cloroformo, acetato de etilo,
etanol y metanol. De acuerdo a los resultados, el extracto metanólico presenta
mayor rendimiento, esto indica que la mayoría de los componentes de las hojas
de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst tienen una mayor afinidad por
los solventes polares. En el caso de los extractos de n-hexano y acetato de etilo
nos indica la presencia de metabolitos secundarios de carácter apolar
confirmando la presencia de saponinas. Mediante estos resultados se determinó
trabajar con extractos metanólicos para el caso de taninos y flavonoides (TABLA
8).
TABLA 8. Rendimiento de los extractos con solventes de polaridad creciente
RENDIMIENTO DE CADA
EXTRACTO (%)
n-HEXANO 3,42
CLOROFORMO 1,82
ACETATO DE ETILO 3,81
ETANOL 4,14
METANOL 8,51

59


7.2. Análisis Fitoquímico de los Extractos Secos con Polaridad Creciente
7.2.1. Saponinas

TABLA 9. Ensayos para la determinación cualitativa de saponinas
EXTRACTO ENSAYOS METABOLITO HOJAS

SECUNDARIO
PRUEBA DE ++
ESPUMA SAPONINA
SALKOWSKI ++
n-HEXANO
VARIANTE A SALKOWSKI ++
SAPONINA ++
VARIANTE B SALKOWSKI ESTEROIDAL
+
LIEBERMANN -
BURCHARD
PRUEBA DE +++
ESPUMA SAPONINA
SALKOWSKI +++
CLOROFORMO
VARIANTE A SALKOWSKI +++
SAPONINA
VARIANTE B SALKOWSKI ESTEROIDAL +++
LIEBERMANN - +++
BURCHARD
PRUEBA DE +++
ESPUMA SAPONINA
SALKOWSKI +++
ACETATO DE VARIANTE A SALKOWSKI +++

ETILO
VARIANTE B SALKOWSKI SAPONINA +++
ESTEROIDAL
LIEBERMANN - +++
BURCHARD

60


7.2.2. Flavonoides
TABLA 10. Ensayos para la determinación cualitativa de flavonoides

EXTRACTO ENSAYOS METAOLITO SECUNDARIO HOJAS
SHINODA FLAVONOIDE ++
FeCl3 COMPUESTOS FENÓLICOS ++

ETANOL
NaOH 20% FLAVONOIDE ++
SHINODA FLAVONOIDE +++
METANOL FeCl3 COMPUESTOS FENÓLICOS +++
NaOH 20% FLAVONOIDE +++
Ausente (-) Pequeñas cantidades (+) Moderado (++) Abundante (+++)

61


7.2.3. Taninos
TABLA 11. Ensayos para la determinación cualitativa de taninos

EXTRACTO ENSAYOS METABOLITO SECUNDARIO HOJAS
GELATINA – NaCl ++
TANINO
FeCl3 ++
ETANOL AGUA DE BROMO ++

TANINO
FORMALDEHÍDO CATÉQUICO ++
ACETATO DE ++
PLOMO
GELATINA – NaCl +++

TANINO
FeCl3 +++
METANOL
AGUA DE BROMO TANINO +++
CATÉQUICO
FORMALDEHÍDO +++
ACETATO DE +++
PLOMO

Ausente (-) Pequeñas cantidades (+) Moderado (++) Abundante (+++)

62


7.2.4. Antocianinas – Betalaínas

TABLA 12. Ensayos para la determinación cualitativa de antocianinas -

betalaínas
EXTRACTO ENSAYOS METABOLITO HOJAS

SECUNDARIO
ADICIÓN DE ÁLCALI FENOLATOS ALCALINOS ++

NaOH 20%
HCl 1N SAL DE OXONIO -
ETANOL AMONÍACO ++
ANTOCIANIINAS
ALCOHOL ISOAMILICO- -
AGUA
ADICIÓN DE ÁLCALI FENOLATOS ALCALINOS +++

NaOH 20%
HCl 1N SAL DE OXONIO -

METANOL
AMONÍACO +++
ANTOCIANIINAS
ALCOHOL ISOAMILICO- -
AGUA

Ausencia (-) Pequeñas cantidades (+) Moderado (++) Abundante (+++)

63


7.2.5. Quinonas

TABLA 13. Ensayos para la determinación cualitativa de quinonas

EXTRACTO ENSAYOS METABOLITO SECUNDARIO HOJAS
NAOH 5% QUINONAS +++

ETANOL
BORNTRÄGER ANTRAQUINONAS -
NAOH 5% QUINONAS ++
METANOL
BORNTRÄGER ANTRAQUINONAS -
Ausencia (-) Pequeñas cantidades (+) Moderado (++) Abundante (+++)

64


El análisis fitoquímico realizado a los extractos con diferentes polaridades

(menor a mayor polaridad), muestra la presencia de saponinas en mayor
proporción en los extractos apolares: n-Hexano, cloroformo y acetato de etilo
(TABLA 9).
Los flavonoides, que poseen un gran número de grupos hidroxilo formando

glicósidos son polares, debido a ello son solubles en solventes ligeramente
polares como el acetato de etilo o en solventes de mayor polaridad como
son el etanol y el metanol; debido a ello es que los flavonoides se
encuentran en mayor abundancia en los extractos etanólicos y metanólico
(TABLA 10). En el caso de los taninos al ser metabolitos polares son mejor
extraídos por solventes de la misma polaridad, es por ello que se muestran
abundantes en extractos alcohólicos (TABLA 11).
De esta manera el análisis fitoquímico nos indica que los metabolitos

presentes en mayor proporción en las hojas de Muehlenbeckia hastulata
(J.E.Sm) I.M. Johns, son las saponinas, taninos y flavonoides.
En el caso de quinonas es posible determinarlas en extractos etanólicos y

metanólicos. Sin embargo todos los extractos son negativos para la
presencia de cumarinas y alcaloides.

65


7.3. Método Espectrofotométrico para la Determinación Cuantitativa de

Flavonoides Totales expresados como Quercetina
Se realizó la determinación cuantitativa de flavonoides totales, ya que este

metabolito es de importancia para la salud de los seres humanos y es el principal
metabolito que brinda las funciones medicinales en la planta, la presencia de
dicho metabolito en las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst
es de 1,70 mg de quercetina por gramo de muestra, sin embargo mediante la
bibliografía se muestra que mediante el método Dowd adaptado por Arvouet -
Grand , Vennat , Pourrat , y Legret ; se obtuvieron valores mayores para la
misma planta, aunque cabe resaltar que la planta procedía de Valparaíso, Chile
según el artículo y sobre todo que es el único artículo encontrado relacionado
con la especie en estudio (TABLA 14). 69; 75
TABLA 14. Determinación cuantitativa de flavonoides totales expresados como

quercetina
EXTRACTO
ETANÓLICO
DETERMINACIÓN HOJAS
FLAVONOIDES TOTALES EXPRESADOS COMO 1,70

QUERCETINA ( mg quercetina / g muestra)
Desviación estándar 0,0746
7.4. Método de Lowenthal para Taninos

Mediante el método de Lowenthal se produce la oxidación de los taninos al

reaccionar con el permanganato de potasio (KMnO4) en presencia del indicador
índigo de carmín, el cual actuó como un regulador de la reacción. Como en la
solución también existen otros compuestos que pueden estar presentes y
oxidarse al producirse la reacción, se realizó una segunda valoración después
de extraer los taninos de la solución, mediante la solución de gelatina saturada
con cloruro de sodio ácido. La cantidad neta de taninos en el extracto acuoso se
obtiene mediante la diferencia entre el valor de la primera y segunda valoración.

66


Como resultado se tiene que la cantidad de taninos en las hojas de
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst se encuentra en menor
proporción (TABLA 15). 68
TABLA 15. Determinación cuantitativa de taninos por el método de Lowenthal
EXTRACTO ETANÓLICO
TANINOS ( g ácido tánico / 100 g muestra) 1,03

7.5. Fenoles Totales

La determinación de fenoles totales es realizada debido a la presencia de

metabolitos secundarios como los taninos y flavonoides, los cuales son
compuestos fenólicos encontrados en las hojas de Muehlenbeckia hastulata
(J.E.Sm) I.M. Johnst. El contenido de compuestos fenólicos en el extracto
metanólico se muestra en la TABLA 16, estos resultados están expresados
como miligramos de ácido gálico por 100 gramos muestra.
A sor a ia vs Co e tra ió

.
ABSORBANCIA
.
.
= . + .
. R² = .
CONCENTRACIÓN pp
GRAFICA 1. Curva de calibración del ácido gálico para la determinación de

fenoles totales en las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst

67


TABLA 16. Determinación de fenoles totales en el las hojas de Muehlenbeckia
hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst
EXTRACTO
METANÓLICO
FENOLES TOTALES ( mg ácido gálico / 100 1,17

g muestra)
7.6. Capacidad Antioxidante
En la determinación de la capacidad antioxidante, se demuestra que para un

extracto metanólico de las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M.
Johnst, se tiene un 91,72% de inhibición del radical DPPH, siendo un valor
aceptable. Además de acuerdo al resultado obtenido de la concentración
inhibitoria (IC50), el cual es de 6,58 µg/mL, el extracto metanólico de las hojas de
esta planta presenta una gran capacidad antioxidante y es por ello que se le
atribuyen las diferentes propiedades medicinales anteriormente mencionadas.
Existe un estudio con el cual se puede comparar estos resultados, ya que

trabajaron con extractos metanólico de las hojas de esta especie; dicho artículo
hace mención a la determinación de la capacidad antioxidante, empleando el
método del radical DPPH, la concentración inhibitoria (IC50) reportada es de
2,19 ± 0,01, dicha muestra presenta una capacidad mayor que el resultado
obtenido en este estudio; sin embargo hay que considerar las condiciones
ambientales en las que se encuentran ambas plantas. 75

68


TABLA 17. Valores de las absorbancias (nm), concentraciones (µg/mL) y
porcentaje de inhibición (%I)
EXTRACTO METANÓLCIO
C (µg/mL) ABSORBANCIA (nm) %I
20 0,09 91,72
18 0,09 91,80
15 0,13 88,84
8 0,55 52,75
5 0,75 36,36
4 0,82 30,43
2 0,97 17,75
1 1,04 11,53
0,5 1,17 0,93
% I vs. C µg/ L
% INHIBICIÓN
CONCENTRACIÓN µg/ L
GRAFICA 2. Gráfica de dispersión, representa % Inhibición vs. Concentración

(µg/mL)

69


% I vs. C µg/ L
% INHIBICIÓN
y = 5.9007x + 6.1513
CONCENTRACIÓN µg/ L
GRAFICA 3. Análisis de regresión lineal para la determinación del parámetro

IC50 (Concentración necesaria para inhibir en un 50% al radical DPPH)
TABLA 18. Concentración inhibitoria (IC50) de DPPH en el extracto metanólico
EXTRACTO METANÓLICO
HOJAS
IC50 (µg/mL) 6.58

70


7.7. Determinación de la Actividad Antimicrobiana

Los microorganismo utilizados fueron seleccionados de acuerdo a un artículo de

referencia, en el cual mencionan que extractos de las ramas producen un efecto
antimicrobiano sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida
albicans. Ya que en este estudio se emplearon las hojas de Muehlenbeckia
hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, se desea determinar si el extracto acuoso de las
hojas presentan una actividad similar contra estos microorganismo; además se
decidió emplear cepas de Salmonella enteritidis. 70
Las cepas de Staphylococcus aureus, bacterias Gram positivas, pueden producir

enfermedades que van desde infecciones cutáneas hasta enfermedades de
riesgo vital, como celulitis, abscesos profundos meningitis, neumonía entre
otros. 71
Las cepas de Escherichia coli, enterobacteria Gram negativa, necesarias para el

buen funcionamiento del proceso digestivo. Sin embargo esta bacteria puede
causar infecciones intestinales generalmente graves, tales como infecciones del
aparato excretor, vías urinarias, cistitis, meningitis entre otras. 72
Al ser Candida albicans un hongo, presente en forma de levadura, es necesario

que al determinar su actividad antimicrobiana se deje incubar por mayor tiempo
(24 a 72 horas) en comparación con las demás cepas, las cuales se podían
observar los resultados luego de 24 horas; normalmente este hongo se
encuentra en la cavidad oral, en el tracto gastrointestinal y en la vagina, este
hongo está envuelto en un rol relevante en la digestión de los azúcares mediante
un proceso de fermentación. Finalmente en el caso de Salmonella enteritidis,
bacteria Gram negativa, es conocido como un patógeno de las aves de
corral. 73; 74

71


TABLA 19. Valores de los diámetros de los halos (Ǿ)
Salmonella enteritidis Staphylococcus aureus
ǾDIÁMETRO DEL HALO (mm)
5% 3,5 ND
15% 4,0 ND
25% 4,5 5,3
50% 7,5 6,0
75% 9,75 7,4
No detectable (ND)
TABLA 20. Porcentaje de inhibición (%I) del extracto acuoso de las hojas de
Salmonella enteritidis Staphylococcus aureus
% Inhibición
5% 28,57 ND
15% 38,00 ND
25% 44,84 53,10
50% 66,67 58,62
75% 74,57 66,22
No detectable (ND)

72


Mediante estos resultados se observa que el extracto acuoso de las hojas de
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, presentan actividad
antimicrobiana sobre Salmonella enteritidis (Gram negativa) y Staphylococcus
aureus (Gram positiva); sin embargo los resultados no fueron favorables para las
cepas de Candida albicans y Escherichia coli (FIGURAS 10, 11 y 12).
De acuerdo al porcentaje de inhibición el extracto acuoso presenta mayor

actividad sobre Salmonella enteritidis desde el 5% hasta el 75%, en el caso de
Staphylococcus aureus la actividad antimicrobiana se produce para altas
concentraciones, por ende no se observó el halo para las concentraciones de
5% y 15% (TABLA 19 Y 20).
FIGURA 10. Ausencia de halos de inhibición frente a Escherichia coli por efecto
del extracto acuoso de las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M.
Johnst

73


FIGURA 11. Halos de inhibición frente a Salmonella enteritidis por efecto del
extracto acuoso de las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst
HALOS DE INHIBICIÓN
FIGURA 12. Halos de inhibición frente a Staphylococcus aureus por efecto del
extracto acuoso de las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst
HALOS DE INHIBICIÓN

74


7.8. Determinación del contenido de Humedad y Ceniza

Las plantas necesitan cierta cantidad de humedad ambiental para poder realizar
la transpiración, mediante el cual expulsan agua a la atmósfera a través de las
estomas encontrados en las hojas. La transpiración vegetal es importante, ya
que la planta necesita absorber agua y nutrientes desde el suelo, además actúa
como un regulador térmico. 76; 77
Las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, fueron traídas

desde Yucay (Urubamba-Cusco) y presentan un porcentaje de humedad de
64,34% (TABLA 21).
TABLA 21. Valores del porcentaje de humedad y cenizas en las hojas de

HUMEDAD (%) CENIZA (%)
HOJAS FRESCAS 64,34 3,3
7.9. Determinación de Metales mediante Absorción Atómica
Los micronutrientes son esenciales para el adecuado crecimiento y desarrollo de

las plantas, cuando existe la deficiencia de uno o varios elementos menores,
estos se convierten en factores limitantes del crecimiento. Se determinó la
concentración de algunos micronutrientes como el hierro (Fe), zinc (Zn), sodio
(Na), Manganeso (Mn) y cobre (Cu) además de dos metales pesados como el
cromo (Cr) y plomo (Pb).
El análisis realizado a las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M.

Johnst, nos muestra que los metales: cobre, cromo y plomo, no han sido
detectados ya que el límite de detección para estos metales es de 0,5 ppm de
acuerdo a la técnica usada (TABLA 22).

75


TABLA 22. Concentración en partes por millón (ppm) de los metales
presentes en las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst
HOJAS (ppm)
Hierro (Fe) 24,2
Zinc (Zn) 7,1
Sodio (Na) 807,9
Manganeso (Mn) 14,5
Cobre (Cu) N.D.
Cromo (Cr) N.D.
Plomo (Pb) N.D.

7.10. TABLA COMPARATIVA

La relación que existe entre los compuestos fenólicos y la capacidad

antioxidante es directamente proporcional (TABLA 23).
TABLA 23. Fenoles totales y capacidad antioxidante en las hojas de

EXTRACTO
METANÓLICO
FENOLES TOTALES (mg ácido gálico/ 100g 1,17

de muestra)
IC50 (µg/mL) 6,58

76


VIII. CONCLUSIONES

 El extracto metanólico presentó mayor rendimiento (8,51 %), es por ello que
se empleó en la determinación de la capacidad antioxidante y en fenoles
totales.
 Se comprueba mediante pruebas cualitativas, empleando las reacciones de

coloración y precipitación para cada metabolito secundario; la presencia de
taninos catéquicos, flavonoides y saponinas esteroidales como metabolitos
secundarios mayoritarios en la muestra de hojas de Muehlenbeckia hastulata
(J.E.Sm) I.M. Johnst.
 Respecto al método espectrofotométrico utilizado para la cuantificación de

flavonoides totales (expresados como quercetina) se obtuvo 1,7 mg de
quercetina en un gramo de muestra seca.
 Mediante el método volumétrico de Lowenthal para la cuantificación de

taninos se obtuvo 1,03 g de taninos en 100 g de muestra seca.
 En fenoles totales se obtuvo 1,17 mg de ácido gálico/ 100 g de muestra, esto

se debe a la presencia de flavonoides y taninos en las hojas de
Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst.
 La concentración requerida para el 50 % de inhibición del radical DPPH (IC50)

fue de 6,58 µg/mL. Cuanto mayor sea el porcentaje de inhibición menor será
el valor del IC50.
 Las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, presentan

actividad antimicrobiana sobre Salmonella enteritidis y Staphylococcus
aureus, bacterias Gram negativa y positiva respectivamente. Sin embargo los
resultados fueron negativos para las cepas de Escherichia coli y Candida
albicans, al ser esta última una levadura la resistencia al ser atacada es
mayor.

77


 En la determinación de minerales, el Hierro con un valor de 24,2 ppm se
encuentra dentro del rango (24 a 20 ppm); sin embargo para el caso de
Manganeso (14,5 ppm), Cobre (menor a 0,5) y Zinc (7,1 ppm) presentan
valores por debajo de los rangos establecidos (TABLA 23), convirtiéndose en
factores limitantes del crecimiento.
 Las hojas de Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst. no presentaron

valores altos de metales pesados como el plomo y cromo ya que estos se
encuentran en concentraciones por debajo de 0,5 ppm.

78


IX. RECOMENDACIONES
 Al concentrar los extractos o someterlos a bañomaría es recomendable

mantener una temperatura menor de 40°C, para evitar la pérdida del
metabolito secundario.
 En la determinación de flavonoides totales, es recomendable preparar las

soluciones al instante, ya que se trabaja con soluciones de etanol al 50% y
96%, por acción del calor la concentración de las muestras puede variar,
sobre todo si no son llevadas a leer el mismo día.
 En la determinación de fenoles totales es recomendable utilizar soluciones

recién preparadas de Folin- Ciocalteu ya que este reactivo es fotosensible, de
lo contrario afectaría en los resultados obtenidos.
 Realizar la lectura de la solución del DPPH al inicio del análisis, ya que para
la determinación de la actividad antioxidante se recomienda una absorbancia
en el rango de 1 nm a 1,4 nm.
 En la determinación de la capacidad antioxidante, leer las muestras con el

DPPH, exactamente luego de haber culminado el tiempo de reposo (30
minutos) para obtener buenos resultados.
 En la determinación de la actividad antimicrobiana es recomendable trabajar

con un solo tipo de cepa y en un ambiente esterilizado para evitar la
contaminación cruzada y verificar el pH de la solución de agar nutritivo.
 Se recomienda el análisis de metales pesados por una técnica diferente a la

de Flama, ya que la Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, crece a
orillas del río Urubamba.
 Se recomienda la continuación de la investigación de Muehlenbeckia

hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst, ya que es muy utilizada para diferentes
tratamientos médicos; no solo las hojas son beneficiosos sino también las
raíces, flores y frutos presentan diferentes usos como el teñido artesanal.
Recomiendo continuar el estudio de esta especie en flores, frutos y raíces,
porque no presenta mucha investigación en nuestro país a pesar de ser una
planta oriunda del Perú.

79


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77. AGUA E HIDRATACIÓN: BASES FISIOLÓGICAS EN ADULTOS-

EQUILIBRIO HÍDRICO. Disponible en:
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hidratacion/hidratacion-para-los-adultos/equilibrio-hidrico
78. MICRONUTRIENTES EN LA FISIOLOGPIA DE LAS PLANTAS:

FUNCIONES, ABSORCIÓN Y MOVILIDAD. Disponible en:
http://www.ipni.net/publication/ia-
lahp.nsf/0/3FA84D0333FEDEAA852579A0006BF733/$FILE/Micronutrientes%
20en%20la%20Fisiolog%C3%ADa%20de%20las%20Plantas.pdf

87


XI. ANEXO

11.1. Análisis Estadístico

11.1.1. Determinación de Flavonoides Totales

En la Tabla 26, presento los valores de la media, varianza, desviación

estándar, coeficiente de variación y error estándar para la determinación de
flavonoides totales en el extracto etanólico de las hojas de Muehlenbeckia
hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst.
TABLA 24. Resultados estadísticos para la determinación de Flavonoides

Totales
EXTRACTO ETANÓLICO
Media 1,67
Varianza 0,0056
Coeficiente de Variación 0,04467
Error Estándar 0,0304

11.1.2. Determinación de Taninos por el Método de Lowenthal


Taninos por el Método de Lowenthal, en el extracto acuoso de las hojas de

88


TABLA 25. Resultados estadísticos para la determinación de Taninos
EXTRACTO ACUOSO
Media 1,03
Varianza 0,0184

11.1.3. Determinación de Fenoles totales


Fenoles totales en el extracto metanólico de las hojas de Muehlenbeckia
hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst.
TABLA 26. Resultados estadísticos para la determinación de fenoles totales
Media 1,17
Varianza 0,0001667

89


11.1.4. Determinación de la Capacidad Antioxidante


la capacidad antioxidante en el extracto metanólico de las hojas de
TABLA 27. Resultados estadísticos para la determinación la capacidad

antioxidante
Media 6,30
Varianza 0,0446

11.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana

En la Tabla 30 y 31, presento los valores de la media, varianza, desviación

la actividad antimicrobiana en el extracto acuoso de las hojas de

90


antimicrobiana sobre Salmonella enteritidis
Salmonella enteritidis
Concentración 5% 15% 25% 50% 75%
Media 28,57 38 44,84 66,67 74,57
Varianza 0 0,5135 0,3254 0 0,0910
Desviación estándar 0 0,7165 0,5704 0 0,3017
Coeficiente de Variación 0 0,0188 0,0127 0 0,0040
Error Estándar 0 0,4137 0,3293 0 0,1742


antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Concentración 25% 50% 75%
Media 53,10 58,62 66,22
Varianza 1,0368 0,1094 0,1028
Desviación estándar 1,0182 0,3307 0,3206
Coeficiente de Variación 0,0192 0,0056 0,0048
Error Estándar 0,5878 0,1909 0,1850

91


11.2. Análisis Fitoquímico

11.2.1. Saponinas

Análisis fitoquímico para saponinas en los extractos con diferentes solventes

(FIGURA 13, 14 y 15).
FIGURA 13. Análisis fitoquímico para Saponinas en el extracto clorofórmico
FIGURA 14. Análisis fitoquímico para Saponinas en el extracto hexánico

92


FIGURA 15. Análisis fitoquímico para Saponinas en los extracto de acetato

de etilo, etanol y metanol
11.2.2. Flavonoides

Análisis fitoquímico para flavonoides en los extractos con diferentes

solventes (FIGURA 16).
FIGURA 16. Análisis fitoquímico para Flavonoides para los extractos de

acetato de etilo, etanol y metanol

93


11.2.3. Taninos
Análisis fitoquímico para flavonoides en los extractos con diferentes

solventes (FIGURA 17 y 18).
FIGURA 17. Análisis fitoquímico para Taninos en los extracto de acetato de

etilo, etanol y metanol
FIGURA 18. Reacción con formaldehído para Taninos en los extracto de

acetato de etilo, etanol y metanol

94


11.3. Determinación de Flavonoides Totales

FIGURA 19. Extracción de flavonoides mediante la técnica de reflujo

utilizando ácido sulfúrico al 10% y etanol al 50%
FIGURA 20. Muestras para la determinación de flavonoides totales

95


11.4. Determinación de la Capacidad Antioxidante

FIGURA 21. Prueba cualitativa para determinar el factor de dilución
FIGURA 22. Confrontación de la muestra con el DPPH

96

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA

Análisis fitoquímico, determinación cualitativa y

VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ........................................................45

VII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................59

TABLA 1. Propiedades atribuidas a la Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M.

A la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por darme la oportunidad de

Me gustaría agradecer a mis profesores durante toda mi carrera profesional porque

Así mismo me gustaría agradecer a la directora de la Unidad de Servicios de

Y por último mi compañero de laboratorio y colega Jesús Ochoa por brindarme su

Para ellos: Muchas Gracias.

Esta especie fue recolectada en el distrito de Yucay, provincia de Urubamba en el

Mediante la determinación de flavonoides totales, se cuantificaron los flavonoides

Al corroborar la presencia de estos metabolitos secundarios, se llevó a cabo la

Con la finalidad de dar una mayor contribución al conocimiento se realizaron

Por último se determinó el porcentaje de humedad (64.34 %) y cenizas (3.3 %) en

La Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst es una de las plantas con

A través de artículos se sabe que la Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst

Los Taninos cumplen la función de protectores, evitando el ataque de insectos y

Esta investigación está dirigida a determinar tanto cualitativamente como

En el Perú la Mullaca es una planta con pocas referencias bibliográficas; sin

3.1. Objetivo General

Realizar un análisis fitoquímico, extracción, purificación y desarrollo de métodos de

3.2. Objetivos Específicos

La presencia de Flavonoides y Taninos serán los responsables de las propiedades

5.1. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I. M. Johnst

Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I. M. Johnst es una especie botánica, que

5.1.1. Descripción Botánica

Es un arbusto liso, con tallos rojizos, flexuosos de 1 a 2 m de altura. Presenta

FIGURA 1. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M. Johnst colectada, Muehlenbeckia

Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst se puede encontrar en el

FIGURA 2. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M. Johnst Yucay-Urubamba, Cusco.

5.1.3. Propiedades Medicinales

Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst no se cultiva ni se ha

5.1.4. Clasificación Botánica

De acuerdo a la Clasificación de James Edward Smith e Ivan Murray

Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst

Especie hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst.

FIGURA 2. Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm.) I.M. Johnst

5.2. Metabolitos Primarios y Secundarios

Cualquier organismo viviente contiene en su estructura productos químicos, en

Los compuestos orgánicos que se encuentran en los organismos vivos se

TABLA 2. Diferencias entre los metabolitos primarios y secundarios

METABOLITOS PRIMARIOS METABOLITOS SECUNDARIOS

Ampliamente distribuido en Biosintetizados a partir del

Distribución taxonómica no Distribución taxonómica

Indispensables para la vida No indispensables para la vida

Aminoácidos de proteínas, Saponinas, Alcaloides, Taninos,

5.2.2. Funciones que cumplen los metabolitos secundarios en las plantas

Todas las sustancias que el hombre ha obtenido a partir de las plantas y a

Los flavonoides forman parte de una clase muy abundante de productos

Los anillos son denominados A, B y C; los átomos de carbono individuales son

Los flavonoides suelen presentar al menos tres hidroxilos fenólicos y se

FIGURA 3. Estructura básica del esqueleto flavonólico

Varios subgrupos de flavonoides son clasificados de acuerdo con la

FIGURA 4. Estructura central del esqueleto flavonólico de los principales

5.3.2. Funciones y Propiedades

Las propiedades físicas dependen de la clase y la forma del flavonoide (libre,