Juan Manuel Hilarión Eslava

Carlos Felipe Alonso Contreras

Evaluación del Producto obtenido mediante fermentación sólida siguiendo el Manual

de Cenicafé por Trichoderma Harzianum

*Laboratorios, Universidad de La Sabana, Chía, Cundinamarca-Colombia, 27 de marzo del 2017.

Abstract Introducción
The present article it was determined by solid El género Trichoderma posee buenas cualidades
fermentation, products from Trichoderma para el control de enfermedades en plantas
harzianum which were grown on rice. The fungus causadas por patógenos fúngicos del suelo,
was grown on rice after preparing a solution and principalmente de los géneros Phytophthora,
allowed to grow the fungus for a week. Following Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium y Fusarium entre
the manual of cenicafe, for quality control of otros. Las especies de Trichoderma actúan como
Trichoderma harzianum taking microscopic to hiperparásitos competitivos que producen
calculate the amount of conidia in watching shows metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas a
Newbauer chamber samples, germination capacity los que se les atribuyen los cambios estructurales a
and purity percentage. Finally, the sample was nivel celular, tales como vacuolización,
grown on water agar and PDA, observing changes granulación, desintegración del citoplasma y lisis
that had every 24 hours for five days. celular, encontrados en los organismos con los que
interactúa (Mohammed E., Pérez C., Ahmed Sid.,
Requena M., Candela M., 2004).
Resumen
En el presente trabajo se determinó mediante Las especies del género Trichoderma son los
antagonistas más utilizados para el control de
fermentación sólida, unos productos a partir de
enfermedades de plantas producidos por hongos,
Trichoderma harzianum que fueron cultivados en debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser
arroz. El hongo se cultivó en el arroz después de aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un
haber preparado unas soluciones y se dejó crecer gran número de sustratos y a que no atacan a
el hongo por una semana. Siguiendo el manual de plantas superiores (Papavizas et al. 1982).
cenicafé para el control de calidad del Trichoderma
harzianum tomando muestras microscópicas para El arroz original es rico en aceite que a su vez es
calcular la cantidad de conidios en la muestra rico en vitamina E. Este aceite tiene un alto
observándolos en la cámara de Newbauer, contenido en ácido linoleico por lo que se enrancia
capacidad germinativa y porcentaje de pureza. muy fácilmente (Otálora, 2001). Permitiendo el
Finalmente, se cultivó la muestra en agar de agua crecimiento del hongo
y en PDA, observando los cambios que tenía cada
La estructura química del almidón es relativamente
24 horas por cinco días.
sencilla comparada con otros sustratos.
Esencialmente el almidón está compuesto de dos
polímeros relacionados en diferentes proporciones:
Palabras Clave: Trichoderma harzianum, cámara amilosa (16-30%) y amilopectina (68-85%). De esta
de newbauer, arroz, fermentación sólida, Agar de manera Trichoderma sp., hidroliza el polímero del
agua, agar PDA. almidon mediante enzimas como glucoamilasas, α-
amilasas, β-amilasas, pululanasas e isoamilasas
(Raimbault, 1998), obteniendo moléculas libres de
glucosa, las cuales son fáciles de asimilar,
permitiendo el crecimiento micelial y la producción
de conidios, al mismo tiempo se producen acidos
organicos producto del desarrollo del Determinación del porcentaje de germinación
microorganismo los cuales influyen en la de conidios
disminución gradual del pH (Otalora & Col, 2001).
Se tomó una muestra de la dilución de 10-2 y se
Metodología depositó en una caja de Petri con agar PDA como
se muestra en la figura 1 y se incubo por 24 horas.
Reactivación de la cepa a partir del banco En la zona donde se agregaron las alícuotas sobre
primario el agar, se agregó una gota de azul de lactofenol y
Se adiciono 19 mL de agua con tweem 80 al 0.1% dichas zonas se cortaron con un bisturí en
(v/v) a la caja con T. Harzianum, se le colocó cuadrados de 1 cm x 1 cm. Los cuadros se
perlas de vidrio dentro de la caja de Petri y con una colocaron en una laminilla y posteriormente se
aguja de disección, se desprendió por remoción miraron en el microscopio contando 100 conidios
física los conidios de la caja. Con ayuda de una por zona registrando los germinados y no
pipeta Pasteur se transfirió la totalidad de la germinados, se realizaron los cálculos que se
solución concentrada a un tubo de ensayo. muestran en la parte de análisis y resultados.

Recuento de conidios/mL en cámara de

Newbauer
A partir de la solución concentrada obtenida con
anterioridad, se realizan diluciones de 10-1, 10-2, 10-
3
. Posteriormente se tomó una muestra pequeña de
la dilución número dos y se realizó el conteo,
contando los conidios que se encuentras en las
cuadriculas de los extremos (esquinas) y la del
Figura 1. Solución diluida en agar PDA
centro, para realizar el cálculo se alude a la
siguiente ecuación: Determinación del porcentaje de pureza
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 ∑ 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑥 1/𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 Se tomaron las diluciones 10-2 y se sembró sobre
3
=
𝑚𝑚 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 5/25 una superficie de agar PDA, se incubo por siete
días para verificar la presencia de microorganismos
Inoculación del arroz en bandejas de aluminio
contaminantes.
como sustrato solido
Análisis y resultados
Bajo condiciones estériles, se inoculo la totalidad
de la solución concentrada de conidios, se Caracterización macroscópica y microscópica
distribuyó uniformemente sobre el sustrato y se
tapó, se incubo por 8 días a temperatura ambiente.
Determinación del número de conidios/g de
producto
Bajo condiciones estériles se retiró la tapa de la
caja con sustrato y solución concentrada, se
retiraron los conidios por medio de filtración usando
un colador y gasa en un vaso de precipitado. A
partir de la solución filtrada, se realizaron
diluciones desde 10-1 hasta 10-8, se eligió la
dilución de 10-2 para realizar conteo en cámara, al
obtener un conteo de conidios/mL, se aludió a la
siguiente ecuación para obtener los conidios/g: Fermentación solida por Trichoderma Harzianum

𝐶𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 Inicialmente se observa sobre el arroz un moho

𝐶𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑚𝐿 𝑥 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 color blanco, pero con el paso del tiempo en la
=
𝑔 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 incubación del hongo, este torna a ser verde, esto
se debe a que los conidios de la T. harzianum son
de este color tras el proceso de la esporulación fermentación solida fue eficaz (Romero-Arenas,
para su propia reproducción (Universidad Nacional Lara, Huato, & Hernández, 2009).
de Córdoba). Cabe destacar que esta especie
generalmente prefiere un pH correspondido entre
4.5 - 5, y además se desarrolla en condiciones
ambientales de alta humedad con posibles
estancamientos de CO2 en la atmosfera en la que
se encuentra (Rivera 1993).

Estructura microscópica de la Trichoderma Harzianum

(resultado obtenido en el laboratorio de La Sabana)

Recuento de conidios en cámara de Newbauer

Para realizar el conteo en la cámara se hizo uso de
una de las diluciones preparadas a partir de la
solución concentrada dando como resultado lo
siguiente:
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 427/10−2
=
𝑚𝑚3 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 5/25
= 2,13500000𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝑚3
Estructura microscópica de la Trichoderma Harzianum
(Romero-Arenas, Lara, Huato, & Hernández, 2009).

Dando como resultado en la dilución de 10-2 un

Los conidios son de color verde como se nombró total de 213500 conidios por milímetro cubico.
anteriormente, estos presentan diversas
ramificaciones perpendiculares con formas
piramidales y sus fiálides (células terminales de los Determinación de número de conidios/g de
conidióforos que constituyen el soporte de los producto
conidios) son largas y delgadas. Los conidióforos
Para cuantificación de conidios por gramo de
presentan tamaños de 62.5-69 x 3-4.7 m, las
producto se hace uso de la siguiente ecuación:
fiálides tienen tamaños de 6.3-15.6 x 2.7-3.4 m y
los verticilos constan de un tamaño de 3.8-4 x 3.1- 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑥 𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒
3.7 m según estudios realizados por otros = 𝑚𝑙
investigadores (Gilchrist, 2005). 𝑔 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

Como se puede observar en la imagen a Para obtener los conidios por ml se usa el siguiente
continuación. Se obtuvo dicha imagen factor de conversión:
microscópica en el laboratorio de la Universidad de 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 1000 𝑚𝑚3 1 𝑐𝑚3
5
La Sabana, donde dicha muestra tiene apariencia 2,13500000𝑥10 𝑥 𝑥
𝑚𝑚3 1 𝑐𝑚3 1 𝑚𝑙
similar en comparación con la teórica, por lo que se = 213500000 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝑙
puede deducir que la esporulación de la
Aplicando la ecuación de conidios por gramo del
producto se obtienen 1,60125000x108 conidios/g,
esta es la cantidad obtenida por gramo del sustrato
manejado en el laboratorio.
Determinación de porcentaje de germinación
La Trichoderma Harzianum como la mayoría de los
hongos se reproduce de forma asexual, realizando
el proceso de esporulación para su reproducción.
En el momento de la esporulación no todos los
conidios germinan para que el hongo crezca, por
ende, el 100% de ellos no contribuyen a la
reproducción del hongo, siendo esto se realizó el
cálculo correspondiente para determinar el
porcentaje de germinación de dicho hongo tratado Alícuota en agar No.1
en el laboratorio, obteniéndose el siguiente
resultado junto con su correspondiente calculo
(Rifai, 1969)

280 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠

𝑥 100%
500 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑦 𝑛𝑜 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠
= 56%
Como se muestra en la ecuación anterior, se
obtuvieron 280 conidios germinados en las 5
muestras de alícuotas en agar (cultivo) de un total
de 500 conidios germinados y no germinados,
dando como resultado un 56% de germinación. El
valor permitido de germinación es 85%, el valor
obtenido es más bajo y puede deberse a que las Alícuota en agar No. 2
condiciones ambientales como humedad en las
que se encontraba el hongo pudieron no haber sido
adecuadas (Hoog, 2000). Este organismo trabaja
mejor en condiciones con poca humedad, por
ende, la Trichoderma posiblemente se encontraba
en un ambiente con altas cantidades de agua o
siendo este un organismo heterótrofo (organismos
que requieren materia orgánica para la obtención
de energía y a partir de ella, realizar sus procesos
biológicos) no obtuvo la suficiente energía para su
reproducción, disminuyendo la posibilidad de un
crecimiento adecuado del mismo (Chávez, 2006)
El valor del conteo de conidios se obtuvo a partir
de las muestras en agar que se pueden observar a
continuación: Alícuota en agar No. 3
 logre esparcirse sobre una muestra para realizar el
proceso de la fermentación sólida.

Conidios vs Pureza vs Germinación

120 1.80E+08

1.60E+08
100
1.40E+08

% Pureza y Germinación
80 1.20E+08

Conidios/g
1.00E+08
60
8.00E+07

40 6.00E+07

Alícuota en agar No. 4 4.00E+07

20
2.00E+07

0 0.00E+00
Conidios/g Pureza Germinación

Conclusiones
La morfología de trichoderma harzianum se
caracteriza por un desarrollo temprano rápido en
materiales orgánicos y de cultivo y que al ser
cultivados generan un hongos rápidamente en el
medio de cultivo y dependiendo de la humedad se
desarrollan más rápido.

El porcentaje de germinación no fue el esperado ya

que se esperaba un porcentaje mayor al 85%, por
lo que probablemente se tomó una dilución en la
Alícuota en agar No. 5 que no habían suficientes conidios desarrollados
Determinación de la pureza en la muestra para que diera el porcentaje esperado o no
crecieron adecuadamente debido a las condiciones
No se tomaron en cuenta los UFC/ml de T. ambientales
harzianum ya que no existen agentes
contaminantes en la muestra, esto se notó ya que No hubo contaminación en el agar-PDA y que no
en el cultivo sobre agar de PDA creció se evidenciaba presencia e contaminantes por lo
exclusivamente el hongo con color blanco sin notar que el porcentaje de 100% de pureza está bien
definido.
algún otro color en particular, con esto se pudo
deducir que la muestra no estaba contaminada y Se obtuvo una fermentación solida bastante
su pureza se ve reflejada alrededor del 100%. desarrollada ya que se pudo comprobar mediante
(Lorito, 1993) el análisis microscópico de la muestra que se
generan bastantes conidios germinados y no
Representación Gráfica de los resultados
germinados en Trichoderma harzianum.
En la siguiente grafica se puede observar el
comportamiento de los resultados obtenidos a
Bibliografía
partir de la práctica de laboratorio, donde se
deduce que a pesar de haber obtenido una Papavizas GC, Lewis JA & Abd-Elmoity TH. 1982.
germinación con un porcentaje bastante bajo, se Evaluation of new biotypes of Trichoderma
logró adquirir una buena cantidad de conidios y así harzianum for tolerance to Benomyl and enhanced
lograr que el hongo tenga un crecimiento positivo y biocontrol capabilities. Phytopathology 72: 126-132.
Mohammed E., Pérez Sánchez C., Ahmed S.,
Requena M., Candela M., (2004). Trichoderma
harzianum como biofungicida para el biocontrol de
Phytophthora capsici en plantas de pimiento
(Capsicum annuum L.). Departamento de Biología
Vegetal, Facultad de Biología, Universidad de
Murcia, España. Pg 37.
Otalora A., Martinez M., Pedroza A., (2001).
Evaluacion de medios de cultivo alternos para la
producción de Trichoderma harzianum. Trabajo de
Grado, Microbiología industrial, Pontificia
Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
Raimbult M., (1998). General and microbiological
aspect of solid substrate fermentation. Electronical
Journal of Biotechnology. Vol 1. N.3 pg 1-15.
Rivera, M. 1993. Estudio sobre la compatibilidad
del hongo Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. con
formulaciones comerciales de fungicidas e
insecitidas. Rev. Col. Entomol. 19(4):151-158.
Lorito M, Harman GE, Hayes CK, Broadway RM,
Transmo A, Woo SL & Di Pietro A. 1993.
Chitinolytic enzymes produced by Trichoderma
harzianum: Antifungal activity of purified
endochitinase and chitobiosidase. Phytopathology
83: pg 302-307.
Chavez Garcia, P., (2006). Produccion de
Trichoderma sp. Y evaluación de su efecto en un
cultivo de Crisantemo. Facultad de Ciencias,
Pontificia Universidad Javeriana, Colombia. Pg 15.
Rifai. M. A 1969. A revision of the genus
Trichoderma. Mycological Papers. Pg 116: 1156.
Hoog, G.S.; Guarro, J.; Gene, J. and Figueras, M.J.
2000, atlas de hongos clínicos, 2 a ed. Ed. CBS
Utrece y the Netherland 2: pg. 1-1126.
Gilchrist. S, L., G; Fuentes. D, C; Martínez, C, R.
M; López, A, E; Duveiller, R. P; Singh, M.
Henry e I. García A. 2005. Guía práctica
para la identificación de algunas
enfermedades de trigo y cebada. Segunda
edición. México, D.F.: CIMMYT.
Romero-Arenas, O., Lara, M. H., Huato, M. A., &
Hernández, F. D. (2009). Caracteristicas de
Trichoderma Harzianum, como agente
limitante en el cultivo de hongos
comestibles. Bogotá: Universidad Nacional .