Protocolo de Extraccion de ADN Bacteriano Kit Promega Español

Descripción
El kit de purificación de ADN genético Wizard® se basa en cuatro pasos (1). El

primer paso en el procedimiento de purificación consiste en lisar las células y los
núcleos. Se puede incluir un paso de digestión con RNasa. Luego, las proteínas
celulares se eliminan mediante una etapa de precipitación con sal, que precipita las
proteínas pero deja el ADN genómico de alto peso molecular en
solución. Finalmente, el ADN genómico se concentra y desala por precipitación con
isopropanol. El ADN purificado con este sistema es adecuado para una variedad de
aplicaciones, incluyendo amplificación, digestión con endonucleasas de restricción
e hibridaciones de membrana.
Aislamiento del ADN genómico de bacterias Grampositivas y Gramnegativas
Materiales a ser suministrados por el usuario
• Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
• Baño de María, 80 ° C
• Baño de María, 37 ° C
• isopropanol , temperatura ambiente
• 70% etanol, temperatura ambiente.
• Baño de María, 65 ° C (opcional; para una rápida rehidratación del ADN)
• 50 mM EDTA (pH 8.0) (para bacterias Gram positivas)
• 10 mg / ml de lisozima (para bacterias Gram positivas) también llamada
muramidasa que daña las células bacterianas catalizando la hidrólisis de las
uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-
glucosamina en un peptidoglicano
• 10mg / ml lysostaphin (para bacterias Gram positivas) es una endopeptidasa o
endoproteinasa son peptidasas proteolíticas que rompen los enlaces peptídicos de
los aminoácidos no terminales (es decir, dentro de la molécula)
1. Agregue 1 ml de un cultivo fresco a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.

2. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 2 minutos para sedimentar las
células. Retire el sobrenadante.
3. Resuspender las células completamente en 480μl de EDTA 50 mM.
4. Agregue la(s) enzima(s) lítica(s) apropiada(s) al sedimento celular resuspendido
en un volumen total de 120μl, y suavemente pipetear para mezclar. El propósito de
este tratamiento previo es debilitar la pared celular para que se pueda realizar una
lisis celular eficaz.
Nota: Para ciertas especies de Staphylococcus, se requiere una mezcla de 60 μl de
lisozima de 10 mg/ml y 60 μl de Lysostaphin de 10 mg/ml para una lisis eficiente. Sin
embargo, muchas cepas bacterianas Gram positivas (por ejemplo, Bacillus subtilis,
Micrococcus luteus, Nocardia otitidiscaviarum, Rhodococcus rhodochrous y
Brevibacterium albidium) se lisan de manera eficiente utilizando la lisozima sola.
5. Incube la muestra a 37 ° C durante 30–60 minutos. Centrifugar durante 2 minutos
a 13,000–16,000 × g y eliminar el sobrenadante.
6. Añadir 600μl de solución de lisis de núcleos. Pipetee suavemente hasta que las
células se vuelvan a resuspender.
7. Incubar a 80 ° C durante 5 minutos para lisar las células; Luego enfriar a
temperatura ambiente.
8. Agregue 3μl de solución de ARNasa al lisado celular. Invierta el tubo de 2 a 5
veces para mezclar.
9. Incubar a 37 ° C durante 15–60 minutos. Enfriar la muestra a temperatura
ambiente.
10. Agregue 200μl de Solución de Precipitación de Proteínas al lisado celular tratado
con RNasa. Agite vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos para
mezclar la Solución de precipitación de proteínas con el lisado celular.
11. Incubar la muestra en hielo durante 5 minutos.
12. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 3 minutos.
13. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo limpio de
microcentrífuga de 1.5 ml que contiene 600μl de isopropanol a temperatura
ambiente.
Nota: Puede quedar algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el
sedimento de proteínas. Deje este líquido residual en el tubo para evitar contaminar
la solución de ADN con la proteína precipitada.
14. Mezclar suavemente por inversión hasta que las hebras de ADN formen una
masa visible.
15. Centrifugar a 13,000–16,000×g durante 2 minutos.
16. Vierta cuidadosamente el sobrenadante y drene el tubo en papel absorbente
limpio. Agregue 600μl de etanol al 70% a temperatura ambiente e invierta
suavemente el tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN.
17. Centrifugar a 13,000–16,000×g durante 2 minutos. Aspirar cuidadosamente el
etanol.
18. Vacíe el tubo en un papel absorbente limpio y deje que el sedimento se seque
al aire durante 10–15 minutos.
19. Agregue 100μl de solución de rehidratación de ADN al tubo y rehidrate el ADN
incubando a 65 ° C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución golpeando
suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución a
temperatura ambiente o a 4 ° C.
20. Almacenar el ADN a 2–8 ° C.
DATOS ADICIONALES AL PROTOCOLO

- Rendimiento pobre de ADN usando protocolo de bacterias Gram
positivo
Cultivos crecidos por un tiempo prolongado contienen una alta proporción de células
que se lisan fácilmente tras la exposición al tratamiento con lisostafina. Iniciar las
purificaciones con un cultivo fresco.
- Sin pellet de proteínas
La muestra no se enfrió a temperatura ambiente antes de agregar la solución de
precipitación proteica. Enfriar la muestra a temperatura ambiente (al menos 5
minutos) o enfriar en hielo durante 5 minutos, agitar por 20 segundos, centrifugar
durante 3 minutos a 13,000–16,000× g (10 minutos a 2,000 × g para un volumen de
muestra de 3 ml) y continúe con el protocolo. La Solución de Precipitación de
Proteínas no se mezcló completamente con el lisado nuclear. Mezcle siempre el
lisado nuclear y la solución de precipitación proteica completamente.
- Pellet de ADN difícil de disolver.
Las muestras pueden haber sido secadas en exceso. Rehidrate el ADN incubando 1
hora a 65 ° C y luego limpie la muestra a temperatura ambiente o 4 ° C durante la
noche. Precaución: No dejar el ADN a 65 ° C. durante la noche. Las muestras no se
mezclaron durante la etapa de rehidratación. Recuerda Mezclar las muestras
periódicamente durante la etapa de rehidratación.
- RNasa A
Disuelva la RNasa A a 4 mg/ml en la Solución rehidratación del ADN, hervir 10
minutos para eliminar las ADNasas contaminantes y almacenar en alícuotas a –20
° C.
- Composición de Buffersy soluciones.
- Solución de Rehidratación de ADN
Tris- HCl 10 mM (pH 7,4)
EDTA 1 mM (pH 8,0)
- Condiciones de almacenamiento: Guarde el Kit de purificación de ADN
genético Wizard® a temperatura ambiente (15–30 ° C).
RENDIMIENTO TRATAMIENTO
ESPECIE Y MATERIAL CANTIDAD
DE ADN CON RNasa
Bacteria Gram Positiva
Staphylococcus epidermis
1 ml 6–13μg Requerido
Cultivo fresco, ~3.5 × 108
cells/ml

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1. Agregue 1 ml de un cultivo fresco a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.

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