El documento describe un experimento que demuestra cómo el pH y la temperatura afectan la velocidad de la reacción enzimática de la amilasa salival. Los resultados mostraron que la actividad enzimática máxima ocurre a pH 6.8-7 y a 37°C, que es la temperatura corporal óptima. Esto confirma que factores como el pH y la temperatura influyen en la velocidad de reacción de las enzimas.
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El documento describe un experimento que demuestra cómo el pH y la temperatura afectan la velocidad de la reacción enzimática de la amilasa salival. Los resultados mostraron que la actividad enzimática máxima ocurre a pH 6.8-7 y a 37°C, que es la temperatura corporal óptima. Esto confirma que factores como el pH y la temperatura influyen en la velocidad de reacción de las enzimas.
El documento describe un experimento que demuestra cómo el pH y la temperatura afectan la velocidad de la reacción enzimática de la amilasa salival. Los resultados mostraron que la actividad enzimática máxima ocurre a pH 6.8-7 y a 37°C, que es la temperatura corporal óptima. Esto confirma que factores como el pH y la temperatura influyen en la velocidad de reacción de las enzimas.
El documento describe un experimento que demuestra cómo el pH y la temperatura afectan la velocidad de la reacción enzimática de la amilasa salival. Los resultados mostraron que la actividad enzimática máxima ocurre a pH 6.8-7 y a 37°C, que es la temperatura corporal óptima. Esto confirma que factores como el pH y la temperatura influyen en la velocidad de reacción de las enzimas.
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PRACTICA DE LABORATORIO N°3
DEMOSTRACIÓN DEL EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA
I. INTRODUCCION:
Los seres vivos pueden considerarse fábricas bioquímicas formadas por constelaciones integradas de máquinas moleculares que operan con eficiencia. De todas las clases de máquinas moleculares, las enzimas son sin duda las más importantes. Sin sus capacidades catalíticas, la mayor parte de las miles de reacciones bioquímicas que sustentan los procesos vitales ocurrirían a velocidades muy bajas. (Berg, Tymoczko y Stryer (2003) Boquimica. 5° ed. España: Editorial Reverte, S.A)
La temperatura afecta todas las reacciones químicas. En general, cuanto mayor sea, tanto mayor será la velocidad de reacción; es decir, es mayor el número de colisiones. La velocidad de reacción incrementa debido a que hay más moléculas con la energía suficiente para entrar en el estado de transición. Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas también aumentan con la temperatura. Sin embargo, las enzimas son proteínas que se desnaturalizan a temperaturas elevadas. La temperatura óptima de una enzima, que es la temperatura a la que actúa con su máxima eficiencia, se determina en el laboratorio en condiciones específicas de pH, de fuerza iónica y de concentraciones de solutos. En los seres vivos no hay una única temperatura óptima definible para las enzimas. (Lenheniger David, Cox Michael (2009) Principios De Bioquímica. 5° ed. Barcelona: Ediciones Omega, S.A.)
La concentración de iones hidrógeno, expresada como un valor de pH, afecta a las
enzimas de diversas formas. En primer lugar, la actividad catalítica está relacionada con el estado iónico del sitio activo. Las variaciones de la concentración de iones hidrógeno pueden afectar a la ionización de los grupos del sitio activo. En segundo lugar, los cambios de los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Los cambios drásticos del pH a menudo provocan desnaturalización. (Lenheniger David, Cox Michael (2009) Principios De Bioquímica. 5° ed. Barcelona: Ediciones Omega, S.A.)
Las enzimas permiten las reacciones en las condiciones de temperatura, presión y pH
propios del medio intracelular, reduciendo la energía de activación necesaria para que se produzca la reacción. Las enzimas no experimentan cambios estructurales al final del proceso químico que catalizan.
El objetivo del realice de este experimento es demostrar el efecto o influencia del pH y
la temperatura sobre la velocidad de reacción de la enzima, para ello se usó la amilasa salival, una enzima que escinde hidrolíticamente los enlaces glicosídicos α 1-4 del almidón, el cual se usó como sustrato y se determinó las variaciones del mismo según procedimientos de identificación y cuantificación de sustrato residual, para ello se usó solución yodada.
II. MATERIALES Y METODO:
Para el desarrollo del experimento, se necesitó como material biológico a la amilasa
salival y el almidón como sustrato, previamente procesada y refrigerada. Entre los materiales y equipo de laboratorio se usó catorce tubos de ensayo de 13 x 100 mm, pipetas de 1ml, 2ml, 5ml y 10ml, pizeta con agua destilada, además de un Baño María a las temperaturas aproximadamente de 2 °C, 37 °C y 65 °C. Para determinar la influencia del pH y la temperatura, se utilizaron las siguientes soluciones: Almidón al 1%, cloruro de sodio a 0.1M, amilasa al 1/2%, ácido clorhídrico a 0.05M, buffer fosfato 0.05M. pH 6.8 y solución yodada y agua destilada.
El experimento inició con la verificación previa de los materiales, confirmando que se
encontraron limpios y en buen estado, se procedió a realizar el experimento, los cuales fueron dos, uno para el análisis del pH y el otro para la temperatura; cada uno tuvo dos etapas, una de incubación y la otra de valoración enzimática.
La primera parte del experimento se enfocó en el análisis del efecto del pH y la primera fase del mismo consistió en realizar un sistema de incubación enzimática, para ello se usó tres tubos de ensayo, rotulándolos con el número de T1, T2 y T3 respectivamente, a los cuales se agregó la misma cantidad: 0.5 ml de solución de almidón al 1%, buffer pH 2.5 solo a T1 una cantidad de 1.5 ml, buffer pH 6.9 solo a T2 una cantidad de 1.5 ml y buffer pH 9.5 solo a T3 una cantidad de 1.5 ml. Luego se agregó la solución de cloruro de sodio a 0.1N, en cantidad de 0.25 a los tres tubos. Se mezcló y se pre-incubó en Baño María a 37 °C por 15 minutos; posteriormente se agregó la solución de amilasa salival al 1/2% solo a todos los tubos. Finalmente se mezcló suavemente e incubar a 37 °C por diez minutos. Se realizó la pre-incubación para poder darle las condiciones óptimas al medio para que la enzima logre adaptarse y realizar con eficiencia su función. La segunda etapa consistió en determinar la valoración de la actividad enzimática por el sustrato residual, la cual se realizó simultáneamente con el proceso de incubación por 15 minutos, se usaron cuatro tubos de ensayo, rotulados como T1, T2, T3 y TESTIGO, agregando la misma cantidad 0.5 ml a loa tubos excepto al TESTIGO, a él se le agregó 2ml, de solución de ácido clorhídrico a 0.05N. Luego se agregó 0.25 ml de los tubos de la primera parte T1, T2, T3 a los nuevos tubos T1, T2, T3, respectivamente; y al tubo TESTIGO se le agregó la solución de almidón al 1%, una cantidad de 0.25ml. Finalmente 0.25 ml de solución yodada a todos los tubos de esta parte.
La segunda parte del experimento se enfocó en el análisis del efecto de la temperatura y
la primera parte del mismo consistió en realizar nuevamente un sistema de incubación enzimática, para ello se usó tres tubos de ensayo, rotulándolos de la misma manera que en la primera parte, con el número de T1, T2 y T3 respectivamente, a los cuales se agregó la misma cantidad: 0.5 ml de solución de cloruro de sodio a 0.1N, solución de amilasa salival al 1/2% solo a todos los tubos en cantidades de 0.25 ml y buffer fosfato 0.05M. pH 6.8, a los tres tubos una cantidad de 1.5 ml. Posteriormente se mezcló suavemente e incubó cada tubo T1, T2 y T3 a una temperatura de 2 °C, 37 °C y 65°C respectivamente por cinco minutos. Finalmente se agregó 0.5 ml de solución de almidón al 1%, a todos los tubos.
La segunda fase donde se determinó la actividad enzimática se realizó de la misma
manera que para los efectos del pH.
III. RESULTADOS:
Los resultados obtenidos se registraron en las siguientes tablas:
Tabla Nº 1: Detección y medición de la actividad enzimática de la amilasa salival por el
sustrato residual por influencia del pH: Nº DE TUBOS T1 T2 T3 TESTIGO PH 2.5 6.9 9.5 - COLOR INICIAL Incoloro Incoloro Incoloro - COLOR FINAL Marrón Oscuro Amarillo Naranja Rojo Negro ACTIVIDAD No SI Regular No ENZIMÁTICA SUSTRATO Abundante Ausente Escasa Abundante Tabla Nº 2: Detección y medición de la actividad enzimática de la amilasa salival por el sustrato residual por influencia de la temperatura:
Nº de Tubos T1 T2 T3 TESTIGO T °C 4 37 65 - COLOR INICIAL Incoloro Incoloro Incoloro - COLOR FINAL Naranja Amarillo Marrón Oscuro Negro ACTIVIDAD Regular Abundante No No ENZIMÁTICA SUSTRATO Escaza Ausente Abundante Abundante
IV. DISCUSION:
Respecto a la tabla 1, los efectos del ph en la actividad enzimática muestran que en el
tubo T2 el ph óptimo de la amilasa salival es de 6.9 aproximadamente, ya que se obtuvo una ausencia de sustrato residual, mientras que en el tubo T3 hay un ph de 9.5 con una actividad enzimática regular y una escasa presencia de sustrato residual, y en el resto de tubos un poco o nula presencia de actividad enzimática; lo que confirma que la enzima en un medio con pH optimo ejerce por efecto de los protones una disociación de distintos grupos de sustrato y específicamente en la enzima, en su participación en la unión enzima-sustrato, en el mecanismo catalítico y en el mantenimiento conformacional de la enzima. Donde el medio con un mayor o menor ph respecto al óptimo, disminuye la actividad enzimática. (Leninger Alber (2000) Principios de bioquímica.2°ed. España: Omega).
Respecto a la tabla 2 la presencia de la temperatura genera un efecto en la velocidad de
la actividad enzimática en la amilasa salival, donde la óptima es de 37°C, ya que en el tubo se observó una ausencia de sustrato residual, lo que confirma que para el realice óptimo de su función tiene que tener una temperatura aproximada a la corporal. (Mathews, Van Holde, Ahern (2002). 3°ed.Mexico: Pearson)
V. CONCLUSIONES:
La detección y la determinación de la actividad enzimática de la amilasa salival, se
concluye que el pH y la temperatura tienen un efecto sobre la velocidad de la reacción enzimática del material biológico que se analizó. La valoración de la actividad enzimática por el sustrato residual confirma la usencia y presencia de sustrato residual, el cual depende de la presencia de la actividad enzimática.
