LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUIA 4. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA CATECOLASA o

POLIFENOLOXIDASA

I. EL PROBLEMA

Verificar in vitro los factores físicos y químicos que afectan la actividad de las enzimas

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Algo específico de la célula es su capacidad para llevar a cabo reacciones químicas rápidas a
temperatura ambiente, esto es posible porque ellas se realizan debido a la participación de las
enzimas, las cuales coadyuvan a la transformación de sustratos en productos. Las características
principales de estas moléculas nitrogenadas es que son: a) proteínas (excepción las ribozimas); b)
catalizadores y c) específicas.

Con base en estas propiedades se puede concluir que una enzima es una proteína sintetizada en la
célula que cataliza o acelera una reacción termodinámicamente posible y de manera muy específica.

La sustancia sobre la cual actúa la enzima se llama sustrato, el cual se une al catalizador por medio
de los aminoácidos del sitio activo que éste presenta en su estructura tridimensional, formando lo
que se denomina complejo enzima-sustrato; al llevarse a cabo la reacción se obtiene el o los
productos y se libera la enzima sin modificarse ni tampoco alterar en ningún momento la
composición química del sustrato ni la de los productos.

Algunas enzimas son poco activas sin la presencia de un cofactor el cual es generalmente
inorgánico, un ión metálico que frecuentemente es el responsable de la actividad catalítica, si por
alguna razón no existe, la enzima no funciona. Se denomina activadores a los iones metálicos que
hacen parte de la estructura de las mismas como ejemplos se puede citar: el Fe 2+, Mg2+, Cu2+ , Zn2+,
K+ y Na+, entre otros.

Otros cofactores son orgánicos y se llaman coenzimas generalmente compuestos orgánicos de bajo
peso molecular es también algunas veces necesaria para la actividad óptima de los catalizadores
biológicos. Las vitaminas hidrosolubles (tiamina B 1, riboflavina B2, niacina B3, piridoxal B6, etc.) y los
nucleótidos de adenina, son moléculas representativas que actúan como coenzimas. Tales
colaboradores de la actividad enzimática, se les puede denominar grupos prostéticos por su unión
fuerte. A la unión entre la enzima y el cofactor se le nombra como holoenzima y se llama
apoenzima a la enzima sin actividad biológica.
La actividad de una enzima depende fundamentalmente de agentes físicos y químicos tales como:

a).Concentración del sustrato b). Concentración de la enzima

c). Presencia de activadores d). Presencia de inhibidores
e). El pH. f). La temperatura.

En la práctica se confirmará experimentalmente algunos de los factores arriba relacionados,

utilizando la polifenol oxidasa o catecolasa la cual pertenece al grupo de las oxidorreductasas.

La enzima catecolasa contiene ión cobre como parte de su estructura. La feniltiourea combinada con
la porción de cobre que contiene el enzima impide el acoplamiento de ésta con el catecol (sustrato).

Algunos reactivos con estructuras similares a la del sustrato

IV. MATERIALES Y REACTIVOS

Material de Prueba
Extractos enzimáticos de diferentes vegetales: Extractos enzimáticos de diferentes vegetales (papa
sabanera, pastusa, batata, champiñón )

Preparación de extractos (este paso lo realiza el monitor por lo tanto no debe hacer
diagrama): 3 g de material de prueba partido en pedazos pequeños, licuar con 50 mL de agua
destilada. Renovarlo cada vez que se note pardeado.
Material por grupo de trabajo

15 Tubos de ensayo 2 Pinzas para tubo

2 Gradillas (1 pequeña) 1 Termómetro
3 Pipetas graduadas (1, 5 y 10 mL) 2 Pipeteadores
1 2 Vidrios de reloj pequeños 2 Goteros
1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 Espátula
1 Vaso de precipitados de 250 mL

Material adicional para todo el grupo

Papel indicador universal

Baños de maría
Bisturí
Reactivos

Feniltiourea, 0.5%
Catecol, 0.2%
Buffer de fosfatos o acetato 0.1M pH= 3; 5; 7 y 9
Acido ascórbico (recién preparado), 5%
Hielo

V. PROCEDIMIENTO.

Verificación de la actividad enzimática y efecto de la feniltiourea

En tubos de ensayos marcados, limpios y secos, pipetee en orden las soluciones que se indican en
el cuadro 1

CUADRO 1

TUBOS
REACTIVOS 1 2 3 4
Extracto enzimático (mL) 1 1 - 1
Catecol 0.2% (mL) 1 - 1 1
Agua destilada (mL) - 1 1 -
Feniltiourea (mL) 1

Mezcle bien y coloque los tubos en baño de maría a 37 oC durante 25 minutos. Mezcle los tubos cada
5 minutos sin sacarlos del baño. Observe el color inicial y el final en cada uno de los tres ensayos.
Cada grupo trabaja un extracto diferente a lo largo del laboratorio y solo en este primer ensayo la
tabla de resultados recoge los datos de todos los grupos (extractos). En los siguientes ensayos solo
se incluyen en la tabla los resultados de su grupo (extracto).

Si los colores no son definidos se puede emplear el siguiente código

No hay cambio de color _

Color claro +
Color oscuro ++
Color muy oscuro +++

Efecto de la temperatura

Tome 4 tubos de ensayo y mida en cada uno de ellos 1 mL del extracto enzimático. Coloque los
tubos a diferentes temperaturas durante 10 minutos, así:

Tubo 1 a 0oC (en hielo)

Tubo 2 a 37oC (en baño de agua)
Tubo 3 a 60oC (en baño de agua)
Tubo 4 a 92oC (en agua hirviendo)

Al cabo de 10 minutos agregue a cada uno, 1 mL de catecol al 0,2%. Déjelos a la temperatura

indicada por 5 minutos más. Observe los resultados y escriba en su informe los cambios de color
presentados, según el código indicado anteriormente.
Por último, tome los tubos 1, 3 y 4 colóquelos en baño de agua a 37 oC durante 10 minutos. Si
observa algún cambio regístrelo y analícelo en el informe, postule una temperatura óptima para la
enzima.

Efecto del pH sobre la actividad de la catecolasa

Marque 4 tubos de ensayo, limpios y secos y mida los volúmenes solicitados en el cuadro 4

CUADRO 4
TUBOS
REACTIVOS 1 2 3 4
Buffer pH=3 (mL) 2 - - -
Buffer pH=5 (mL) - 2 - -
Buffer pH=7 (mL) - - 2 -
Buffer pH=9 (mL) - - - 2
Extracto enzimático (mL) 1 1 1 1

Lleve los tubos a una temperatura de 37 oC durante 10 minutos y agregue a cada uno 1 mL de
catecol. Continúe el calentamiento por 15 minutos. Observe, registre los resultados y plantee el pH
óptimo para la enzima.

Efecto del ácido ascórbico sobre la actividad de la catecolasa

Esta enzima funciona removiendo iones hidrógeno (H +) de las moléculas del catecol para formar
quinona. Algunos ácidos como el ácido ascórbico son compuestos iónicos que liberan iones de H +
cuando se les adiciona agua. Tan pronto como los iones de H + son removidos por la catecolasa, ellos
son reemplazados por los iones de hidrógeno pero esta vez los del ácido ascórbico. Esta
reversibilidad en la reacción previene la formación de compuestos coloreados.

1.Corte un trozo de cada muestra de aproximadamente 5 mm de espesor y divídalo en dos partes

iguales.
2. Raspe la superficie de ambos trozos, de cada muestra, con una cuchilla con el objetivo de liberar
la enzima catecolasa por rompimiento celular.
3. Cubra completamente uno de los trozos con agua destilada y al otro con ácido ascórbico.
4. Después de 1 minuto cubra los trozos con catecol.
5. Espere 5 minutos y observe lo que ocurre.

BIBLIOGRAFÍA

Campbell, Mary K., Farrell, Shawn O.(2010). Bioquímica. 6 ed. México: Cengage Learning.

De Robertis, Eduardo; HIB, José y Ponzio, Roberto. (2003). Biología celular y molecular. 15 ed.
Argentina: El Ateneo.

Feduchi, Canosa Helena., Blasco Castiñeira, Isabel., Romero, Carlos Santiago., Yáñez Conde,
Magdalena Esther. (2011). Bioquímica. Conceptos esenciales. España, Madrid: Médica
Panamericana. 379 p. ISBN 978-84-9835-357-0

Horton, H Robert. et al. Bioquímica. (2008). 4 ed. México: Prentice Hall Hispanoamericana.

Mathews, Christopher; Holde, K. E., Ahern, Kevin. (2002). Bioquímica. 3 ed. Madrid: Addison Wesley.
Melo, Virginia., Cuamatzi, Oscar. (2006). Bioquímica de los procesos metabólicos. España: Reverté.

Nelson, David., Cox, Michael. (2008). Principles of Biochemistry. 15 ed. New York: Worth Publischer.

Voet, Donald., Voet, Judith. (2006). Bioquímica. 3 ed. Madrid: Médica Panamericana.

PREINFORME
 FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: CATECOLASA
Nombre__________________________Fecha__________________Grupo___

Realice todos los numerales del preinforme: título y consulta, fichas técnicas, procedimiento en
diagramas de flujo, resultados esperados y bibliografía de acuerdo con las indicaciones de su
profesor. Recuerde que solo entregará por escrito el título, las fichas técnicas,diagramas de flujo,
resultados esperados y bibliografía. En su quiz de laboratorio(oral o escrito) se le evaluarán sus
diagramas de flujo y la consulta.

I. CUESTIONARIO CONSULTA
1. Explique brevemente ¿qué es el pardeamiento enzimático?

2. Sobre la catecolasa (catecholase) en el enlace del aula virtual (DBGET Search – ENZYME)
consulte: nombres comunes y sistemático, clasificación completa, incluyendo jerarquía (brite
hierarchy), reacción o reacciones que cataliza, sustrato, producto, cofactor y comentario sobre la
enzima.

3. Describa brevemente la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria, si la tiene,

el sitio activo y los cofactores de la catecolasa usando figuras impresas y recortadas del
enlace del aula virtual - Enzyme structures database-. Para este propósito la búsqueda debe
realizarla con el número de clasificación obtenido del primer enlace, en el espacio
correspondiente a enzyme class: EC.

4. Haga una descripción sobre el efecto que tiene la temperatura y el pH en la actividad catalítica de
las enzimas.

Fichas técnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.

Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Forma de desechar el reactivo

Catecol

Feniltiourea

*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F), extremadamente inflamable (F+), tóxico
(T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA

Verificación de la actividad enzimática y efecto de la feniltiourea

Resultado esperado:
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________________________________________________________________________________
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Diagrama de flujo

(RECUERDE QUE UNA TABLA ES DIFERENTE DE UN DIAGRAMA DE FLUJO)

Efecto de la temperatura. Resultado esperado:

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Diagrama de flujo

Efecto del pH. Resultado esperado

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Diagrama de flujo

Efecto del ácido ascórbico. Resultado esperado

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________________________________________________________________________________________
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Diagrama de flujo

INFORME Nombre________________________________________________ / Grupo____

1. Tablas de resultados con fotos de tubos debidamente marcados

Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento e incluya los patrones (positivo y negativo)
y muestra debidamente nombrados y descritos (evite limitarse a escribir tubo 1, tubo 2, etc) y
describa en forma organizada las observaciones en cada tubo y si la prueba puede considerarse
positiva o negativa.

2. Discusión de resultados

-Relacione con toda la información de su preinforme* y realice la discusión para cada prueba, con
base en las siguientes pautas:

Explique, ¿el por qué de todas las observaciones en cada prueba?, aclarando si ocurre o no la
reacción en cada tubo, de acuerdo con el producto de la reacción.

Describa cómo se verificó la reacción catalizada por la enzima y ¿en qué extracto se encontró mayor
contenido de catecolasa?.

Explique el efecto se la feniltiourea, tenga en cuenta la naturaleza química de la catecolasa

consulatad en el preinforme.

Consulte la función biológica de la catecolasa y explique, ¿por qué tantas especies vegetales
producen la enzima catecolasa?.

Establezca, cuándo la enzima está más o menos activa, así como el efecto de cada temperatura y
pH evaluados en el laboratorio.

Proponga la temperatura y pH óptimos de la catecolasa.

Explique el efecto del ácido ascórbico sobre la actividad enzimática.

De acuerdo con lo observado en la práctica describa y explique qué sucede a nivel de

compartimientos celulares cuando se muerde, tritura, corta o descongelan vegetales como
manzanas o papas.

De acuerdo con lo observado en la práctica describa ¿Por qué en muchas recetas culinarias luego
de cortar vegetales se bañan con jugo de limón? ¿Qué sugiere la evidencia?

*Recuerde usar toda la información del preinforme: marco teórico de la guía, consulta y resultado
esperado.

3. Bibliografía correspondiente con citas en normas APA.