Guia 4 Catecolasa Presencial

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507
GUÍA 4. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

CATECOLASA
I. EL PROBLEMA
Verificar in vitro los factores físicos y químicos que afectan la actividad de las
enzimas
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Algo específico de la célula es su capacidad para llevar a cabo reacciones

químicas rápidas a temperatura ambiente, esto es posible porque ellas se
realizan debido a la participación de las enzimas, las cuales coadyuvan a la
transformación de sustratos en productos. Las características principales de
estas moléculas nitrogenadas es que son: a) proteínas (con excepción de las
ribozimas); b) catalizadores y c) específicas.
Con base en estas propiedades se puede concluir que una enzima es una
proteína sintetizada por la célula que cataliza o acelera una reacción
termodinámicamente posible y de manera muy específica.
La sustancia sobre la cual actúa la enzima se llama sustrato, el cual se une al

catalizador por medio de los aminoácidos del sitio activo que este presenta en
su estructura tridimensional, formando lo que se denomina complejo enzima-
sustrato; al llevarse a cabo la reacción se obtiene el o los productos y se
libera la enzima sin modificarse ni tampoco alterar en ningún momento la
composición química del sustrato ni la de los productos.
Algunas enzimas son poco activas sin la presencia de un cofactor el cual es

generalmente inorgánico, un ión metálico que frecuentemente es el
responsable de la actividad catalítica, si por alguna razón no existe, la enzima
no funciona. Se denomina activadores a los iones metálicos que hacen parte
de la estructura de las mismas como ejemplos se puede citar: el Fe 2+, Mg2+,
Cu2+ , Zn2+, K+ y Na+, entre otros.
Otros cofactores son orgánicos y se llaman coenzimas generalmente

compuestos de bajo peso molecular necesarios algunas veces para la
actividad óptima de los catalizadores biológicos. Las vitaminas hidrosolubles
(tiamina B1, riboflavina B2, niacina B3, piridoxal B6, etc.) son moléculas
representativas que actúan como coenzimas. Tales colaboradores de la
actividad enzimática, se les puede denominar grupos prostéticos por su unión
fuerte. A la unión entre la enzima y el cofactor se le nombra como holoenzima
y se llama apoenzima a la enzima sin actividad biológica.
La actividad de una enzima depende fundamentalmente de agentes físicos y

químicos tales como:
a). concentración del sustrato b). concentración de la enzima

c). presencia de activadores d). presencia de inhibidores
e). el pH. f). la temperatura.
g). agentes desnaturalizantes. h) presencia de proteasas.
En la práctica se confirmará experimentalmente algunos de los factores arriba

relacionados, utilizando la polifenol oxidasa o catecolasa la cual pertenece al
grupo de las oxidorreductasas.
La enzima catecolasa contiene ión cobre como parte de su estructura. La

feniltiourea combinada con la porción de cobre que contiene el enzima impide
el acoplamiento de ésta con el catecol (sustrato).
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Material de Prueba:
Papa pastusa (Solanum tuberosun)

Papa sabanera (Solanum tuberosun)
Papa criolla (Solanum phureja)
Aguacate (Persea americana) var. Hass
Durazno (Prunus pérsica)
Ñame (Dioscorea spp)
Batata (Ipomoea batatas)
Arracacha (Arracacia xanthorrhiza)
Preparación de extractos enzimáticos vegetales (este paso lo realiza el

monitor): 3 g de material de prueba partido en pedazos pequeños, licuar con 50
mL de agua destilada. Renovarlo cada vez que se note pardeado.
Material por grupo de trabajo
20 Tubos de ensayo
2 Gradillas
3 Pipetas graduadas (1, 2 y 5 mL)
2 Vasos de precipitados (100 y 250 mL)
2 Pinzas para tubos
1 Espátula
1 Termómetro
1 Pipeteador
2 Vidrios de reloj
2 Goteros
Material adicional para todo el grupo
Papel indicador universal

Baños termostatados a 37oC y 60oC
Baño de maría con agua a ebullición
4 Bisturís
Hielo
Reactivos
Extractos de vegetales
Resorcinol 0,2%
Feniltiourea 1%
Catecol 0,2%
Papaína al 2% fresca
Fenol 5%
Buffer de fosfatos o acetato 0,1M pH = 3; 5; 7 y 9
Hidroquinona 0,2%
Ácido ascórbico 5%
IV. PROCEDIMIENTO.
Verificación de la actividad enzimática

En tubos de ensayos marcados, limpios y secos, pipetee en orden las
soluciones que se indican en el cuadro 1
CUADRO 1
TUBOS
REACTIVOS 1 2 3
Extracto enzimático (mL) 1 1 -
Catecol 0,2% (mL) 1 - 1
Agua destilada (mL) - 1 1
Mezcle bien y coloque los tubos en baño de maría a 37 oC durante 25 minutos.

Agite los tubos cada 5 minutos sin sacarlos del baño. Observe el color inicial y
el final en cada uno de los tres ensayos.
Si los colores no son definidos se puede emplear el siguiente código
No hay cambio de color _

Color claro +
Color oscuro ++
Color muy oscuro +++
Efecto de la temperatura
Tome 4 tubos de ensayo y mida en cada uno de ellos 1 mL del extracto

enzimático. Coloque los tubos a diferentes temperaturas durante 10 minutos,
así:
Tubo 1 a 0oC (en hielo)

Tubo 2 a 37oC (en baño de agua)
Tubo 3 a 60oC (en baño de agua)
Tubo 4 a 92oC (en agua hirviendo)
Al cabo de 10 minutos agregue a cada uno, 1 mL de catecol al 0,2%. Déjelos a

la temperatura indicada por 5 minutos más. Observe los resultados y escriba en
su informe los cambios de color presentados, según el código indicado
anteriormente.
Por último, tome los tubos 1, 3 y 4 colóquelos en baño de agua a 37 oC durante

10 minutos. Si observa algún cambio regístrelo y analícelo en el informe.
Especificidad por el sustrato
Tome 8 tubos de ensayos limpios y secos. Pipetee en ellos los reactivos que se
indican en el cuadro 2
CUADRO 2
TUBOS
REACTIVOS 1 2 3 4 5 6 7 8
Extracto enzimático (mL) 1 - 1 - 1 - 1 -
Catecol, 0,2% (mL) 1 1 - - - - - -
Fenol, 5% (mL) - - 1 1 - - - -
Hidroquinona, 0,2% (mL) - - - - 1 1 - -
Resorcinol, 0,2 (mL) - - - - - - 1 1
Agua (mL) 1 2 1 2 1 2 1 2
Mezcle bien. Lleve los tubos al baño de maría a 37 oC durante 10 minutos.

Compare los resultados entre los tubos 1 y 2; 3 y 4; 5 y 6; 7 y 8.
Naturaleza química de las enzimas

Tome 4 tubos de ensayo limpios y pipetee los siguientes reactivos de acuerdo
con el cuadro.
CUADRO 3
TUBOS
REACTIVOS 1 2 3 4
Extracto enzimático (mL) 1 1 1 1
Solución de papaína al 2%
(mL) 1 - - -
Feniltiourea (mL) - - 1 -
Agua (mL) - - - 1
Lleve los tubos a una temperatura de 37 oC durante 10 minutos y agregue a

cada uno 1 mL de catecol. Continúe el calentamiento por 15 minutos. Observe
y registre los resultados.
Efecto del pH sobre la actividad de la catecolasa
Marque 4 tubos de ensayo, limpios y secos y mida los volúmenes solicitados en

el cuadro 4
CUADRO 4
TUBOS
REACTIVOS 1 2 3 4
Buffer pH=3 (mL) 2 - - -
Buffer pH=5 (mL) - 2 - -
Buffer pH=7 (mL) - - 2 -
Buffer pH=9 (mL) - - - 2
Extracto enzimático (mL) 1 1 1 1
Lleve los tubos a una temperatura de 37 oC durante 10 minutos y agregue a

cada uno 1 mL de catecol. Continúe el calentamiento por 15 minutos. Observe,
registre los resultados y plantee el pH óptimo para la enzima.
Efecto del ácido ascórbico sobre la actividad de la catecolasa
Esta enzima funciona removiendo iones hidrógeno (H +) de las moléculas del

catecol para formar quinona. Algunos ácidos como el ascórbico son
compuestos iónicos que liberan iones de H + cuando se les adiciona agua. Tan
pronto como los iones de H+ se remueven por la catecolasa, se reemplazan por
los iones de hidrógeno pero esta vez los del ácido ascórbico. La reversibilidad
en la reacción previene la formación de compuestos coloreados.
1. Corte un trozo de cada muestra de aproximadamente 5 mm de espesor y

divídalo en dos partes iguales.
2. Raspe la superficie de ambos trozos, de cada muestra, con una cuchilla con
el objetivo de liberar la enzima catecolasa por rompimiento celular.
3. Cubra completamente uno de los trozos con agua destilada y al otro con
ácido ascórbico.
4. Después de 1 minuto cubra los trozos con catecol.
5. Espere 5 minutos y observe lo que ocurre.
VI. BIBLIOGRAFÍA
Melo, V. y Cuamatzi, O. (2006). Bioquímica de los procesos metabólicos.

España: Reverté.
DE Robertis, E., Hib, J. y Ponzio, R. (2003) Biología celular y molecular. 15 ed.

Argentina: El Ateneo.

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GUÍA 4. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Algo específico de la célula es su capacidad para llevar a cabo reacciones

La sustancia sobre la cual actúa la enzima se llama sustrato, el cual se une al

Algunas enzimas son poco activas sin la presencia de un cofactor el cual es

Otros cofactores son orgánicos y se llaman coenzimas generalmente

La actividad de una enzima depende fundamentalmente de agentes físicos y

a). concentración del sustrato b). concentración de la enzima

En la práctica se confirmará experimentalmente algunos de los factores arriba

La enzima catecolasa contiene ión cobre como parte de su estructura. La

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Papa pastusa (Solanum tuberosun)

Preparación de extractos enzimáticos vegetales (este paso lo realiza el

Material adicional para todo el grupo

Papel indicador universal

Verificación de la actividad enzimática

Mezcle bien y coloque los tubos en baño de maría a 37 oC durante 25 minutos.

No hay cambio de color _

Tome 4 tubos de ensayo y mida en cada uno de ellos 1 mL del extracto

Tubo 1 a 0oC (en hielo)

Al cabo de 10 minutos agregue a cada uno, 1 mL de catecol al 0,2%. Déjelos a

Por último, tome los tubos 1, 3 y 4 colóquelos en baño de agua a 37 oC durante

Especificidad por el sustrato

Mezcle bien. Lleve los tubos al baño de maría a 37 oC durante 10 minutos.

Naturaleza química de las enzimas

Lleve los tubos a una temperatura de 37 oC durante 10 minutos y agregue a

Efecto del pH sobre la actividad de la catecolasa

Marque 4 tubos de ensayo, limpios y secos y mida los volúmenes solicitados en

Lleve los tubos a una temperatura de 37 oC durante 10 minutos y agregue a

Efecto del ácido ascórbico sobre la actividad de la catecolasa

Esta enzima funciona removiendo iones hidrógeno (H +) de las moléculas del

1. Corte un trozo de cada muestra de aproximadamente 5 mm de espesor y

Melo, V. y Cuamatzi, O. (2006). Bioquímica de los procesos metabólicos.

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