Manual de “Prácticas de Bioquímica I” UNAP - FFB

PRÁCTICA Nº 03

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS Y

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LAS PROTEÍNAS

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS.

I. GENERALIDADES
El nombre proteína deriva del griego “proteio” que significa de primera importancia. Las
proteínas juegan un papel importante crucial en casi todos los procesos biológicos, tales como
catálisis, y trasporte, movimiento coordinado, excitabilidad y control de crecimiento y
diferenciación, entre otros.

Las proteínas son moléculas que desempeñan una gran cantidad de funciones en las células de
todos los seres vivos. La función principal de las proteínas consiste en actuar como
componentes esenciales del material estructural básico de los tejidos (músculos, tendones,
piel, uñas, etc.); en contraposición con los hidratos de carbono y grasas cuyo papel principal es
proporcionar energía. Por otro, desempeñan funciones metabólicas y reguladoras (asimilación
de nutrientes, transporte de oxígeno y de grasas en la sangre, inactivación de materiales
tóxicos o peligrosos, etc.).

Las proteínas están en continuo intercambio en cuanto a síntesis y degradación. Las proteínas
están constituidas por aminoácidos (unidades elementales constitutivas) que primero forman
los péptidos y luego las proteínas. Los péptidos como las proteínas presentan importancia
fisiológica de ahí la importancia de su identificación en los diferentes componentes biológicos
y dietarios.

Se sabe que, de los 20 aminoácidos proteicos conocidos, 8 resultan indispensables (o

esenciales) para la vida humana y 2 resultan "semiindispensables". Son estos 10 aminoácidos

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los que requieren ser incorporados al organismo en su cotidiana alimentación y, con más
razón, en los momentos en que el organismo más los necesita: en la disfunción o enfermedad.

OBJETIVOS
Al término de esta práctica el alumno será capaz de:
 Determinar y explicar la solubilidad de diferentes compuestos. Proteínas, Aminoácidos,
Carbohidratos, Lípidos; en diferentes solventes.
 Determinar las propiedades de las proteínas utilizando diferentes reactivos.
 Conocer y explicar los métodos o procedimientos para verificar, diferenciar e identificar
AAs, así como la presencia de enlaces peptídicos en muestras biológicas usando técnicas
colorimétricas.
 Explicar la relación entre la estructura de los AAs con su reactividad y sus funciones.

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Tubos de ensayo de 13 ml Gradilla Vaso precipitado
Pipetas (1ml, 2ml, 5ml) Goteros Lunas de reloj
Pizetas Agitador (varilla) de vidrio

EQUIPOS
Baño María Cocina eléctrica Balanza analítica

MATERIAL BIOLOGICO
Proteínas: Leche (Caseina: se disuelve en un poco de NaOH diluido)
Huevo (Albumina 5g/L), Gelatina y peptona (Las otras proteínas en solución salina)
Aminoácidos: Glicina, Glutamato, Lisina, Alanina, Tirosina, Triptófano, Fenilalanina (1mg%)
Aminoácidos azufrados: Cisteína y Metionina (1 mg%)

REACTIVOS
Agua destilada Cloroformo Etanol
Fenol 1mg % Ninhidrina 2 g/L Ácido Nítrico concentrado
Sulfato de Cobre 10 g/L de CuSO4.5H2O NaOH 10 M

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Hidróxido de amonio Nitroprusiato de sodio 20 mg% Prepárese fresco.

Ácido Clorhídrico 0,1 M Hidróxido de Sodio 0,1 M

III. METODO - PROCEDIMIENTO

1. SOLUBILIDAD DE LOS AMINOACIDOS:
Preparar el siguiente kit de tubos de ensayo:

Glutamato Glicina Lisina Alanina Metionina Sacarosa Lactosa Ovoalbúmi

(1ml) (1ml) (1ml) (1ml) (1ml) (1ml) (1ml) na (1ml)
Agua 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Acido diluido 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
A1cali diluido 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Etanol 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Cloroformo 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Observar los cambios producidos al momento de colocar los reactivos utilizados como
solventes.

Comparar la solubilidad en ellos y anotarlos en el siguiente cuadro según sea el caso

> solubilidad = + no soluble = - precipitado = x

Glicina Lisina Metionina Sacarosa Lactosa Ovoalbúmina

(1ml) (1ml) (1ml) (1ml) (1ml) (1ml)

Agua

Acido diluido

A1cali diluido

Etanol

Cloroformo

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2. IDENTIFICACION DE PROTEINAS Y AMINOACIDOS:

a) Reacción de la Ninhidrina:
Preparar el siguiente set de 3 tubos de ensayo.
Seriar los tubos Nº1, Nº2, y Nº3.
Colocar:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Solución de aminoácidos 1 ml
Lactosa 1 ml
ovoalbúmina 1 ml
Ajustar el pH cerca de la neutralidad
Sol. Ninhidrina V gotas V gotas V gotas
Colocar los tres tubos en Baño María por 2 minutos.
Observar y anotar los resultados.

b) Reacción Xantoproteíca:
Preparar el siguiente set de tubos de ensayo
Seriar los tubos Nº1, Nº2, Nº3, N°4 y N°5.
Colocar:

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5

Sol. Aminoácido 1 (glicina) 0,5 ml -- -- -- --
Sol Aminoácido 2 (tirosina) -- 0,5 ml -- -- --
Sol Aminoácido 2 (fenilalanina) -- -- 0,5 ml -- --
Sol de ovoalbúmina -- -- -- 0,5 ml --
Sol de Lactosa -- -- -- -- 0,5 ml
HNO3 cc 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Observar cambio de color
NaOH 4% hasta medio alcalino fuerte 2 ml 2 ml 0,5 ml 2 ml 2 ml
Observar cambio de color

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c) Prueba de Biuret para enlaces peptídicos:

Preparar el siguiente set de 3 tubos de ensayo.
Seriar los tubos Nº1, Nº2, y Nº3.
Colocar:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Solución de aminoácidos 2 ml
Lactosa 2 ml
Ovoalbúmina 2 ml
Ajustar el pH cerca de la neutralidad
Sulfato de cobre V gotas V gotas V gotas
Observar los cambios producidos en ellos (anotar)
NaOH al 10% 2 ml 2 ml 2 ml
Mezcle vigorosamente
Observe los colores formados y anote los resultados

d) Prueba de nitroprusiato:
Preparar el siguiente set de 3 tubos de ensayo.
Seriar los tubos Nº1, Nº2, y Nº3.
Colocar:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Nitroprusiato de sodio (solución fresca) 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Solución de aminoácidos (glicina) 2 ml
Lactosa 2 ml
Ovoalbúmina 2 ml
Mezclar
NH4OH 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Observar los cambios producidos en ellos
Anote los resultados

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IV. RESULTADOS

V. DISCUSION

VI. CONCLUSIONES

VII. RECOMENDACION

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.
2.
3.

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DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS.

I. GENERALIDADES
Las propiedades físico-químicas de las proteínas están en función de su gran tamaño y de la
presencia de los grupos ionizables.

Debido a su gran tamaño las proteínas forman sistemas coloidales cuando se encuentran
dispersas en medios acuosos. No dializan, o sea, no pueden difundir a través de las
membranas. Fisiológicamente, las proteínas al no difundir a través de las membranas
biológicas crean una presión osmótica, que en este caso particular se denomina oncótica, la
que contribuye a la distribución del agua y los electrolitos entre las células y el medio
extracelular.

La presencia de grupos ionizables en determinados residuos aminoacídicos explica las

propiedades eléctricas de las proteínas. Estos grupos son los extremos amino y carboxilo, así
como los ionizables de las cadenas laterales de los residuos aminoacídicos ácidos y básicos.
La carga eléctrica resultante de las proteínas depende del predominio de cargas negativas o
positivas, lo que está determinado por el pH del medio. Se le denomina punto isoeléctrico (PI)
al valor del pH (concentración de iones hidrogeno) al cual las proteínas presentan carga
resultante cero (eléctricamente neutro), es decir, el número total de cargas positivas es igual al
número total de cargas negativas contenidas en la proteína y por tanto no se desplazan en un
campo eléctrico. Así mismo en un campo eléctrico las proteínas con carga (-) van al ánodo.

Cada Proteína tiene un determinado punto Isoeléctrico (PI). Por ejemplo: el PI de la pepsina es
menor que 1,0; el de la hemoglobina es 6,8; el de la ribonucleasa es 9,6 y el del citocromo c es
10,6.

Es necesario recalcar que cuando las proteínas se encuentran en una solución que tiene un pH
igual a su Punto Isoeléctrico, estas se vuelven difícilmente solubles y precipitan. Por esta
razón en el laboratorio, al variar el pH del medio de disolución, se puede cambiar la carga
eléctrica de las proteínas y con ello, también su solubilidad. En base a este comportamiento de

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las proteínas, se puede entonces determinar su Punto Isoeléctrico, para lo cual tendremos en
cuenta la solubilidad que produce cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que
tienen pH conocidos.

OBJETIVOS
 Determinar el Punto isoeléctrico de una proteína relacionando la solubilidad mínima con el
pH de la solución en que ella se produce.
 Contribuir a establecer la importancia de conocer las propiedades de las proteínas.

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Set de 10 tubos de ensayo de 13 ml Gradilla Pipetas (1ml, 2ml, 5ml)
Goteros Lunas de reloj Pizetas
Agitador (varilla) de vidrio

EQUIPOS
Baño María Cocina eléctrica Balanza analítica pHmetro

REACTIVOS
Ácido acético 1N Agua destilada Hidróxido de Sodio 10%
Solución de caseína en acetato de sodio 0.1N Solución de Fenolftaleina

III. METODO - PROCEDIMIENTO

1. DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE UNA PROTEINA:
Preparar un set de 9 tubos de ensayo.
Numerar los tubos de ensayo del Nº1 al Nº9
En el tubo Nº1 colocar 3.2 ml de ácido acético 1N y agregar 6.8 ml de agua destilada.
Mezclar.
En los otros 8 tubos restantes, colocar 5 ml de agua destilada.
Del tubo Nº1 sacar 5 ml de solución y agregarlos al tubo Nº2. Mezclar.
Del tubo Nº2 sacar 5 ml de solución y agregarlos al tubo Nº3. Mezclar.
Continuar haciendo lo mismo para los otros tubos restantes de la serie de 9 tubos.

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En el último tubo (Nº9) una vez efectuada la mezcla se saca 5 ml de solución, los cuales se
eliminan.
Agregar rápidamente 1 ml de solución de caseína en acetato de sodio 0.1 N a cada tubo.
Mezclar al instante por inversión.
Observar el efecto inmediato producido en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos.
Anotar los resultados en el siguiente cuadro.
Observar después de 30 minutos.
Anotar en el cuadro el pH de cada tubo. Según lo indicado en la parte final del cuadro.
Calentar ligeramente cada uno de los tubos y apreciar el efecto sobre la solubilidad.
Anotar en el cuadro.
Agregar I gota de Fenolftaleina. Mezclar.
Agregar Hidróxido de sodio al 10% gota a gota, agitando, hasta la aparición de un color
rosado.
Observar el efecto sobre la solubilidad y anotar los resultados en el siguiente cuadro.

TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH de cada tubo
Enturbiamiento mezclar
Enturbiamiento o precipitado a los 30´
Solubilidad después de calentar
Solubilidad después de agregar NaOH 10%
Emplear los símbolos siguientes:
0 = No cambia la opalescencia + = Opalescencia x = Precipitado

Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación lo cual se producirá en el tubo que
tiene un pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína.
Interpretar los resultados e indicar el PI aproximado de la proteína.

NOTA
Los pH de las soluciones en los diferentes tubos de ensayo deben de ser calculados y
presentados antes de realizarse la practica en el laboratorio.

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El pH se puede calcular a partir de la ecuación de Henderson – Hasselbach:

[sal]
pH = pK + Log ----------
[acido]
pK Ácido Acético = 4.7
La concentración de sal es de 1 ml de acetato 0.1 N en cada caso.
La concentración del ácido es 1.6 ml de ácido 1N en el tubo Nº1
(1.6 ml 1N = 16ml 0.1 N)
En el tubo Nº2, la concentración del ácido es 8ml 0.1N
En el tubo Nº3, la concentración del ácido es 4ml 0.1N. en este último entonces el pH será:
[sal] 1
pH = pK + Log ---------- = 4.7 + Log ----- = 4.7 – 0.6 = 4.1
[acido] 4

IV. RESULTADOS

V. DISCUSION

VI. CONCLUSIONES

VII. RECOMENDACION

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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