UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

Practica N°5
COLORACION EN TINCION GRAM
I. OBJETIVOS
1.1.- Objetivo general

Conocer el fundamento de coloración de las bacterias para ser observadas a través

del microscopio.

1.2.- Objetivos específicos

Conocer y aplicar el examen por tinción Gram.
Dar a conocer que bacteria se pudo observar después de la utilización del método de
Gram.

II. FUNDAMENTO TEORICO

2.1. Gram positivas
Las paredes Gram positivas, aparte del peptidoglicano, poseen ácido teicóico y lipoteicóico,
polímeros de alcoholes como el glicerol o el ribitol (figura Nº1 ). Estos ácidos se anclan unas
veces en el peptidoglicano y otras en la membrana citoplasmática y constituyen antígenos
superficiales interesantes en las especies patógenas de Gram positivas. Las bacterias ácido-
alcohol resistentes, como por ejemplo las micobacterias, son en realidad Gram positivas, pero
no se tiñen bien en la tinción de Gram debido al elevado contenido lipídico de su pared.

Fig. Nº 1 estructura de la pared

de las Gram positivas

2.2. Gram negativas

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La pared de las Gram negativas tiene una membrana por encima de la capa de
peptidoglicano (figura Nº2), y por eso, cuando se observan al microscopio
electrónico, se ve una estructura trilaminar (membrana, capa de peptidoglicano y
membrana externa).

Fig. Nº2 estructura de la pared de

las Gram negativas

Fig. Nº 3 Estructura de las Gram

Positivas y Gram Negativas

2.3. Examen por tinción

Las técnicas de coloración son imprescindibles para el estudio microscópico de las
muestras y de los propios microorganismos, pues permiten observar con detalle la
morfología bacteriana y proporcionan información complementaria sobre su
comportamiento frente a determinados colorantes, lo cual posibilita su diferenciación.
(García PG., 1997).

2.4. Técnicas de tinción

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 2.4.1. Técnicas de tinción simple o directa
Tiñen homogéneamente la célula y solo utilizan un colorante, que puede ser azul de
metileno, safranina, cristal violeta, etc.(Alarcón LR.,2004)

2.4.2. Técnicas de tinción compuesta o diferencial

Requieren combinaciones de dos o más colorantes, como en la técnica de gram, la de
Ziehl Neelsen, tinción de esporas, etc. (Alarcón LR.,2004)
Algunas de estas técnicas permiten la demostración de estructuras específicas como
capsula, flagelos, esporas etc. otras tiñen selectivamente bacterias de un grupo
específico.
2.4.2.1. Tinción negativa
En realidad no colorean los microorganismos, ya que el colorante se limita a
depositarse en el campo del rededor, delimitando las células. Esto explica debido a
que las bacterias presentan muchas cargas negativas asociadas con la pared,
membrana y citoplasma, siendo repelidos los colorantes con carga acida. (Alarcón
LR., 2004)
2.4.2.2. Tinción Gram
Esta tinción fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884
y es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque permite clasificar las
bacterias de grandes grupos: Gram positivas y gramnegativos. (Tortora J., 2007).
Esta técnica de tinción nos dice que el colorante violeta se combina en el citoplasma
de cada bacteria y lo colorean de violeta oscuro o purpura. Las bacterias que
conservan este color después despues de haberles agregado alcohol para decolorarlas
se clasifican como Gram positivas; y las que pierden este color violeta nos da
referencia a que son Gram negativas.(Tortora J., 2007).
Además nos dice también como las bacteria Gram negativas son incoloras después
del lavado con alcohol, dejan de ser viables. Por ese motivo se les aplica el colorante
básico la safranina, que la convierte en rosadas. Este colorante que tiene un color de
contrasta con el colorante primario se denomina colorantes d contaste.

fig. Nº4 procedimiento del

teñido Gram

III. MATERIALES Y METODOS

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3.1.-Materiales
3.1.1.- Materiales y equipos
Laminas porta y cubre objetos.-son láminas de vidrio rectangulares uno
cumple la función de cubrir al porta objeto en la que se distribuye la
preparación que se desea observar al microscopio.
Mechero bunsen.- Encendedor provisto de una mecha y una ruedecilla
dentada que hace saltar chispas de una piedrecilla.
Gotero.- Es un tubo hueco terminado en su parte inferior en forma cónica y
cerrado por la parte superior por una perilla o dedal de goma. Se utiliza para
trasvasar pequeñas cantidades de líquido vertiéndolo gota a gota.
Pizeta.- es un recipiente cilíndrico sellado con tapa rosca, el cual posee una
extensión tubular con una abertura, capaz de entregar agua o cualquier líquido
que se encuentre contenido en la pizeta, en pequeñas cantidades.
Aza o anza.- es un instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una
base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio.
Microscopio.- es un instrumento que permite observar objetos que son
demasiado pequeños para ser vistos a simple vista.
3.1.2.- Reactivos
Azul de metilo.- El azul de metileno, cuyo nombre científico es Cloruro de
Metiltionina, es un colorante que se usa para tratar una enfermedad llamada
metahemoglobinemia.
Lugol.- Es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua
destilada.
Anaranjado de metilo.- El nombre del compuesto químico del indicador es
sal sódica de ácido sulfónico de 4-Dimetilaminoazobenceno.
Alcohol acetona
Aceite de inmersión.- está diseñado para ser usado con aceite entre el lente
frontal y el cubre objetos de vidrio, de tal modo se hace uso completo del
objetivo.
Agua destilada.- Es aquella cuya composición se basa en la unidad de
moléculas de H2O. Es aquella a la que se le han eliminado las impurezas e
iones mediante destilación.
Muestra

3.2.-Metodos

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Como ya tenemos la muestra que se realizó la clase pasada comenzaremos
con :

Fijar un frotis

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa col y esperar que enfríe un

poco.

Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta coger un poco de muestra.

Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que
ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para
depositar la muestra contenida en el asa.

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Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a
realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos
giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al
terminar la extensión, tengamos como producto una espiral en la parte media
de la lámina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para
fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se
pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología
celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el
portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso
de la mano.

Tinción

Con azul de metilo, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante

sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al
colorante por 1 minuto.

Azul de
metilo

Enjuague

Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra

con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el
chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer
sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe
ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centímetro de
espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en
posición inclinada hacia abajo.

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Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol

durante 1 minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forme
compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias.

Lugol

Decoloración

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con

etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no
escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del
decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta
lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no
escurra más líquido azul.

Lavado y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la
lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma
anteriormente descrita.

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Tinción de contraste

Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta
vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina,
dejar actuar durante 1 minuto.

Anaranjado de
metilo

Nuevo enjuague

Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua,

se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De
esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación
microscópica.

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IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1.- Resultados

Se logró conocer el fundamento de la técnica de coloración de la tinción Gram, y

además otras técnicas de tinción para utilizarlas para la observación de las bacterias.
Aplicamos la tinción Gram, y lo hicimos de acuerdo a las bibliografías, pero con
ciertas diferencias como por ejemplo en el uso de cristal violeta (azul de metilo), y
lo que es la safranina (anaranjado de metilo).
En este presente informe las bacterias que se pudo observar en las tres distintas
muestras (10-1, 10-2, 10-3) que tuvimos fueron las mismas, ya que en estas tres
pudimos observar Gram positivas la muestra 10-1 que es una Gram negativa.
Además utilizamos una de las tinciones diferenciales (tinción Gram), ya que existen
otras como: la técnica de elaboración de frotis bacteriano (antes de la tinción ),
preparación en fresco y otras. (Alarcón LR.,2004)

En estas muestras pudimos observar de que en la muestra 10-1, se ve un a Gram negativa y

esto se puede diferenciar por el color rojo que se puede ver, y además se puede ver
stafhylococcus.

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4.2.- Discusiones

Según la mayoría de las bibliografías asistidas nos indican que se debería hacer la
utilización de cristal de violeta y no nos dan referencia al azul de metilo. (Tortora
JG., 2007).
El cristal violeta, combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares
de las bacterias al igual que el azul de metilo, pero nos dice que no se debería de
confundir estos dos ya que no son los mismos colorantes. (García PM., 1997).

 En esta práctica hicimos la utilización de azul de metilo lo cual en la

bibliografía nos dice que debería de ser con cristal de violeta.

Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método;
las únicas excepciones son los microorganismos que se hallan con exclusividad
dentro de las células huésped (clamidias), los que carecen de pared celular
(micoplasmas y ureaplasma) y los que tienen un tamaño insuficiente para ser
observados con el microscopio óptico.(Forbes B., 2009).

 Las bacterias que nos importa son las bacterias presentes en la industria
alimentaria, y pues como ya pudimos dar cuenta en los anteriores informes,
según la norma técnica del Perú nos dice que las muestras de leche que
obtuvimos, no eran aptos para el consumo.

Una vez teñido, el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x), cuando el
material orgánico se tiñe de Gram (frotis directo) se evalúa en busca de la presencia
de células bacterianas así como las de reacciones de Gram, la morfología
(coco,bacilos,etc.) y la disposición(cadenas, pares, racimos, etc.) de las célula
observada.(Forbes B., 2009).

 En esta práctica nosotros pudimos observar que las bacterias se

encontraban con una morfología de cocos, y también las pudimos observar
en cadenas.

El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo

colorea de violeta oscuro o purpura. Las bacterias que se observan después de
haberles agregado el alcohol para decolorarlas se clasifican como Gram positivas.
(Torta G., 2007).

 Esto fue lo que nosotros pudimos observar, bacterias de color rojizos

oscuros, y esto nos dio a conocer de que eran Gram positivas.

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V. CONCLUSIONES

Se logró con los objetivos propuestos.

En conclusión la práctica realizada se realizó con el procedimiento indicado

por el docente, con algunos inconvenientes ya que al inicio, no se pudo lograr
observar muy bien las bacterias , pero luego se superó esto , y se consiguió lo
que se pedía , y pudimos observar bacterias (Gram positivas) en las tres
muestras (10-1, 10-2, 10-3).

VI. BIBLIOGRAFIA

Alarcón Luis Roberto. Manual de prácticas de Microbiología básica y

Microbiología de alimentos .Universidad Autónoma de Ciudad de Juarez.
CHIHUAHUA, MEXICO. Ed. PRIMERA. 2004.

Forbes Betty A. Diagnostico Microbiológico. BUENOS AIRES,

ARGENTINA. Ed. DOCEAVA.2009.
Pedro García Martos,María Teresa Fernández del Barrio,Fernando Paredes
Salido. Microbiología clínica aplicada.MADRID, ESPAÑA.EDICION
TERCERA.1997.

Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case. Introducción a la

microbiología.PEARSON EDUCATION, INC, PUBLISHING as
BENJAMIN CUMMINING EE.UU.2007.

Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio

(https://books.google.com.pe/books?id=vwB0fgirgN0C&pg=PA63&dq=tec
nicas+de+coloracion+gram&hl=es&sa=X&ei=DkKgVcjbN4r1oASEr4LIC
A&ved=0CCoQ6AEwAg#v=onepage&q=tecnicas%20de%20coloracion%2
0gram&f=false) 10/07/15. 17:37

http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologi
a/practico4.pdf
http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-
BIO-231-P-071/BIO-231%20PRACTICA%202%202-12-13.pdf

http://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio4.pdf

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VII. ANEXOS

Bacterias Gram-negativas aerobias o microaerofilas (vibrioides).-Bacilos

espirales curvados y móviles. Parásitos del hombre y animales.
Género Campylobacter:
Especies: C. fetus, C. jejuni y C. coli
Género Helicobacter.
Especie: H. pylori.
Bacilos y cocos Gram-negativos aerobios:
Familia Pseudomonadaceae. Bacilos Gram-negativos, con flagelos polares.
Producen citocromo y oxidasa.
Género: Pseudomonas: P. aeruginosa
Familia Moraxellaceae.
Género Moraxella.
Especies: M. lacunate, M catharralis.
Género Acinetobacter
Especie: A baunannii.
Familia Xanthomonadaceae
Género Stenotrophomonas.
Especie: S. maltophila.
Familia Burkholderia
Especie B. cepacea
Familia Legionellaceae. Bacilos móviles de vida libre. Patógenos para el hombre.
Especie: L. pneumophila.
Familia Neisseriaceae. Cocos agrupados en parejas con las zonas adyacentes
planas. Especies patógenas.
Género Neisseria
Especies: N. meningitidis, N. gonorrhoeae.
Género Kingella
Especie: K. kingae
Familia Bartonellaceae
Género Bartonella
Familia Brucellaceae. Cocobacilos Gram-negativos. Parásitos del hombre y de
animales.
Género Brucella.
Especie: B. melitensis, B. abortus.
Familia Bradyrhizobiaceae
Género Afipia.
Especie: A. felis
Otros géneros de interés:
Género Flavobacterium
Especie: F. meningosepticum.

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Género Alcaligenes
Especie: A. faecalis.
Género Bordetella.
Especie: B. pertussis.
Género Francisella.
Especie: F. tularensis.
Bacilos Gram-negativos anaerobios facultativos:
Familia Enterobacteriaceae. Bacilos Gram-negativos, no esporulados. Fermentan la
glucosa con formación de ácido o de ácido y gas. Reducen los nitratos a nitritos y no
poseen citocromo-oxidasa.
Género Escherichia.
Especie: E. coli
Género Shigella.
Especies: S. dysenteriae, S. sonney
Cocos Gram-positivos:
Aerobios – anaerobios facultativos.
Género Micrococcus
Especie: M. Luteus.
Género Staphylococcus.
Especies: Staph. Aureus, Staph. Epidermidis, Staph. Saprophyticus
Género Streptococcus.
Especies: S. Pyogenes, S. Pneumoniae, S. Agalactiae
Género Enterococus
Especie: E. Faecalis.
Otros Estreptococos anaerobios estrictos.
Género Peptococcus.
Especie: P. Niger.
Género Peptostreptococcus.
Especie: P. Anaerobius
Género Sarcina
Bacilos Gram-positivos esporulados:
Género Bacillus.
Especies: B. anthracis, B. cereus
Género Clostridium.
Especies: C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. difficile
Otros bacilos Gram-positivos:
Género Listeria
Especie: L. monocytogenes
Género Corynebacterium: bacilos Gram-positivos que tienden a agruparse
Especie: C. diphtheriae
Género Actynomyces: forman hifas o micelios rudimentarios.
Especie: A. israelii
Género Nocardia.

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Especie: N. Asteroides
Familia Mycobacteriaceae. Bacilos ácido-alcohol-resistentes.
Género Mycobacterium
Especies: M. tuberculosis, M. leprae

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