LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES

REVISIÓN

Liberación de neurotransmisores: un proceso de fusión

de membranas que transcurre en fracciones de milisegundos
E. Alés, J.M. Poyato, V. Valero, G. Álvarez de Toledo

RELEASE OF NEUROTRANSMITTERS: A PROCESS OF MEMBRANE FUSION OCCURRING

IN FRACTIONS OF MILLISECONDS
Summary. Introduction. The physiological mechanisms involved in neurotransmitter release were established thanks to the
pioneer work of Katz, Del Castillo and Miledi at the neuromuscular junction. They termed their work as the quantal hypothesis
of synaptic transmission. This hypothesis was further established morphologically by the work of Heuser and Reese. However,
the molecular events underlying this process are poorly understood. We are starting to know which proteins interact between
the vesicle and plasma membrane to promote fusion and to identify which molecules participate in the sensing of cytosolic
calcium. Development. Thanks to the combination of molecular biology, electrophysiology and microfluorometry, a huge
amount of new information is been obtained on the mechanisms participating in synaptic transmission. This data deals with
processes concerning to different pools of synaptic vesicles and their availability to reach the presynaptic membrane; the
molecular events responsible for the targeting of these vesicles with the plasma membrane; the sensitivity to calcium at the
presynaptic membrane; the fusion of membranes required to release the vesicle contents, and the mechanisms responsible for
membrane retrieval needed for presynaptic homeostasis. Conclusions. In this review we discuss new data regarding synaptic
function. However, some key points are still a matter of controversy. Meanwhile the quantal hypothesis is valid, the precise
processes by which channels and vesicles interact, membrane is recycled and vesicles reused are still controversial. New
techniques should be developed to address these points [REV NEUROL 1998; 27: 111-7].
Key words. Calcium channels. Cell membrane capacitance. Exocytosis. Neurotransmitters. Synaptic transmission. Synaptic
vesicles.

SINAPSIS QUÍMICAS Y RETARDO SINÁPTICO todas aquellas respuestas reflejas generadas por estímulos visua-
Una de las características fundamentales del funcionamiento del les, auditivos o funciones superiores, ya no es la distancia que
sistema nervioso es su capacidad para reaccionar ante distintos debe recorrer el potencial de acción, sino el número de sinapsis
estímulos. Esta capacidad de respuesta se pone de manifiesto en químicas que deben superarse para transmitir el impulso nervioso
multitud de funciones nerviosas, que incluyen desde el reflejo de una neurona a otra lo que determina la eficacia en la transmisión
involuntario más sencillo, como puede ser el reflejo de retirada de información.
ante un estímulo doloroso, hasta reflejos condicionados comple- La visión actual del funcionamiento de la transmisión del
jos en los que participan un elevado número de estructuras del impulso nervioso entre dos neuronas proviene de los trabajos clá-
sistema nervioso y donde se requiere el relevo en múltiples neu- sicos realizados en las décadas de los 50 y 60 por el español José
ronas para elaborar dicha respuesta refleja. En todas estas reaccio- del Castillo, Bernad Katz y Roberto Miledi. Con sus trabajos, este
nes la rapidez en la ejecución ha sido una de las directrices que la grupo de fisiólogos estableció las bases del funcionamiento sináp-
evolución ha ido seleccionando. Los seres más rápidos en respon- tico utilizando como preparación experimental la placa neuro-
der, en los que las respuestas ante estímulos se desarrollan de muscular. En esta preparación realizaron los experimentos que
forma más veloz y coordinada, han sido los que fundamentalmen- sirvieron como base de la teoría cuántica de liberación del neuro-
te han conseguido dominar en la escala animal. transmisor, donde la cantidad mínima liberada de neurotransmi-
El retardo en la ejecución de las respuestas en el sistema ner- sor (‘cuanto’) debería ser liberada a la hendidura sináptica de
vioso viene determinado por la distancia que tiene que recorrer el forma instantánea [1]. Esta teoría fue comprobada morfológica-
impulso nervioso a lo largo del axón y el número de estaciones de mente a principios de los 70 por Heuser y Reese [2]. Sus conocidos
relevo (neuronas) que intervienen en la generación de la respues- experimentos de criofractura de la placa neuromuscular mostra-
ta. En aquellas situaciones donde el efector es un músculo distal, ron de forma inequívoca que la liberación de un cuanto de acetil-
por ejemplo en el reflejo rotuliano, parece claro que es el retardo colina se debía a la fusión de una vesícula sináptica clara con la
en la velocidad de conducción a través de un metro de axón de membrana presináptica. Del Castillo, Katz y Miledi, además de
una motoneurona espinal el factor principal que determina la fijar las bases y formalizar numéricamente la teoría cuántica de
latencia (el impulso nervioso tarda de 10 a 20 milisegundos en liberación del neurotransmisor, realizaron una serie de experi-
recorrer un metro de axón). Sin embargo, cuando las distancias mentos sobre el retardo sináptico [3]. Uno de los experimentos
que tiene que recorrer el impulso nervioso son cortas, por ejemplo clásicos de este trabajo se muestra en la figura 1. El dispositivo
experimental consiste en la estimulación eléctrica del terminal
Recibido: 11.11.97. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones: 29.11.97.
nervioso y el registro de la actividad extracelular registrada en la
superficie del músculo en una zona cercana a la placa neuromus-
Departamento de Fisiología Médica y Biofísica. Facultad de Medicina.
Universidad de Sevilla. Sevilla, España. cular. El retardo sináptico en la placa neuromuscular oscila entre
0,5 y 2,6 ms, siendo el retardo más frecuente de 0,9 ms. En ningún
Correspondencia: Dr. Guillermo Álvarez de Toledo. Departamento de Fi-
siología Médica y Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla. caso observaron retardos inferiores a 0,5 ms. En la brillante dis-
Avda. Sánchez Pizjuán, 4. E-41009 Sevilla. Fax: +34 95455 1769. E-mail: cusión de este trabajo, Katz y Miledi llegaron a la conclusión de
gatoledo@cica.es que el retardo sináptico se debe al tiempo que tardan en activarse
 1998, REVISTA DE NEUROLOGÍA los mecanismos implicados para que se produzca la liberación del

REV NEUROL 1998; 27 (155): 111-117 111

0111_155_R_04_Alés.p65 111 02/06/99, 10:59

 E. ALÉS, ET AL

Estímulo

Presináptica

Corriente

Postsináptica

Retardo sináptico

60

40

20

0
0 1 2 3
Tiempo

Figura 1. Determinación del retardo sináptico en la placa neuromuscular. a) Registro extracelular de la corriente postsináptica registrada tras la
estimulación eléctrica del terminal. El retardo sináptico aparece como el período que transcurre desde la invasión del terminal por el potencial de acción
(pre) y la generación de la corriente postsináptica. El artefacto de estimulación se observa al comienzo del registro. b) Secuencia de registros donde
se observa un período de latencia (retardo sináptico) variable. c) Distribución de frecuencias de retardos sinápticos. El retardo mínimo es de 0,5 ms,
el más largo de 2,6 ms y la media de la distribución se encuentra a 0,9 ms. (Tomado de Katz y Miledi [3]).

neurotransmisor y no al tiempo de difusión de las moléculas de tas etapas moleculares, no sólo permite entender desde un punto
acetilcolina a través de la hendidura sináptica. En experimentos de vista molecular lo que ocurre en un terminal sináptico, sino
anteriores realizados por Eccles y Jaeger (1958) [4] se había esti- que además ofrece el sustrato molecular de enfermedades o in-
mado el tiempo de difusión de la acetilcolina y determinado la toxicaciones del sistema nervioso. Por citar dos buenos ejem-
distancia de la hendidura sináptica en la placa neuromuscular en plos, se conoce desde hace tres años el lugar concreto de actua-
1 µm; estos cálculos indicaban que el retardo sináptico por difu- ción de la toxina tetánica o de la toxina botulínica, dos sustancias
sión de neurotransmisor debía ser de tan sólo 1 µs, a diferencia del que bloquean de forma irreversible la transmisión sináptica. En
retardo mínimo observado de 500 µs (0,5 ms). Posteriormente, este artículo de revisión nos proponemos presentar de forma
estudios por microscopía electrónica mostraron que la hendidura detallada las etapas por las que debe pasar una vesícula sináptica
sináptica es mucho más estrecha (unos 50-70 nm), lo que sugiere clara, que determinan el retardo de 500 microsegundos, entre la
un menor retardo debido a la difusión [2]. Los elegantes experi- llegada de un potencial de acción y la liberación del neurotrans-
mentos de Katz, Miledi y Del Castillo mostraron no sólo que la misor a la hendidura sináptica.
transmisión sináptica se producía por la liberación cuántica del
neurotransmisor, sino que además sugerían que a nivel presináp-
tico tenían lugar fenómenos moleculares que permiten acoplar la UNA POBLACIÓN DE VESÍCULAS SINÁPTICAS
llegada de un potencial de acción con la maquinaria secretora que SE ENCUENTRA LISTA PARA LA FUSIÓN
libera el neurotransmisor en fracciones de milisegundos. CON LA MEMBRANA PRESINÁPTICA
El avance reciente de la fisiología celular y la biología mole- Al objeto de cumplir los requisitos de rapidez anteriormente ex-
cular está permitiendo caracterizar la cadena de eventos que puestos en la transmisión sináptica, las vesículas sinápticas nece-
tiene lugar durante la liberación del neurotransmisor e identifi- sitan estar muy cerca de la membrana presináptica. Determinacio-
car las distintas moléculas que intervienen en el llamado acopla- nes realizadas sobre el transporte axónico, o transporte a través del
miento excitación-secreción. El conocimiento detallado de es- citoplasma celular, indican que la velocidad de transporte de or-

112 REV NEUROL 1998; 27 (155): 111-117

0111_155_R_04_Alés.p65 112 02/06/99, 10:59

 LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES

ganelas intracelulares se produce con extrema lentitud, compara-

do con el tiempo en microsegundos requerido para la fusión de Terminal presináptico
vesículas sinápticas. Por ejemplo, los motores moleculares de
actina, que posiblemente participan en el transporte de vesículas
u otras organelas a un botón sináptico, transportan vesículas a una
velocidad de dos micrómetros por segundo [5], lo que daría un Vesículas
sinápticas
retardo de al menos algunas centenas de milisegundos en trans- Vesículas
portar vesículas sinápticas del interior del terminal sináptico a la ancladas
zona submembranaria donde va a tener lugar la fusión. Estos tiem-
pos son demasiado largos para la rapidez requerida en una sinap-
sis. Para solventar este problema, la biología ha dispuesto una
población de vesículas sinápticas claras ancladas con la membra-
na presináptica (docked vesicles) (Fig. 2), que no necesitan reco-
rrer ni ser transportadas al lugar de fusión en el momento de la
llegada del potencial de acción. Estas vesículas se encuentran ya
a una distancia inferior a los 100 nm de la membrana plasmática,
por tanto, no tienen que transportarse a la membrana presináptica,
y poseen unas características moleculares específicas que las ha- Terminal postsináptico
cen responder con la fusión de membranas ante la llegada del
estímulo fisiológico para la fusión, es decir, el incremento de la
concentración intracelular de Ca2+ por la llegada del potencial de Figura 2. Poblaciones de vesículas sinápticas en un terminal nervioso. La
acción a través del axón. Actualmente existen evidencias electro- mayor parte de las vesículas se encuentran en el citosol a distancias
superiores a los 100 nm. Una pequeña población de vesículas está anclada
fisiológicas, moleculares y morfológicas que sugieren la existen- y lista para la fusión ante la llegada de un potencial de acción. La presencia
cia de esta población de vesículas adosadas. de vesículas ancladas hace posible la rapidez en la transmisión sináptica.
El estudio funcional de las distintas poblaciones de vesículas
sinápticas ha avanzado de forma espectacular en los últimos años
gracias a la combinación de varias técnicas. Éstas incluyen técni- poder estudiar el fenómeno secretor con la utilización de técnicas
cas para fijar la concentración de Ca2+ en el citosol o terminal de medida de la superficie de membrana o la determinación elec-
sináptico, técnicas de simulación mediante ordenador de cómo troquímica de productos de secreción.
tienen lugar los cambios de concentración de Ca2+ en la zona Las técnicas de fijación de la concentración de Ca2+ se han
submembranaria, técnicas de medida de la exocitosis mediante la utilizado en combinación con técnicas que miden directamente la
determinación eléctrica de la superficie de membrana celular, exocitosis. La técnica con mayor resolución para estudiar la exo-
técnicas electroquímicas que permiten detectar la liberación de citosis es la de la medida de la capacidad eléctrica de la membrana.
neurotransmisores procedente de una única vesícula y técnicas de Esta técnica se basa en la relación directa que existe entre la ca-
fluorescencia en células únicas que permiten visualizar la dinámi- pacidad eléctrica de la membrana plasmática y la superficie de
ca de la exo y la endocitosis. membrana celular. Por tanto, cuando tiene lugar la exocitosis, que
produce un incremento neto en la superficie de membrana celular
Uso combinado de técnicas de fijación de la concentración al incorporarse la membrana vesicular en la membrana plasmáti-
de Ca2+ y medida de la capacidad eléctrica de la membrana ca, se produce un incremento de la capacidad eléctrica de la mem-
Una de las grandes dificultades para el estudio de la dependencia brana. Con esta técnica se pueden medir fusiones de vesículas
de Ca2+ en el proceso de exocitosis ha sido la imposibilidad de únicas de hasta 50 nm de diámetro.
mantener constante la concentración de Ca2+ intracelular. Sin este Hasta ahora, estas poderosas técnicas no se han podido utilizar
control de la concentración no es posible realizar estudios de dosis en un terminal sináptico en el sistema nervioso de mamíferos
respuesta y, por tanto, obtener información cinética de la exocito- debido a su reducido tamaño. La información sobre las distintas
sis. Desde la introducción de la técnica de patch-clamp [6] es poblaciones de vesículas se ha obtenido en células neuroendocri-
posible dializar el citosol de una célula con soluciones que contie- nas.
nen distintas concentraciones de Ca2+ y por tanto estudiar la de- Cuando se eleva la concentración de Ca2+ en el citosol median-
pendencia de Ca2+ de la exocitosis. Más recientemente se han te la fotólisis de DM-nitrofeno se observa que la superficie de la
desarrollado técnicas que permiten no sólo introducir una solu- membrana se incrementa en tres fases. La primera fase se produce
ción con concentración conocida de Ca2+, sino además permiten con un latencia muy corta después de haberse producido la eleva-
elevar la concentración de este ion a distintos niveles. El método ción de Ca2+ y determina la fusión de un pequeño número, pero con
más utilizado es el de liberar iones Ca2+ de compuestos enjaulados una gran rapidez, de vesículas con la membrana plasmática. En
(caged compounds). Estos compuestos enjaulados son molecular- células de la parte intermedia de la hipófisis la velocidad de fusión
mente muy similares a compuestos que tamponan Ca2+, como el de vesículas es de unas 17.000 vesículas por segundo [7], habién-
EGTA, pero que ante un estímulo intenso de luz (flash) se destru- dose obtenido resultados similares en células cromafines [8]. Pos-
yen y pierden su afinidad por los iones de Ca2+, provocando, por teriormente a esta fase se produce la liberación de vesículas a una
tanto, una liberación masiva de iones en el citosol. El compuesto velocidad inferior, unas 2.000 vesículas por segundo. Esta fase
enjaulado más utilizado ha sido el DM-nitrofeno, que permite incorpora un mayor número de vesículas y debido a su menor
liberaciones de Ca2+ controlables en función de la intensidad y velocidad perdura durante más tiempo. Finalmente, se produce en
duración del flash de luz. Así pues, en una misma célula se puede el citosol, mientras se mantiene elevada la concentración de Ca2+,
incrementar la concentración de Ca2+ a niveles conocidos y así una liberación residual a una menor velocidad. Estos datos se han

REV NEUROL 1998; 27 (155): 111-117 113

0111_155_R_04_Alés.p65 113 02/06/99, 10:59

 E. ALÉS, ET AL

decir, se activaría únicamente cuando las concentraciones de Ca2+

NT son muy elevadas, produciéndose, por tanto, la liberación del neu-
Endosoma
temprano H+ rotransmisor únicamente cuando se alcanzan concentraciones del
Entrada de NT
Vesiculación
orden de 100 µM. De esta forma se obtiene una respuesta más
Fusión de endosomas fásica que permite sincronizar la llegada de un potencial de acción
Translocación con la fusión de un grupo reducido de vesículas sinápticas.
Translocación

EL CICLO DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

Anclaje Endocitosis
Habilitación Flicker Fusión
transitoria
Fusión
completa
En los últimos años se ha producido un gran avance en el conoci-
Membrana ATP 4 Ca2+ Ca2+? miento de cómo una vesícula sináptica se fija a la membrana
plasmática
presináptica y cómo se dirige desde su lugar de síntesis a la mem-
Hendidura
brana presináptica. Se han descubierto proteínas que participan en
Ca2+
sináptica este proceso y que son las responsables de las distintas etapas por
1 2 3 4 5
las que tiene que pasar una vesícula sináptica hasta que sea reuti-
Figura 3. Ciclo vital de una vesícula sináptica. lizada en el terminal sináptico [10]. Las vesículas sinápticas atra-
viesan varias etapas hasta que pueden ser reutilizadas, éstas son: 1.
Síntesis de la vesícula sináptica a partir de endosomas tem-
interpretado como indicativos de vesículas que se encuentran en pranos; 2. Acumulación del neurotransmisor en el interior vesi-
distintas fases del proceso secretor, correspondiendo las que se cular; 3. Aproximación a la membrana presináptica; 4. Habilita-
liberan de forma más rápida a la población de vesículas más próxi- ción de la vesícula para la fusión; 5. Fusión y formación de un
mas a la membrana y más competentes para la fusión. Las otras poro que conecta el interior de la vesícula con el espacio extrace-
dos poblaciones de vesículas corresponden a vesículas de reserva lular; 6. Apertura completa del poro de fusión, y 7. Endocitosis
que únicamente son liberadas cuando se ha producido el agota- y recaptación de la membrana vesicular para la posterior síntesis
miento de la primera población de vesículas. La población de de vesículas. Estas etapas se muestran de forma esquemática en la
vesículas cercanas a la membrana plasmática se ha puesto de figura 3.
manifiesto en estudios de microscopía electrónica en células cro- La formación de vesículas a partir de endosomas tempranos
mafines [9]. (budding) es un proceso no bien estudiado y del que se desconocen
los factores que lo regulan. Sí parece que en la selección de la
vesícula participan proteínas con actividad GTPásica, que son las
EL SENSOR DE Ca2+ DE LAS VESÍCULAS ANCLADAS responsables de dirigir las vesículas sinápticas hacia la membrana
ES DE BAJA AFINIDAD presináptica. La fase de acumulación del neurotransmisor en el
En células excitables, como lo son las células neuroendocrinas y interior vesicular se produce mediante transportadores específi-
las neuronas, el factor activador fundamental de la exocitosis es cos para los distintos neurotransmisores en la propia membrana
el incremento de la concentración de Ca2+ en el citosol o terminal vesicular. Existen cuatro tipos de transportadores, cada uno de
sináptico. En estos tipos celulares la elevación de la concentración ellos es suficiente para introducir los distintos tipos de neurotrans-
de Ca2+ se produce por la entrada al citosol de los iones de Ca2+ a misores. Por ejemplo, las catecolaminas, serotonina y dopamina
través de canales iónicos voltaje-dependientes situados en la mem- pueden acumularse en el interior vesicular sólo por un único trans-
brana plasmática. Estos canales se abren por la despolarización portador que no discrimina entre los distintos neurotransmisores
generada por la invasión del terminal nervioso por el potencial de esta familia. Lo mismo ocurre para la acetilcolina y el glutama-
de acción, y permiten la entrada de iones de Ca2+ al interior to, que se acumulan por el mismo transportador. Por ejemplo, una
celular. Se debe recordar que los iones de Ca2+ penetran al inte- neurona con vesículas sinápticas colinérgicas puede liberar gluta-
rior celular gracias al enorme gradiente químico existente entre mato si éste es introducido en el soma mediante técnicas de mi-
el exterior y el interior celular (2 mM en el exterior comparado croinyección. Este ‘engaño’ se debe a la falta de selectividad del
con 20 nM en el interior, diferencia de cinco órdenes de magni- transportador de la vesícula sináptica. Para que un transportador
tud). La entrada de los iones de Ca2+ genera, a su vez, un gradiente funcione adecuadamente necesita que se forme un gradiente de
de concentración para este ion en el interior celular, alcanzándose protones (acidificación) en el interior vesicular. La disipación de
la máxima concentración en la vecindad del poro del propio canal este gradiente es el que utiliza el transportador de neurotransmi-
de Ca2+ y disminuyendo ésta hacia el interior celular. Este hecho sores para cargar la vesícula de neurotransmisor. El gradiente de
determina que las vesículas ancladas sientan concentraciones al- protones se genera gracias a la presencia en la membrana vesi-
tas de Ca2+, mientras que las vesículas de la población de reserva cular de una bomba de protones, similar a la que existe en las
únicamente detecten concentraciones más bajas de este ion. Si la vacuolas de las células vegetales, que consume ATP. Estos me-
maquinaria secretora respondiera con la fusión de vesículas sináp- canismos de concentración de neurotransmisor se han demostrado
ticas cuando se incrementa ligeramente la concentración de Ca2+ para las sinapsis catecolaminérgicas, donde la concentración de
en el citosol, tendría lugar una respuesta de exocitosis mantenida noradrenalina en el interior vesicular puede llegar a ser del orden
(vesículas ancladas y de reserva) hasta que se restableciera a ni- de 1 M. La aproximación de la vesícula a la membrana presináp-
veles basales la concentración de Ca2+. Este tipo de respuesta tica es un proceso regulado por el incremento residual de la con-
impediría discriminar la llegada de un nuevo estímulo ya que el centración de Ca2+ en el citosol. En estudios realizados en células
terminal aún estaría activo (liberando neurotransmisor) cuando cromafines se ha demostrado que los niveles de Ca2+ requeridos
llegara el siguiente potencial de acción. Por esta razón, se cree que para esta acción son del orden de unas pocas unidades micromo-
en un terminal nervioso el sensor de Ca2+ es de baja afinidad, es lares [8]. De esta forma, se garantiza un aporte continuo de vesí-

114 REV NEUROL 1998; 27 (155): 111-117

0111_155_R_04_Alés.p65 114 02/06/99, 10:59

 LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES

VS VS

Sfi
Sbv
Stg Stg

D
Sbv
CAC

NSF S25 M

Stx

Stx

Figura 4. Proteínas que participan en la fusión de vesículas sinápticas. Sbv: sinaptobrevina; NSF: proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida acoplado
a proteína SNAP; Stx: sintaxina; S25: SNAP-25; Stg: sinaptotagmina; Sfi: sinaptofisina; M: Munc18-1.

culas a la zona presináptica. A este nivel parece ser que los micro- de una forma dependiente de Ca2+ [15,16], acelerándose la aper-
túbulos son los principales responsables para esta aproximación. tura del poro de fusión cuando la concentración citosólica de Ca2+
Experimentos recientes sugieren que parte de los microtúbulos se se encuentra por encima de 1 mM. Este paso puede ser crítico para
tienen que desestructurar para facilitar la aproximación de las determinar si una fusión va a ser transitoria o completa, pues
vesículas a la zona submembranaria [11], siendo la destrucción de dependiendo de la cantidad de iones de calcio que hayan entrado
la capa submembranaria de actina dependiente de la concentra- durante el curso de un potencial de acción se producirá una fusión
ción citosólica de Ca2+. completa o transitoria. Esta hipótesis aún debe demostrarse a nivel
Las vesículas se anclan y se habilitan para la fusión con la de un terminal sináptico. La fusión completa de la vesícula permi-
membrana presináptica. Estudios recientes han demostrado nu- te la liberación de todo el contenido vesicular, quedando incorpo-
merosas etapas en este proceso. Un paso crítico para la habilita- rada la membrana de la vesícula sináptica con la de la membrana
ción es la presencia de ATP, que permite la habilitación (priming) plasmática. El siguiente paso que tiene lugar durante la exocitosis
de vesículas sinápticas. Por tanto, existen moléculas ancladas con es la recaptación de membrana mediada por vesículas revestidas
la membrana plasmática que no son susceptibles de producir fu- de clatrina. Este paso también parece ser dependiente de Ca2+ y de
sión. El incremento de los niveles intracelulares de Ca2+ permite unas proteínas asociadas al citoesqueleto, entre las que la dinami-
la fusión de membranas y la apertura del poro de fusión. En vesí- na parece desempeñar un papel relevante. La posterior transloca-
culas sinápticas parece que existe la maquinaria secretora y los ción de la vesícula hasta su completo reciclado está aún poco
canales de calcio responsables para la fusión se encuentran muy estudiada. El ciclo completo de una vesícula sináptica se produce
próximos. Por esta razón, la maquinaria secretora detecta y se en la placa neuromuscular en aproximadamente 1 minuto [17].
activa por concentraciones muy elevadas de Ca2+ citosólico. La
apertura del poro de fusión determina, desde su formación, la
salida del neurotransmisor al espacio extracelular [12]. Experi- BASES MOLECULARES DEL ANCLAJE
mentos realizados en mastocitos y células cromafines ponen de DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS
manifiesto que cuanto menor es el tamaño de una vesícula secre- Las proteínas implicadas en el anclaje de las vesículas sinápticas
tora, mayor es la fracción de contenido liberada durante las prime- con la membrana presináptica, y el lugar exacto donde éste debe
ras etapas de expansión del poro de fusión. La apertura del poro producirse, se han descubierto muy recientemente. La hipótesis
de fusión puede ser un fenómeno transitorio (flicker) [13], con lo del lugar de reconocimiento y los cambios conformacionales que
que incluso en situaciones de fusión transitoria se produce libera- tienen lugar hasta que se produce la apertura del poro de fusión se
ción de neurotransmisor al espacio extracelular [12]. Esta hipóte- muestran en la figura 4. Esta hipótesis, conocida como la hipótesis
sis de liberación de neurotransmisor durante fusiones transitorias SNARE, fue propuesta por el grupo de Rothman en 1993 [18]. Se
fue propuesta como mecanismo de liberación en la placa neuro- basa en la presencia de dos proteínas complementarias, una situa-
muscular hacia los años 80 [14], pero tuvo escaso eco en la comu- da en la membrana vesicular y la otra en la membrana presináp-
nidad científica internacional después de la instauración de la tica. Estas dos proteínas son distintas dependiendo del tejido don-
teoría vesicular y de reciclado de membrana [2]. Experimentos de se encuentren y son el sustrato de una proteína soluble existente
recientes realizados con técnicas de patch-clamp para determinar en el citosol, llamada NSF, o proteína de fusión sensible a N-
el incremento de superficie que tiene lugar durante la exocitosis etilmaleimida. Esta proteína forma un complejo en el citosol con
y la combinación de técnicas electroquímicas que permiten detec- otra proteína, la SNAP, o proteína de acoplamiento de la NSF.
tar la liberación de neurotransmisor de vesículas únicas están Este complejo tiene actividad ATPásica y forma el complejo de
permitiendo abordar de nuevo esta hipótesis de liberación a través fusión cuando se une a las dos proteínas complementarias comen-
de fusiones transitorias. La apertura del poro de fusión se produce tadas anteriormente. Por este motivo, las proteínas complemen-

REV NEUROL 1998; 27 (155): 111-117 115

0111_155_R_04_Alés.p65 115 02/06/99, 10:59

 E. ALÉS, ET AL

tarias reciben el nombre de receptores de las SNAPS (SNARE). CONCLUSIONES Y NUEVAS PERSPECTIVAS
La proteína existente en la membrana vesicular (SNAREv) se ha La gran confluencia de resultados obtenidos en los últimos años
identificado y se la ha denominado, además, sinaptobrevina. La con técnicas tan diversas como biología molecular, electrofisiolo-
proteína existente en la membrana presináptica (SNAREt) se gía y técnicas fluorescentes ha permitido identificar y disecar
conoce con el nombre de sintaxina. La formación del complejo distintas etapas que intervienen en la liberación de neurotransmi-
de fusión es el paso crítico previo a la fusión de membranas. sores a la hendidura sináptica. Gracias a este abordaje multidisci-
Además de estas proteínas, existe una quinta proteína que par- plinar se han identificado moléculas que participan en la fusión de
ticipa en el complejo de fusión, la SNAP-25. Tanto la sinapto- vesículas sinápticas en el terminal presináptico, moléculas que
brevina, como la sintaxina y la SNAP-25 son los lugares de detectan los niveles de calcio en el terminal presináptico –que son
actuación de las toxinas botulínica y tetánica. Una vez alcanzada las responsables de disparar el proceso de fusión–, y las distintas
esta fase del proceso, se adhiere una nueva proteína al complejo etapas por la que pasa una vesícula sináptica antes de liberar el
de fusión, la sinaptotagmina. Esta proteína parece ser el sensor neurotransmisor. Esta amplia visión del funcionamiento de un
de la concentración de Ca2+. La sinaptotagmina entra a formar terminal sináptico ha permitido comprender en profundidad, a
parte del complejo de fusión y parece que debe salir del lugar nivel molecular y fisiológico, entre otros, los mecanismos de ac-
donde se va a generar el poro de fusión para que éste pueda formar- ción de neurotoxinas como la tetánica y la botulínica. Sin embar-
se. La sinaptotagmina requiere de la unión de varios iones de Ca2+ go, aún quedan por dilucidar aspectos tan importantes como las
para que pueda realizar esta transición [10]. Los factores que de- bases moleculares y fisiológicas del estrecho acoplamiento que
terminan la expansión del poro de fusión no son conocidos, aun- tiene lugar entre la maquinaria secretora y los canales de calcio
que se conoce el papel de los iones de Ca2+ a este nivel. Para que del terminal presináptico y la estrecha regulación a la que está
se produzca la fusión de vesículas sinápticas en el lugar apropiado sometido un terminal nervioso para que funcione según las de-
(zona activa) parece ser que otra proteína, Munc18-1, desempeña mandas de transmisores sinápticos particulares. Una mejor com-
un papel fundamental. La sinaptofisina se ha postulado como la prensión de estos aspectos será sólo posible con el desarrollo de
responsable de formar el poro de fusión, aunque esta hipótesis aún nuevas técnicas que permitan estudiar el fenómeno secretor en
está por demostrar. terminales sinápticos individuales.

BIBLIOGRAFÍA
1. Del Castillo J, Katz B. Quantal components of the end-plate potential. the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.
J Physiol 1954; 124: 560-73. Neuron 1995; 15: 1085-96.
2. Heuser JE, Reese T. Evidence for recycling of synaptic vesicle mem- 10. Sudhof TC. The synaptic vesicle cycle: A cascade of protein-protein
brane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J interactions. Nature 1995; 375: 645-53.
Cell Biol 1973; 57: 315-44. 11. Trifaro JM, Vitale ML. Cytoskeleton dynamics during neurotransmit-
3. Katz B, Miledi R. The measurement of synaptic delay, and the time ter release. Trends Neurosci 1993; 16: 466-72.
course of acetylcholine release at the neuromuscular junction. Proc R 12. Álvarez de Toledo G, Fernández-Chacón R, Fernández JM. Release of
Soc Lond B Biol Sci 1965; 161: 483-95. secretory products during transient vesicle fusion. Nature 1993; 363: 554-7.
4. Eccles JC, Jaeger JC. The relationship between the mode of operation 13. Fernández JM, Neher E, Gomperts BD. Capacitance measurements
and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature 1984;
end organs. Proc R Soc Lond B Biol Sci 1958; 148: 38-56. 312: 453-5.
5. Darnell J, Lodish H, Baltimore D. Molecular cell biology. New York: 14. Ceccarelli B, Hurlbut WP. Ca2+-dependent recycling of synaptic vesi-
Scientific American Books; 1990. cles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol 1980; 87: 297-303.
6. Hamill OP, Marty A, Neher E, et al. Improved patch-clamp techniques 15. Fernández-Chacón R, Álvarez de Toledo G. Cytosolic calcium facili-
for high-resolution current recording from cells and cell-free mem- tates release of secretory products after exocytotic vesicle fusion. FEBS
brane patches. Pflugers Arch 1981; 391: 85-100. Letters 1995; 363: 221-5.
7. Thomas P, Wong JG, Almers W. Millisecond studies of secretion in 16. Hartmann J, Lindau M. A novel Ca2+-dependent step in exocytosis
2+
single rat pituitary cells stimulated by flash photolysis of caged Ca . subsequent to vesicle fusion. FEBS Letters 1995; 363: 217-20.
EMBO J 1993; 12: 303-6. 17. Betz WJ, Bewick GS. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at
8. Neher E, Zucker RS. Multiple calcium-dependent processes related to the frog neuromuscular junction. Science 1992; 255: 200-3.
secretion in bovine chromaffin cells. Neuron 1993; 10: 21-30. 18. Sollner T, Whiteheart SW, Brunner MH, et al. SNAP receptors impli-
9. Parsons TD, Coorssen JR, Horstmann H, Almers W. Docked granules, cated in vesicle targeting and fusion. Nature 1993; 362: 318-24.

LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES: LIBERTAÇÃO DE NEUROTRANSMISORES:

UN PROCESO DE FUSIÓN DE MEMBRANAS UM PROCESSO DE FUSÃO DE MEMBRANAS
QUE TRANSCURRE EN FRACCIONES DE MILISEGUNDOS QUE DECORRE EM FRACÇÕES DE MILISEGUNDOS
Resumen. Introducción. Las bases fisiológicas de la liberación de Resumo. Introdução. As bases fisiológicas da libertação de neuro-
neurotransmisores a la hendidura sináptica quedaron establecidas transmisores na fenda sináptica foram estabelecidas graças aos tra-
gracias a los trabajos pioneros de Katz, Del Castillo y Miledi en la balhos pioneiros de Katz, Del Castillo e Miledi na placa neuromus-
placa neuromuscular. Estos experimentos obtuvieron una corrobo- cular. Estas experiências tiveram uma corroboração morfológica
ración morfológica con los experimentos realizados por Heuser y com as experiências realizadas por Heuser e Reese. No entanto, só
Reese. Sin embargo, sólo muy recientemente se ha obtenido informa- muito recentemente se obteve informação detalhada sobre como se
ción detallada sobre cómo se produce a nivel molecular la fusión de produz, a nível molecular, a fusão de vesículas sinápticas com o
vesículas sinápticas con el terminal presináptico. Gracias a estos terminal pré-sináptico. Graças a estes estudos pode-se conhecer o
estudios se ha podido conocer el mecanismo de acción de la toxina mecanismo de acção da toxina tetânica e botulínica, e as diversas
tetánica y botulínica, y las distintas etapas por las que atraviesa una etapas pelas quais passa uma vesícula sináptica até libertar o seu
vesícula sináptica hasta liberar su contenido a la hendidura sináp- conteúdo na fenda sináptica. Desenvolvimento. O grande conjunto
tica. Desarrollo. La gran confluencia de resultados obtenidos en los de resultados obtidos nos últimos anos com técnicas tão diversas
últimos años con técnicas tan diversas como de biología molecular, como da biologia molecular, electrofisiologia e técnicas fluorescen-
electrofisiología y técnicas fluorescentes está permitiendo identifi- tes estão a permitir identificar as moléculas que participam na fusão
car las moléculas que participan en la fusión de vesículas sinápticas de vesículas sinápticas no terminal pré-sináptico, moléculas que

116 REV NEUROL 1998; 27 (155): 111-117

0111_155_R_04_Alés.p65 116 02/06/99, 10:59

 LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES

en el terminal presináptico, moléculas que detectan los niveles de detectam os níveis de cálcio no terminal pré-sináptico e as diversas
calcio en el terminal presináptico y las distintas etapas por la que etapas pelas que passa uma vesícula sináptica antes de libertar o
pasa una vesícula sináptica antes de liberar el neurotransmisor. neurotransmisor. Conclusões. Os dados obtidos recentemente au-
Conclusiones. Los datos obtenidos recientemente amplían conside- mentam considerávelmente a perspectiva molecular dos eventos
rablemente la visión molecular de los eventos que tienen lugar en la que têm lugar na transmissão sináptica. No entanto, ficam aínda
transmisión sináptica. Sin embargo, aún quedan por dilucidar as- por clarificar aspectos tão importantes como as bases moleculares
pectos tan importantes como las bases moleculares y fisiológicas del e fisiológicas do estrecho acoplamiento que ocorre entre a maqui-
estrecho acoplamiento que tiene lugar entre la maquinaria secretora naria secretora e os canais de cálcio do terminal pré-sináptico e a
y los canales de calcio del terminal presináptico y la estrecha regu- estreita regulação a que está sobmetida um terminal nervoso para
lación a la que está sometido un terminal nervioso para que funcione que funcione de acordo com as necessidades de transmisores si-
según las demandas de transmisores sinápticos particulares. Una mejor nápticos particulares. Uma melhor comprenssão destes aspectos
comprensión de estos aspectos será sólo posible con el desarrollo de será possível apenas com o desenvolvimento de novas técnicas que
nuevas técnicas que permitan estudiar el fenómeno secretor en termi- permitam estudar o fenómeno secretor nos terminais sinápticos
nales sinápticos individuales [REV NEUROL 1998; 27: 111-7]. individuales [REV NEUROL 1998; 27: 111-7].
Palabras clave. Canales de calcio. Capacitancia. Exocitosis. Neuro- Palavras chave. Canais de cálcio. Neuro transmisores. Transmissão
transmisores. Transmisión sináptica. Vesículas sinápticas. sináptica. Vesículas sinápticas.

REV NEUROL 1998; 27 (155): 111-117 117

0111_155_R_04_Alés.p65 117 02/06/99, 10:59