Tesis de Lactobacillus

Villarreal Fernanda - 2002 -
Universidad Nacional del Litoral
Tesis presentada como parte de los requisitos de la

Universidad Nacional del Litoral, para la obtención del
Grado Académico de Magister en Ciencia y Tecnología de
los Alimentos
“Aislamiento y Caracterización de
Lactobacilos intestinales con Potencial
Probiótico”
Programa de Lactología Industrial (PROLAIN)
Bqca. Fernanda Villarreal
Director: Dr. Jorge Alberto Reinheimer

A mi familia
Agradecimientos
 Al Dr. Jorge Alberto Reinheimer, mi Director de tesis, por

su generosa paciencia y conocimientos y por conducirme
por este camino lleno de obstáculos y aciertos, el cual pude
recorrer gracias a su permanente apoyo y consejo.
 A Gabriel, por su amistad, compañerismo y por brindarme

sus conocimientos.
 A Andrea, por su amistad permanente y los lindos

momentos compartidos.
 A Viviana, Nanci, Ana, Mario y todos mis compañeros del

PROLAIN, quienes siempre me hicieron sentir partícipe de
este gran grupo de trabajo que todos hemos celebrado más
de una vez.
Resumen
El consumidor contemporáneo cada vez se encuentra más expuesto a los nuevos
“alimentos funcionales”. Entre ellos, los ya conocidos Probióticos ofrecen no sólo
propiedades organolépticas y nutritivas definidas, sino que también se postulan como los
“mejoradores de la salud del huésped”. Esto se basa en la interacción con la microflora
intestinal, siendo esta modulación el aspecto más intensamente estudiado de dichos alimentos.
Probiótico puede definirse como “monocultivo o cultivo mixto de microorganismos
vivos que, administrados al hombre o animal como suplemento alimentario, ejercen un efecto
beneficioso en el huésped a través del mejoramiento de las propiedades de la microflora
indígena”. También se incluyen en esta definición a componentes bacterianos que pueden
contribuir a tales efectos.
Las bacterias más ampliamente usadas como probióticos para humanos son
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y Bifidobacterium spp.
Estos microorganismos deben cumplir una serie de requisitos para ser empleados con
tal fin: sobrevivir a las condiciones ambientales, establecerse y colonizar el lugar donde
deberá ser activo, no generar respuestas inmunológicas adversas, ni respuestas tóxicas,
alérgicas, mutagénicas o carcinógenas, ser genéticamente estables y mantenerse viables
durante el procesamiento y almacenamiento del producto que los vehiculiza.
La capacidad de sobrevivir al proceso enzimático de la digestión, la acidez gástrica y
las secreciones biliares en el intestino y así conservar su viabilidad, es otro de los requisitos
fundamentales para su uso.
En el mundo existe una gran variedad de productos lácteos fermentados y no
fermentados, formulados con bacterias probióticas (Lactobacillus y Bifidobacterium): leches
ácidas, yogures y leches fermentadas, quesos, cremas ácidas, leches fortificadas y una
Resumen
considerable variedad de postres.
El objetivo del presente trabajo fue aislar e identificar bacterias de origen intestinal
humano, para luego caracterizarlas desde el punto de vista probiótico y tecnológico.
Para tal fin, se tomaron muestras de materia fecal de bebés previamente seleccionados
y por técnicas de aislamiento y purificación que emplean medios de cultivo selectivos y no
selectivos, se obtuvieron 54 aislamientos que respondían a la morfología celular de interés.
Posteriormente se identificaron bioquímicamente (fermentación de carbohidratos), resultando
50 de ellos pertenecientes a la especie Lactobacillus casei y 4 a Lactobacillus acidophilus. Sin
embargo, los estudios genéticos realizados (perfiles RAPD-PCR) orientaron hacia un cambio
de identificación: Lactobacillus casei se asignó como Lactobacillus rhamnosus y
Lactobacillus acidophilus como Lactobacillus gasseri.
En relación a la resistencia de los aislamientos frente a las barreras biológicas del
tracto gastrointestinal humano, se estudió la tolerancia de los mismos al exponerlos a una
solución gástrica simulada (Método de Desarrollo en Medio Líquido), resultando su
viabilidad celular marcadamente cepa dependiente. Otro de los estudios llevados a cabo fue la
resistencia a la bilis por el Método de Ensayo de Difusión en Agar (EDA) para el que, a partir
de la concentración de 0.6% de bilis, se observaron halos de inhibición del crecimiento
bacteriano para la casi totalidad de los aislamientos, con excepción de los clasificados como
Lactobacillus gasseri, que demostraron la mayor resistencia.
Para estudiar las propiedades probióticas de los aislamientos, se procedió a realizar los
siguientes ensayos:
1. Deconjugación de ácidos biliares, para lo cual se formularon medios de
cultivos agarizados que contenían cuatro ácidos biliares, individualmente (taurocolato de

Resumen
sodio, taurodeoxicolato de sodio, glicolato de sodio, glicodeoxicolato de sodio). Como
resultado de dicho estudio se encontró que los únicos aislamientos que poseían actividad
de deconjugación fueron las cepas de Lactobacillus gasseri.
2. Actividad de -galactosidasa. El mismo se realizó con el método de Miller. En
este estudio, no se detectó actividad de esta enzima en las cepas aisladas.
3. En el estudio de Hidrofobicidad, basado en el equilibrio de distribución de los
microorganismos entre una fase polar y no polar, se encontró para la mayoría de los
aislamientos porcentajes de hidrofobicidad moderados.
4. Para estudiar el poder inhibitorio que los aislamientos poseían frente a
bacterias patógenas, se empleó el Ensayo de Difusión en Agar (EDA) observándose,
prácticamente para todas ellas, un efecto inhibitorio (total o parcial) sobre el crecimiento
de aquellas.
Para caracterizar tecnológicamente los aislamientos, se procedió a realizar los
siguientes ensayos:
1. Resistencia al pH, para lo cual se sembraron los aislamientos en caldo
acidificado a tres valores de pH (4.5, 5.0 y 5.5). Como resultado, sólo se observó un leve
efecto inhibitorio para algunos aislamientos a pH 4.5.
2. Viabilidad de los aislamientos en leche acidificada, a 5ºC. Se realizaron
recuentos en placa para evaluar la sobrevida de los mismos bajo estas condiciones. Como
resultado, pudo concluirse para la totalidad de los aislamientos que la presencia de ácido
láctico en la leche y la refrigeración no afectaron la viabilidad celular.
3. Resistencia a compuestos de aroma. Al igual que en el estudio de resistencia al
pH, aquí se empleó el método de Desarrollo en Medio Líquido. Como resultado de este
Resumen
ensayo, se encontró que frente a ambos compuestos (diacetilo y acetaldehído) no se
observaron efectos inhibitorios sobre el crecimiento.
4. Resistencia a sales. En este ensayo, se empleó el mismo método antes
mencionado, no registrándose efecto alguno sobre el desarrollo producido por NaCl y KCl
(1%, 2% y 3%).
5. Interacción entre los aislamientos intestinales y bacterias lácticas de starters. Se
empleó el método de Ensayo de Difusión en Agar (EDA). Como resultado, se encontró
que ninguna de las bacterias lácticas de starters ejerció un efecto inhibitorio sobre el
desarrollo de los primeros. Sin embargo, éstos inhibieron el desarrollo de las cepas de
Lactococcus lactis y Streptococcus thermophilus empleadas, no así a Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus.
Finalmente, puede concluirse que los aislamientos intestinales obtenidos
(Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus gasseri), demostraron poseer variable capacidad de
resistir a las barreras biológicas del tracto gastrointestinal, mientras que sus propiedades
probióticas y tecnológicas más destacadas fueron el poder inhibitorio frente a bacterias
patógenas, la resistencia a sales y al pH, y mantenimiento de la viabilidad en leche
acidificada.
Indice General
1 INTRODUCCION 1
1.1 La microflora del tracto gastrointestinal 2
1.2 La microflora intestinal y su relación con el huésped 6
1.3 Las bacterias acidolácticas y las bifidobacterias. Aptitud probiótica 7
1.3.1 Taxonomía y características generales de las principales 12

bacterias probióticas
1.4 Estimulación de los organismos probióticos: Prebióticos 20
1.5 Características probióticas de bacterias intestinales 24
1.5.1 Resistencia bacteriana a la secreción gástrica y biliar 24
1.5.2 Deconjugación de ácidos biliares y efecto hipocolesterolémico 25
1.5.3 Estimulación de las respuestas inmunológicas y efecto antitumoral 27
1.5.3.1 Utilización de bacterias probióticas como inmunomoduladores 30
1.5.4 Propiedades antimicrobianas 34
1.5.4.1 Usos profilácticos y paliativos de las bacterias probióticas
en diversas patologías 37
1.5.4.2 Importancia de las bacterias probióticas en la nutrición humana 45
1.6 Participación de las bacterias probióticas en la formulación
de productos lácteos 49
1.6.1 Selección de cepas destinadas a la elaboración de productos probióticos 51
1.6.2 Supervivencia de las bacterias probióticas en los productos lácteos 54
1.6.3 Inocuidad de los microorganismos probióticos destinados
al consumo humano 68
Indice General
2 OBJETIVOS 74
3 MATERIALES y METODOS 77
3.1 Muestras 78
3.2 Aislamiento y conservación de bacterias intestinales 80
3.2.1 Aislamiento y purificación de cepas 80
3.2.2 Conservación de los aislamientos 82
3.3 Identificación de las cepas 84
3.3.1 Reactivación y mantenimiento de las cepas para su utilización 84
3.3.2 Características fenotípicas 85
3.3.3 Quimismo fermentativo: Homofermentación/Heterofermentación 86
3.3.4 Perfil de Fermentación de Carbohidratos 87
3.3.5 Desarrollo en medios selectivos (Método Ecométrico) 89
3.4 Diversidad genética de los lactobacilos intestinales (perfiles RAPD) 91
3.5 Resistencia a las Barreras Biológicas 93
3.5.1 Resistencia a la secreción gástrica 93
3.5.2 Cinética de muerte celular de los aislamientos en solución gástrica 95
3.5.3 Resistencia a la bilis 96
3.6 Caracterización probiótica de los aislamientos 98
3.6.1 Deconjugación de ácidos biliares 98
3.6.2 Actividad de -galactosidasa (lactasa) 100
3.6.3 Hidrofobicidad 104
3.6.4 Inhibición de bacterias patógenas 106
3.7 Caracterización tecnológica de los aislamientos 109

Indice General
3.7.1 Resistencia al pH 109
3.7.2 Resistencia a sales 111
3.7.3 Resistencia a compuestos de aroma (diacetilo y acetaldehído) 112
3.7.4 Viabilidad celular de los aislamientos en leche acidificada
y conservada a 5ºC 113
3.7.5 Interacciones entre lactobacilos intestinales y bacterias
lácticas de starters 117
3.7.5.a Evaluación del efecto producido por SLC de lactobacilos
intestinales sobre el desarrollo de bacterias lácticas de starter 117
3.7.5.b Evaluación del efecto producido por SLC de Lact. delbrueckii
subsp. bulgaricus Ab1, Streptococcus thermophilus 176 y
Lactococcus lactis Mo12 sobre el desarrollo de lactobacilos
intestinales 119
3.7.5.c Determinación de la naturaleza del agente inhibidor presente
en SLC de Lact. gasseri F37” frente a Streptococcus
thermophilus 176, Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 y
Lactococcus lactis Mo12 120
3.7.5.d Efecto de SLC de Lact. gasseri F37” y Lact. rhamnosus F71
frente a bacterias lácticas de starters (cinéticas de crecimiento) 123
4 RESULTADOS 127
4.1 Aislamiento y Purificación de bacterias intestinales 128
4.2 Identificación de las cepas aisladas 128
4.2.1 Características Fenotípicas 128

Indice General
4.2.2 Quimismo Fermentativo: Homofermentación/Heterofermentación 129
4.2.3 Perfil de Fermentación de Carbohidratos 132
4.2.4 Desarrollo en medios selectivos. Método Ecométrico 135
4.3 Diversidad genética de los lactobacilos intestinales (perfiles RAPD) 138
4.4.2 Cinética de muerte celular de los aislamientos en solución gástrica 145
4.6.5.a Evaluación del efecto producido por SLC de lactobacilos
intestinales sobre el desarrollo de bacterias lácticas de starters 172
4.6.5.b Evaluación del efecto producido por SLC de Lact. delbrueckii

Indice General
subsp. bulgaricus Ab1, Strep. thermophilus 176 y
L. lactis Mo12 sobre el desarrollo de lactobacilos intestinales 174
4.6.5.c Determinación de la naturaleza del agente inhibidor de SLC de
Lact. gasseri F37” frente a Strep. thermophilus 176, Lact.
delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 y Lactococcus lactis Mo12. 176
4.6.5.d Efecto de SLC de Lactobacillus gasseri F37” y Lactobacillus
rhamnosus F71 frente a bacterias lácticas de starters (cinéticas de
crecimiento) 179
5 DISCUSION 184
5.1 Identificación de las cepas aisladas 185

Indice General
6 CONCLUSIONES 212
7 BIBLIOGRAFIA 216
8 ANEXO 225
8.1 Medios de Cultivo 226
8.1.1 Medios de cultivo no selectivos 226
8.1.2 Medios de cultivo selectivos 234
8.1.3 Medios de cultivo modificados 235
8.2 Reactivos 236
8.3 Tablas 237

Indice de Tablas y Figuras
Tablas
Tabla 1- Detección de bacterias acidolácticas y bifidobacterias utilizando
técnicas de biología molecular. 14-15
Tabla 2- Sustratos de baja absorción (prebióticos) y sus efectos
sobre la microflora intestinal. 22-23
Tabla 3- Adhesión de lactobacilos a células epiteliales escamosas. 43
Tabla 4- Microorganismos probióticos empleados actualmente y sus
efectos sobre el status nutricional y la salud del huésped. 50
Tabla 5- Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre el tiempo
requerido para que el recuento de células viables de bacterias
probióticas disminuya 2 ordenes logarítmicos en leche fermentada. 57
Tabla 6- Efecto del pH del producto sobre el tiempo requerido para que el
recuento de células viables de bacterias probióticas
disminuya 2 ordenes logarítmicos en leche fermentada. 57
Tabla 7- Efecto de jugos de frutas adicionados a leche fermentada sobre el
tiempo requerido para que el recuento de células viables de
Lact. acidophilus CH5 (cepa Chr. Hansen) disminuya 2 ordenes
logarítmicos. 58
Tabla 8- Productos probióticos comerciales. 65-67
Tabla 9- Clasificación de microorganismos probióticos en función de su
bioseguridad para consumo humano. 69

Tabla 10- Características fenotípicas de los aislamientos
intestinales estudiados. 130-131
Tabla 11- Perfil de Fermentación de carbohidratos de los aislamientos
intestinales (Método API). 133-134
Tabla 12- Desarrollo de lactobacilos intestinales en medios selectivos
(Método Ecométrico). 136-137
Tabla 13- Pérdida de viabilidad celular para los aislamientos intestinales
en solución gástrica (pH3, 37ºC, 3h), expresada como disminución
en los recuentos (ordenes log.). 143-144
Tabla 14- Resistencia a la bilis de lactobacilos intestinales
(Ensayo de Difusión en Agar-EDA). 152-153
Tabla 15- Deconjugación de ácidos biliares producida por
lactobacilos intestinales. 155-156
Tabla 16- Actividad de -Galactosidasa para lactobacilos intestinales
(Método de Miller modificado). 161-162
Tabla 17- Hidrofobicidad (%) de los aislamientos intestinales, medida luego
de la partición de los mismos entre la fase polar (caldo MRS)
y no polar (n-hexadecano). 63
Tabla 18- Poder inhibitorio de los aislamientos intestinales frente a
Salmonella OMS-Ca, Staphylococcus aureus 76, Escherichia coli V517
y Listeria monocytógenes ATCC 15313 (Método EDA) 166-167
Tabla 19- Resistencia al pH, sales y compuestos de aroma de lactobacilos
intestinales (Método Desarrollo en Medio Líquido-DML) 169-170

Tabla 20- Sobrevida de los lactobacilos intestinales en leche acidificada
a 5°C (promedio de 2 determinaciones) 173
Tabla 21- Poder inhibitorio de SLC de los aislamientos intestinales sobre el
crecimiento de Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1y Hb2,
Lactococcus lactis A6 y Mo12 y Streptococcus thermophilus 176 y
A4 (Método EDA) 175
Tabla 22- Patrón de fermentación de carbohidratos para el género Lactobacillus 238
Tabla 23- Patrón simplificado de fermentación de carbohidratos para el género
Lactobacillus 239
Tabla 24- Sobrevida de lactobacilos intestinales en leche acidificada a 5 Cº
(promedio de 2 determinaciones) 240-241
Figuras
Figura 1- Estrategia para la selección de cepas probióticas 53
Figura 2- Esquema utilizado para el aislamiento y purificación de bacilos intestinales
a partir de muestras de materia fecal de bebés 83
Figura 3- Metodología para evaluar la naturaleza química de agentes inhibidores
del crecimiento de la cepa Lactobacillus rhamnosus F37” 122
Figura 4- Metodología para evaluar las interacciones entre las cepas de
Lact. gasseri F37” y Lact. rhamnosus F71 frente a bacterias lácticas de starters
(Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1, Streptococcus thermophilus 176

y Lactococcus lactis Mo12) 126
Figura 5- Dendrograma obtenido por comparación (Programa Gel Compare,
Applied Maths, Bélgica) y reagrupamiento (Método UPGMA: Unweighted
Pair Group Method using Arithmetic Average) de los perfiles RAPD
de cepas de Lact. rhamnosus aisladas de bebés 139
Figura 6- Dendrograma obtenido por comparación (Programa Gel Compare,
Applied Maths, Bélgica) y reagrupamiento (Método UPGMA: Unweighted
Pair Group Method using Arithmetic Average) de los perfiles RAPD
de cepas de Lact. rhamnosus y Lact. gasseri aisladas de bebés 141
Figura 7- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37 en solución
gástrica (37ºC, 3h, pH 3) () y en buffer fosfato (control,  ) 146
Figura 8- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37’ en solución
gástrica (37ºC, 3h, pH 3) () y en buffer fosfato (control, ) 146
Figura 9- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37’a en solución
Figura 10- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37” en solución
Figura 11- Cinética de muerte celular de Lactobacillus rhamnosus F64 en solución
Figura 12- Cinética de muerte celular de Lactobacillus rhamnosus F83 en solución
Figura 13- Cinética de muerte celular de Lactobacillus acidophilus La5 en solución

Figura 14- Cinética de muerte celular de Lactobacillus casei A13 en solución
Figura 15- Características del crecimiento de Lact. gasseri F37, F37’, F37’a y F37”
y Lact. rhamnosus F44 y F49 en agar MRS-taurocolato de sodio 0.5% 158
Figura 16- Características del crecimiento de Lact. gasseri F37’ y F37’a y
Lact. rhamnosus F44, F49, F50 y F53 en agar MRS-taurocolato de sodio 0.5% 158
y Lact. rhamnosus F44 y F49 en agar MRS-taurodeoxicolato de sodio 0.5% 159
y Lact. rhamnosus F44 y F49 (ausencia de desarrollo) en
agar MRS-glicolato de sodio 0.5% 159
y Lact. rhamnosus F44 y F49 (ausencia de desarrollo) en
agar MRS-glicodeoxicolato de sodio 0.5% 160
Figura 20- Observación microscópica de la distribución de un lactobacilo intestinal
entre las fases orgánica y acuosa (contraste de fases,1000x) 164
Figura 21- Capacidad inhibitoria de Lact. gasseri F37’, F37” y Lact. rhamnosus F3,
F44 y F64’ frente a Staphylococcus aureus 76 (Método EDA) 168
Figura 22- Naturaleza del agente inhibidor del SLC de Lact. gasseri F37”
sobre el crecimiento de Streptococcus thermophilus 176 177
sobre el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 177

sobre el crecimiento de Lactococcus lactis Mo12 178
Figura 25- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Streptococcus thermophilus 176
control () y con adición de SLC de Lact. gasseri F37” () (37ºC, 24h) 180
Figura 26- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lact. gasseri F37” control ()
y con adición de SLC de Streptococcus thermophilus 176 () (37ºC, 24h) 180
Figura 27- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lact. delbrueckii
subsp. bulgaricus Ab1 control () y con adición de SLC de
Lactobacillus gasseri F37” () (37ºC, 24h) 181
Figura 28- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lact. gasseri F37” control ()
y con adición de SLC de Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1
() (37ºC, 24h) 181
Figura 29- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lact. delbrueckii
subsp. bulgaricus Ab1 control () y con adición de SLC de
Lact. rhamnosus F71 () (37ºC, 24h) 182
Figura 30- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lact. rhamnosus F71 control ()
y con adición de SLC de Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1
() (37ºC, 24h) 182
Figura 31- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lactococcus lactis Mo12
control () y con adición de SLC de Lact. gasseri F37” () (37ºC, 24h) 183
Introducción
1.1 La microflora del tracto gastrointestinal.
Durante su desarrollo gestacional, el ser humano se encuentra protegido por un
ambiente fisiológicamente adecuado y estéril. Sin embargo, al nacer es invadido por una gran
variedad de especies microbianas provenientes de las mucosas maternas, consecuencia
inmediata del paso por el canal vaginal y el contacto con la piel, como también del medio
ambiente que lo rodea y de la alimentación (1). A partir de ese momento se establece una
residencia bacteriana en el tracto grastrointestinal, la cual va modificándose con la edad
imponiéndose al mismo tiempo un patrón de distribución. Factores ambientales, interacciones
fisiológicas hospedador-microorganismo y los componentes de la dieta gobiernan esta
distribución, siendo dicha dieta el principal regulador de la frecuencia y concentración de
especies individuales y grupos bacterianos que colonizan el intestino, como así también de la
actividad metabólica de los mismos.
La flora intestinal humana como animal, que incluye tanto bacterias anaerobias
facultativas como anaerobias estrictas, posee características de especificidad de especie como
también especificidad individual (2). Éstas han sido demostradas por diversos autores, los
cuales teniendo en cuenta los diferentes biotipos de bacterias de una especie a otra, han
podido comprobar que no es posible la “normalización” de la microflora del tracto
gastrointestinal cuando a animales libres de gérmenes se los inocula con una microflora
intestinal proveniente de otra especie animal. En este aspecto, estudios experimentales “in
vivo” en animales han sido indispensables para formular los conceptos básicos de la ecología
microbiana del tracto gastrointestinal humano y animal. La utilidad de estos estudios, y el
modelo experimental elegido dependerá de la respuesta que el investigador esté buscando. En
2
Introducción
muchos casos, no puede establecerse una certera correlación entre estudios “in vivo” e “in
vitro”. Un ejemplo de ello es la suceptibilidad de los lactobacilos o enterococos a la
bacteriocina Lactacin F ensayada en el laboratorio, la cual no es necesariamente predictiva de
su efecto antibacteriano “in vivo”. Queda claro entonces, la necesidad de seguir evaluando,
para cada aspecto en particular, la metodología más adecuada (3).
Como se mencionó anteriormente, el tubo digestivo alberga en toda su extensión
distintas agrupaciones bacterianas, estableciéndose de esta manera diversos nichos ecológicos.
A continuación se hará una breve reseña de la flora que puede hallarse en los distintos
sectores del mismo.
La saliva es la principal fuente de bacterias que ingresan al estómago. Éstas, provienen
del medio externo así como de las mucosas y piel con las que el neonato toma contacto al
nacer y alimentarse con la leche materna. El contenido de bacterias en la saliva está
comprendido entre 104 y 109 UFC/ml.
En el estómago, el ácido clorhídrico secretado por las células parietales de la mucosa
gástrica ejerce un efecto germicida atribuído al bajo pH que éste genera, que en condiciones
fisiológicas normales alcanza valores inferiores a 3. A este factor se debe la escasa cantidad
de microorganismos que en él se alojan (inferior a 103 UFC/ml de secreción gástrica), entre
los que podemos mencionar enterococos, enterobacterias, bacteroides, bifidobacterias y
lactobacilos provenientes de la flora bucal y de la ingesta de alimentos.
En el intestino delgado, la distribución bacteriana comienza con recuentos bajos a
nivel de duodeno, aproximadamente 104 UFC/g de contenido intestinal, ya que en esta zona se
vuelcan las secreciones gástricas (aún más intensas en el período post-prandial) que, junto a
3
Introducción
los movimientos peristálticos de la musculatura, la convierten en la menos colonizada. A
medida que nos acercamos al íleum, en su porción más distal, el número de microorganismos
se incrementa notoriamente, alcanzando recuentos de 107 UFC/g, correspondientes a los
siguientes tipos de bacterias: lactobacilos, estreptococos, bacteroides, enterobacterias, y
bifidobacterias.
El colon es el mayor reservorio de microorganismos (fundamentalmente anaerobios),
albergando entre 1010-1012 UFC/g de contenido intestinal, pudiendo encontrarse Bacteroides,
Peptostreptococcus, Eubacterium, Peptococcus, Streptococcus faecalis, clostridios,
enterobacterias (Escherichia coli,por ejemplo), Bifidobacterium y en menor proporción,
Lactobacillus (4).
Del mismo modo que se establece un patrón de distribución microbiana a lo largo de
las distintas porciones del tracto gastrointestinal (TGI), el mismo se va modificando a lo largo
de la vida del individuo.
La microflora intestinal a las 24 h del nacimiento está gobernada por enterococos,
Escherichia coli y Clostridium spp. Al tercer día predominan las bifidobacterias, las cuales se
mantienen en niveles de 1010-1011 UFC/g de contenido intestinal mientras que otras especies
caen en número (5). Se ha observado en bebés alimentados por lactancia natural, en
comparación a aquellos alimentados con fórmulas lácteas comerciales, que la concentración
de bifidobacterias intestinales es similar en ambos casos, constituyendo el 99% de la
población bacteriana total. Sin embargo, los neonatos alimentados con leche materna poseen
menor número de bacterias productoras de toxinas tales como clostridios, enterococos, etc.,
probablemente como consecuencia del aporte protector de inmunoglobulinas, lactoglobulinas
4
Introducción
lisozima en la leche materna, como así también de factores de crecimiento como la N-
acetilglucosamina, presente exclusivamente en la secreción mamaria (2,5).
Cuando finaliza la lactancia y con el cambio hacia una dieta sólida en la infancia,
bacterias anaerobias estrictas, como Bacteroides, Eubacterium y cocos anaerobios, se vuelven
predominantes en la microflora. En adolescentes y jóvenes, las bifidobacterias caen en
número apareciendo otras especies que formarán parte de la flora intestinal estable del adulto.
Es conveniente mencionar que el hallazgo del género Bifidobacterium es siempre un signo de
condiciones saludables del huésped (5). Con la edad también puede observarse un cambio en
el pH de las heces hacia la neutralidad, favoreciendo de este modo fermentaciones bacterianas
de mayor toxicidad para la salud (2).
En la vejez, se incrementan los géneros “putrefactivos” dentro de los cuales podemos
citar Clostridium perfringens, junto a una disminución (en número) de bifidobacterias, cambio
éste que explicaría la mayor incidencia de patologías entéricas y no entéricas (de tipo
neoplásicas) relacionadas al envejecimiento de los órganos y al deterioro del sistema
inmunológico que puede evidenciarse en este grupo etario (5).
La flora intestinal protege al individuo de la colonización por microorganismos
patógenos u oportunistas foráneos debido a que se encuentra ocupando los sitios disponibles
en la mucosa (inhibición competitiva) y a factores de regulación autogénica (síntesis de ácidos
grasos, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas etc.). Dicha flora se establece mediante
autoselección, y es influenciada por factores tales como higiene excesiva, terapia antibiótica y
stress. En las enfermedades que cursan con diarreas, la terapia antimicrobiana por vía oral está
dirigida hacia el patógeno en cuestión pero también afecta a las demás bacterias intestinales
5
Introducción
suceptibles, ocasionando gastroenteritis asociadas. El stress es otro factor que va en
detrimento de la flora beneficiosa (bacterias acidolácticas y bifidobacterias) y favorece un
incremento de bacterias coliformes. También juega un rol similar, la finalización temprana de
la lactancia en el recién nacido (6).
1.2 La microflora intestinal y su relación con el huésped.
Las actividades metabólicas de la flora intestinal pueden impactar de diversa manera
sobre la salud del huésped, tanto en su detrimento como en su beneficio. Si el balance entre
bacterias que sólo muestran un efecto benéfico y aquellas potencialmente toxicogénicas se
pierde por alguna razón particular, y este desequilibrio determina un predominio de aquellas
bacterias que sólo producen un efecto nocivo, puede verse incrementada la producción de
sustancias putrefactivas, toxinas y carcinógenos, afectando el normal funcionamiento de los
órganos depuradores y la actividad inmunológica del organismo, lo cual lleva
inexorablemente hacia un estado patológico. Por otro lado, encontramos en la microbiota
intestinal bacterias que sólo poseen acción benéfica para la salud, como las bacterias
acidolácticas y bifidobacterias; y finalmente aquellas bacterias que ejercen tanto efectos
benéficos como nocivos.
A continuación se resumen los principales efectos que produce la población bacteriana
intestinal sobre la salud del hospedador (6):
 Producción de tóxicos, carcinógenos o mutágenos a partir de los constituyentes
6
Introducción
de la dieta o secreciones endógenas, a través de actividades enzimáticas.
 Detoxificación de metabolitos tóxicos.
 Alteración de la suceptibilidad del huésped frente a la inducción de tumores.
 Modulación de la inmunidad celular en el intestino.
 Efecto protector al ofrecer resistencia a la colonización por microorganismos
foráneos.
Es importante mencionar otra de las funciones que la flora intestinal posee en relación
al metabolismo “depurativo” de nuestro organismo. Esta está relacionada con la circulación
enterohepática (CEH) a través del sistema porta que comunica el intestino con el hígado.
Esteroides endógenos o exógenos son conjugados con ácido glucurónido por este órgano (uno
de los más importantes detoxificadores del organismo) y posteriormente secretados a la luz
intestinal donde la actividad -glucuronidasa bacteriana del colon puede hidrolizarlos,
contribuyendo de este modo a su reabsorción y mayor retención de esteroides y xenobióticos
dentro del organismo, potenciando su acción farmacológica (7).
1.3 Las bacterias acidolácticas y las bifidobacterias. Aptitud
probiótica.
Podemos definir a las bacterias acidolácticas (BAL) como bacterias gram (+), catalasa
(-), no esporuladas, cocos o bacilos, que producen ácido láctico como principal producto final
de la fermentación de carbohidratos. Un importante carácter es usado para la diferenciación
7
Introducción
de las bacterias acidolácticas, y es el modo de fermentación de azúcares bajo condiciones
stándares: concentración ilimitada de glucosa, factores de crecimiento (aminoácidos,
vitaminas y precursores de ácidos nucleicos) y una limitada disponibilidad de oxígeno en el
medio. Bajo estas condiciones, las BAL se pueden dividir en dos grupos: aquellas que
realizan Glicólisis –vía Embden Meyerhof- en la cual se genera como producto final
exclusivamente ácido láctico, metabolismo que se denomina Homofermentativo. Las otras,
llevan a cabo la vía del 6 fosfogluconato/fosfocetolasa, en la cual se genera además de ácido
láctico, una importante cantidad de otros metabolitos como etanol, acetato y dióxido de
carbono. Este metabolismo se denomina Heterofermentativo. Si bien se establece esta
clasificación es posible una cierta versatilidad, en cuanto al metabolismo que una bacteria
ácidoláctica lleve a cabo, ya que las condiciones del medio tienen mucha influencia en la
formación de productos finales de fermentación, pudiendo ser atribuidos tales cambios a
alteraciones sobre el piruvato y/o el uso de distintos aceptores de electrones para la
generación de energía, desde el oxígeno hasta compuestos orgánicos. A nivel enzimático,
existen lactobacilos heterofermentadores que poseen la fosfocetolasa pero no aldolasa y los
homofermentadores obligados tienen FDP aldolasa y no fosfocetolasa. Se incluyen como
bacterias ácido lácticas a los siguientes géneros: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium,
Dolosigranulum, Enterococcus, Glovicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y
Weisella. El género Bifidobacterium no está relacionado filogenéticamente y lleva a cabo de
un modo exclusivo la fermentación de azúcares, razones por las cuales no está mencionado
entre los anteriores (6,8,9).
Las BAL habitan en dos nichos ecológicos principales, ambos ricos en su contenido de
8
Introducción
nutrientes: las mucosas del hombre y animales de sangre caliente, y el ambiente lácteo. Se
sostiene que para que las BAL sean utilizadas como bacterias intestinales probióticas y por
tanto ejerzan un rol benéfico en el ecosistema del tracto gastrointestinal humano, deben
formar parte de la microflora del mismo (8).
La inmensa reserva de bacteria lácticas y de otros géneros relacionados
(Bifidobacterium) del tracto intestinal no puede sino ejercer un efecto notable sobre la salud
del individuo huésped, conocido como rol probiótico. Si bien el hombre convive desde
siempre con estos microorganismos, sólo recientemente se han obtenido evidencias científicas
demostradas (y otras en curso de demostrarse) sobre el mecanismo de sus acciones
probióticas.
Son numerosos los estudios realizados para confirmar y ampliar aún más los
conocimientos que se disponen acerca de las propiedades “saludables” que poseen estas
bacterias en su aplicación, para compensar la sintomatología producida por diversas
enfermedades como infecciones entéricas de distintas etiologías, la intolerancia a la lactosa
(primaria de base genética o secundaria a otra patología), cuadros de inmunosupresión
(pacientes tratados con citostáticos, antivirales, radioterápicos etc.) etc.
De sus investigaciones sobre microorganismos intestinales, Elías Metchnikoff (1845-
1916) sacó a la luz la hipótesis de que la microflora intestinal produce toxinas que resultan en
una toxemia crónica hacia el huésped, ocasionando ataques macrofágicos (autoinmunidad
celular) hacia el tejido dañado acelerando de este modo el envejecimiento de los órganos. Fue
el primero en sugerir que la implantación de bacterias acidolácticas (como lactobacilos
provenientes de cultivos de yogur) puede reducir estas respuestas agresivas, prolongando la
9
Introducción
expectativa de vida (6).
Actualmente, existe una categorización particular de los alimentos. Algunos de ellos
se denominan alimentos funcionales, los cuales poseen efectos fisiológicos o psicológicos
más allá de los conocidos efectos nutricionales. En Japón, un número cada vez mayor de
productos lácteos fermentados son reconocidos como alimentos funcionales. El área más
desarrollada, con respecto a estos alimentos, en la industria láctea es aquella relacionada con
las funciones gastrointestinales, donde ha sido demostrado que varios de estos productos
poseen las propiedades antes mencionadas (10).
Fuller define Probiótico, a un “monocultivo o cultivo mixto de microorganismos
vivos, los cuales administrados al hombre o animal como suplemento alimentario, ejercen un
efecto beneficioso en el huésped, a través de un mejoramiento de las propiedades de la
microflora indígena” (6).
Sin embargo, ha surgido recientemente una nueva definición la cual tiene en cuenta no
sólo la presencia de microorganismos vivos, estableciendo que Probióticos son preparaciones
celulares bacterianas viables o alimentos que contienen cultivos bacterianos viables o
componentes de células bacterianas, que ejercen efectos benéficos sobre la salud del huésped
(11).
Queda claro entonces, que el propósito específico que se busca al utilizar un probiótico
dependerá de las propiedades específicas que éste ofrece. Los microorganismos probióticos,
deben satisfacer requerimientos tales como (6):
10
Introducción
 Sobrevivir a las condiciones ambientales, proliferar y colonizar el lugar donde
deberá ser activo. En este aspecto, las especies microbianas específicas del huésped
probablemente sean las únicas capaces de establecerse en esos nichos.
 No debe existir reacción inmunológica del hospedador frente a estas bacterias
(inmunotolerancia).
 No deben causar reacciones patogénicas, tóxicas, alérgicas, mutagénicas o
carcinogénicas por sí mismas, a través de sus metabolitos o de componentes celulares
luego de su muerte y degradación.
 Ser genéticamente estables, no permitiendo transferencia de plásmidos.
 Permitir su cultivo en gran escala por métodos simples y reproducibles.
 Mantenerse viables durante el procesamiento y almacenamiento de los
alimentos.
Actualmente se reconoce el uso comercial (a nivel mundial) de las siguientes cepas
como probióticas (11):
Bifidobacterium breve: cepa Yakult (Yakult, Japón).
Bifidobacterium bifidum: cepa YIT 4002 (Yakult, Japón), cepa A234-4 (Japan Bifidus
Foundation).
Bifidobacterium infantis: cepa ATCC15697 (ATCC, Rockville, USA).
Bifidobacterium lactis: Chr. Hansen Ltd (Dinamarca).
Bifidobacterium longum: cepa F6-1-ES, cepa 69-2bs (Nikken Chemicals, Japón).
Bifidobacterium thermophilum: cepa P2-91.
11
Introducción
Lactobacillus acidophilus: cepa NCDO1748 (National Collection of Dairy Organisms,
UK), cepa SBT2062 (Snow Brand Milk Products, Japón), cepa NCFM (GPGurlock, USA).
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: cepa FW148 (Unilever Research
Laboratory, UK), cultivos starters comerciales de yogur (Chr. Hansen Ltd., USA), (Marshall
Products, USA).
Lactobacillus casei: cepa Shirota (Yakult, Japón).
Lactobacillus jhonsonii: cepa LC1 (Nestlé Ltd., Suiza).
Lactobacillus plantarum: cepa ATCC14917 (ATCC, Rockville, USA).
Lactobacillus rhamnosus: cepa GG (Valio, Finlandia), cepa ATCC53103 (ATCC,
Rockville, USA).
Lactobacillus salivarius: cepa WB1004 (Wakamoto Pharmaceutical, Japón).
Enterococcus faecium: cepa SF68:AB (Cernel, Engelholm, Suecia y Guiliani, Lugano,
Suiza).
Streptococcus thermophilus: cepa ATCC19258 (ATCC, Rockville, USA), cultivos
starters comerciales de yogur (Chr. Hansen Ltd., USA), (Marshall Products, USA).
1.3.1 Taxonomía y características generales de las principales bacterias
probióticas.
La caracterización microbiana sobre la base fenotípica aún trae inconvenientes, ya que
pueden no estar compartidas por la misma unidad taxonómica, debido a mutaciones o bien
debido a adaptaciones genéticas a distintas condiciones de desarrollo, conduciendo todo esto
12
Introducción
a resultados conflictivos y posiciones taxonómicas no estables.
Actualmente se dispone de numerosos métodos de investigación molecular basados en
estudios fenotípicos y genotípicos con distintos niveles resolutivos, reproducibilidad y
facilidad para realizar la metodología en cuestión. La Tabla 1 muestra los principales métodos
taxonómicos que emplean técnicas de biología molecular (11).
Vale recordar que para obtener resultados reproducibles se requiere de la
standarización de la técnica empleada, como por ejemplo el uso de DNA correctamente
purificado y no contaminado con DNA foráneo, enzimas y reactivos químicos de buena
calidad y una idoneidad suficiente de quien lleva a cabo la metodología.
Una información de gran ayuda es la relación entre el grado de similitud y la relación
evolutiva de varios grupos microbianos y aquella relación filogenética.
La técnica ampliamente utilizada para determinar dicha relación filogenética se basa
en confrontar los RNA ribosomales y los genes por ellos codificados. El secuenciamiento del
rRNA 16S resulta de particular importancia para la clasificación de las bacterias lácticas.
La taxonomía no es una ciencia estática, sino que está en contínua evolución y es
probable que en el futuro sufra numerosas modificaciones como consecuencia del
advenimiento de modernas metodologías que ofrezcan datos más certeros y confiables.
En los últimos años han aparecido modificaciones taxonómicas en las bacterias
lácticas. Por ejemplo, el género Lactobacillus está constituído por aproximadamente 70
especies; sin embargo, con la información que hoy se dispone podrían llegar a subdividirse en
diversos géneros genéticamente más homogéneos.
Se considera que en la actualidad se está transitando un período de transición entre las
metodologías tradicionales y la llegada de los nuevos métodos moleculares; sin embargo, aún
13
Introducción
Tabla 1- Detección de bacterias acidolácticas y bifidobacterias utilizando técnicas de biología

molecular.
Métodos Gen blanco Especies Especificidad
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Primers específicos de especie sobre 16S rRNA Lact. casei, Lact. delbrueckii, de especie
los respectivos rRNA de cada especie Lact. helveticus, Lact. acidophilus
Primers específicos de especie desig- 16S rRNA B. adolescentis, B. longum, de especie

nados a partir de 16S rRNA Lact. acidophilus
RAPD (Randomly Amplified Polymorphic 16S rRNA Lact. acidophilus, Lact. de cepa
Deoxyribonucleic acid) helveticus, Lact. casei, Lact. reuteri
RAPD con primer 10-mer Lact. plantarum, Ent. faecium,

Strep. thermophilus
RAPD con primer 9-mer Lact. plantarum, Lact. pentosus 50% esp. cepa
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Electroforesis en gel, de Hin dIII. 16S rRNA Lact. plantarum de especie.

Como sonda usa un fragmento de 420 bp Reconoce 8
o el gen DSM20016 de rRNA de Lact. reuteri cepas
PFGE (Pulsed - Field Gel Electrophoresis) genoma Lact. acidophilus de cepa

de Sma I, codificador Apa I completo
Electroforesis en gel agarosa, de Eco RV, genoma Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus de especie,
Hin dIII, Bgl II, Eco RV, completo Lact. delbrueckii subsp. lactis, subespecie y
codificador Bam HI. Lact. delbrueckii subsp. cepa.
delbrueckii
Electroforesis en gel agarosa, de Asp718 genoma Lact. reuteri, Lact. plantarum variada
Cla I, codificador Eco RI completo
Hibridación (Southern Hybridization)
Regiones variables 23S rRNA de gen de 23S rRNA Lact. gasseri, Lact. jhonsonii, de cepa
E. coli amplificadas por PCR con primers Lact. acidophilus
gen-específicos, utilizadas como sonda
Plásmido pNST43 DNA aislado de E. coli rRNA Lact. acidophilus de cepa

JM109, usado como sonda
14
Introducción
Tabla 1- Detección de bacterias acidolácticas y bifidobacterias utilizando técnicas de biología

molecular (continuación).
Métodos Gen blanco Especies Especificidad
16S+23S cDNA de E. coli MRE600. 16S rRNA Lact. acidophilus, Lact. casei, de cepa
16S rDNA de E. coli Hb101. Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus,
16S rDNA de Lact. acidophilus Lact. fermentum, Lact. gasseri,
ATCC4356. Los tres, como sondas. Lact. helveticus, Lact. murinus,
Lact. plantarum, Lact. salivarius,
Lact. reuteri, Lact. delbrueckii
Fragmento 2kb Eco RI DNA Codificador Lact. helveticus de especie

de plásmido de Lact. helveticus Eco RI de DNA
clonado en E. coli., como sonda total (RFLP)
Fragmento de 50 kb de plásmido plásmido Lact. fermentun de cepa

de lactobacilos, de perfil tipo B, usado DNA cepa tipo B
como sonda en hibridización.
Sondas derivadas de clonaciones DNA Lact. acidophilus O de cepa

al azar de fragmentos de DNA en cromosomal
plásmido vector pBR322 usado en o plásmido
hibridación.
Hibridación (Dot Blot Hybridization)
Banda clonada de fragmentos Eco RI punto de lesión Lact. delbrueckii subsp. de especie
de DNA cromosomal, de cepa tipo en gen Leu-921 bulgaricus,Lact. delbrueckii subsp.
de Lact.delbrueckii subsp. bulgaricus delbrueckii, Lact. delbrueckii subsp.
en el vector YRP17, usada como sonda lactis
Hibridación Dot Blot Reversa 16S, 23S rRNA Específica para BAL Ident. directa
con sondas de captura simultánea
especie
específica de
poblaciones
mixtas
Amplificaciones de los genes genes hdc A BAL decarboxilantes para gen LdcA
hdc A de Lact. buchneri y Leuc. oenos de histidina: Lact. buchneri
usados como sonda.
Comparación de las secuencias de DNA
Diagnóstico de regiones reveladas en 16S rRNA Lact. brevis, Lact. sanfrancisco, de especie
análisis comparativos de secuencias lineales Lact. reuteri, Lact. farciminis,
de rRNA, usadas como sitios target. Lact. pontis
15
Introducción
se requiere de un consenso unánime por parte de los taxonomistas en el establecimiento de los
requisitos mínimos necesarios para la proposición y descripción de una nueva especie
bacteriana (12).
A continuación se citan las características más importantes de los géneros de interés.
Bifidobacterium.
Las bifidobacterias fueron aisladas inicialmente en 1899 por Frenchman Tissier, a
partir de heces de niños sanos alimentados con leche materna. Fueron denominados
originalmente Bacillus bifidum, y posteriormente, a partir de la 8ª edición del Manual de
Bergey, se establece el género Bifidobacterium, dentro del cual se reconocen las siguientes
especies: B. bifidum, B. infantis, B. breve, B. thermophilum, B. adolescentis, B. longum, B.
pseudolongum, B. suis, B. coryneforme, B. asteroides y B. indicum. De éstos, B. bifidum, B.
longum, B. infantis y B. breve son bacterias residentes en infantes, mientras que B. bifidum, B.
longum y B. adolescentis son bacterias residentes en adultos.
Las bifidobacterias han sido aisladas del tracto intestinal y heces de animales, como
también del tracto gastrointestinal, heces, vagina y cavidad oral del hombre (5).
Sus principales características son las siguientes: bacilos gram(+), no esporulados,
anaerobios estrictos, aunque en algunos casos, luego del aislamiento inicial puede observarse
un crecimiento lento en presencia de oxígeno y dióxido de carbono. Dependiendo de las
condiciones de cultivo, muestran agrupación y morfología celular diversa: en Y, V, bacilos
curvos, con forma de clava, bacilos sueltos o en empalizada. Se tiñen irregularmente con azul
16
Introducción
de metileno. En medios de cultivo sólidos (como agar MRS o agar MRS-litio propionato),
forman colonias pequeñas, blanquecinas, de aspecto cremoso.
La mayoría no posee catalasa. Utilizan el amonio como fuente de nitrógeno. No
producen indol ni reducen nitratos. Su temperatura óptima de crecimiento es de 36ºC-38ºC.
Son sacarolíticas, fermentan la glucosa característicamente por el ciclo de la fructosa 6
fosfato, por el cual a partir de 1 mol de glucosa producen 1.5 moles de ácido acético y 1 mol
de ácido láctico, por lo que se consideran bacilos heterofermentadores. En cambio, no
producen dióxido de carbono (excepto cuando fermentan gluconato), ácido butírico ni ácido
propiónico. Generan pequeñas cantidades de etanol, ácido fórmico y ácido succínico (5,9).
Lactobacillus.
Dentro de las BAL, el género Lactobacillus es uno de los más heterogéneos en cuanto
a sus características fenotípicas, bioquímicas y fisiológicas. Esta heterogeneidad se ve
reflejada en el rango del porcentaje de guanina y citosina del DNA de las especies incluídas,
que va de 32 a 53%. El género fué dividido en tres grupos: grupo I-Homofermentantes
obligados, grupo II-Heterofermentantes facultativos y grupo III-Heterofermentantes
obligados. Esta división se fundamenta en parámetros fisiológicos tales como la presencia o
no de enzimas claves para el metabolismo hidrocarbonado (homo y heterofermentante) por
ejemplo la F1 6 di P aldolasa y F cetolasa. Las metodologías más clásicas para identificar
especies de lactobacilos ha sido el patrón de fermentación de carbohidratos, la configuración
de ácido láctico producido, la hidrólisis de arginina y requerimientos de desarrollo a
determinadas temperaturas. Si bien estas metodologías siguen utilizándose, actualmente se
17
Introducción
requieren para una clasificación más estricta, otros estudios como el análisis del
peptidoglicano, movilidad electroforética de la enzima Ldh, el porcentaje molar de guanina y
citocina del DNA etc.
Los lactobacilos están ampliamente distribuídos en la naturaleza y se ha encontrado,
para algunas especies, importantes aplicaciones en la industria alimentaria. Éstos pertenecen
al grupo más ácidotolerantes dentro de las BAL y por consiguiente, finalizan ciertas
fermentaciones lácticas espontáneas tales como las que se observan en vegetales y ensilajes
(8).
En la actualidad, Lact. acidophilus, Lact. salivarius, Lact. leichmanii y Lact.
fermentum son reconocidos como posibles especies propias del tracto gastrointestinal humano
y fueron denominadas “especies residentes” para distinguirlos de aquellas “especies
transitorias”. Estas últimas incluyen Lact. brevis, Lact. plantarum y Lact. casei (5). Otros
están más especializados y se encuentran sólo en ciertos nichos como Lactobacillus
sanfrancisco y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, éste último asociado al yogur (8).
Son bacilos gram (+), no esporulados, no móviles. En medios de cultivos sólidos (agar
MRS, agar MRS bilis) forman colonias pequeñas blancas pero más translúcidas que las
bifidobacterias. Realizan un metabolismo fermentativo, obligadamente sacarolítico. No
producen ácidos volátiles con más de dos átomos de carbono. Son microaerofílicos, en medio
agarizado crecen mejor cuando la tensión de oxígeno está reducida por un 5%-10% de
dióxido de carbono. Inusulamente reducen nitratos, no poseen catalasa ni citocromos. La
patogenicidad es poco frecuente (9).
18
Introducción
a) Lactobacillus acidophilus.
Reside en la porción inferior del intestino delgado y a lo largo del intestino grueso
humano, mucosas de vagina y cavidad oral, encontrándose también en animales. Presenta las
siguientes características: son bastones de longitud variables, rectos, se agrupan de a pares o
en cadenas cortas. No crece a 15ºC y excepcionalmente crece bien a 45ºC. La mayoría de las
cepas fermenta el almidón pero no la ribosa. Tienen requerimientos nutricionales complejos,
característica ésta que permite diferenciarlo de otro lactobacilo del tracto gastrointestinal,
Lact. salivarius. Su temperatura y pH óptimos de crecimiento son 35ºC-38ºC y 5.5-6.0,
respectivamente. En leche vacuna produce entre 0.3% y 1.9% de DL ácido láctico, variando la
capacidad acidificante entre las cepas. Es resistente a la acción de los ácidos biliares del
organismo. Produce las enzimas treonina aldolasa y alcohol dehidrogenasa, ambas
participantes en la generación de compuestos de aroma. No puede diferenciarse de manera
confiable, fenotípicamente, de Lact. gasseri, Lact. crispatus y Lact. amylovorus, requiriendo
análisis más complejos de su estructura molecular para tal fin (5,9).
b) Lactobacillus casei.
Este lactobacilo mesófilo heterofermentativo facultativo está ampliamente difundido
en la naturaleza. Se encuentra dentro del grupo filogenético Lact. casei-Pediococcus. En el
Manual de Bergey (9), la especie Lact. casei era subdividida, sobre la base fenotípica y de
algunos resultados de homología de DNA, en 4 subespecies: Lact. casei subsp. tolerans, Lact.
casei subsp. rhamnosus, Lact. casei subsp. casei y Lact. casei subsp. pseudoplantarum. Pero
en 1989 estas cuatro subespecies fueron reclasificadas por Collins y col. (12) en tres especies:
Lact. casei, Lact. paracasei y Lact. rhamnosus.
19
Introducción
Dellaglio y col. (12) han informado que otros autores, comparando la secuencia de
genes que codifican para el rRNA16S (rDNA 16S) de las especies del grupo Lact. casei,
obtuvieron conclusiones a favor de la propuesta de eliminar la especie Lact. paracasei. No
obstante, el grupo Lact. casei reúne cepas de gran interés ya sea para la preparación de
derivados lácteos o como probiótico y es de suma importancia la correcta diferenciación de
sus especies como puede obtenerse con reacciones de amplificación como es la RAPD-PCR,
la cual permite discriminar Lact. casei de Lact. zeae y del grupo de Lact. plantarum. También
se han obtenido resultados (con distintos primers) reproducibles para la diferenciación de
Lact. paracasei de Lact. casei, Lact. plantarum y Lact. pentosus.
En cuanto a sus características fenotípicas, son bacilos de gran variabilidad en forma,
tamaño y agrupación. Se observa una gran tendencia a formar cadenas. No crecen a 45ºC y
tienen requerimientos nutricionales complejos. Se aislan de mucosas intestinales, de vagina,
cavidad oral humana, como así también de productos lácteos (9).
1.4 Estimulación de los organismos probióticos: Prebióticos
Gibson y Roberfroid (8) introducen el término prebiótico, y posteriormente simbiosis,
siendo esta última definida como la combinación en el mismo producto alimenticio de pro y
prebióticos. Un prebiótico es definido como un ingrediente de la dieta, no digerible, que
afecta beneficiosamente al huésped a través de una estimulación selectiva del crecimiento y
metabolismo de un limitado número de especies bacterianas ya establecidas en el colon,
mejorando así la salud del mismo.
20
Introducción
La simbiosis se pone de manifiesto cuando estas sustancias llegan a la mucosa del
colon y sirven de sustrato para las bacterias indígenas del lugar (principalmente
bifidobacterias y lactobacilos) abasteciendo al huésped de energía, sustratos metabólicos y
micronutrientes esenciales.
Un ingrediente alimentario, para ser considerado como prebiótico, debe:
1. No ser hidrolizado ni absorbido en el tracto gastrointestinal.
2. Estimular selectivamente el crecimiento de bacterias colónicas potencialmente
beneficiosas.
3. Reprimir el crecimiento de microorganismos patógenos y su virulencia.
La producción de ácido láctico y otros ácidos orgánicos por los microorganismos
probióticos (Lactobacillus y Bifidobacterium) depende del metabolismo de los sustratos
hidrocarbonados que no han sido absorbidos o metabolizados en la porción superior del tubo
digestivo. Algunos prebióticos son aislados de fuentes naturales mientras que otros son
producidos industrialmente (Tabla 2).
Dentro de los prebióticos se encuentran algunos conocidos como “factores bifidus”,
que actúan específicamente sobre las bifidobacterias. Ellos son: Factor bifidus I
(oligosacáridos de la leche humana conteniendo N-acetilglucosamina), Factor bifidus II
(producto de la digestión enzimática de la caseína), extracto ginseng, Lactulosa,
Fructooligosacáridos (FOS) y Oligosacáridos transgalactosilados (TOS) (producidos durante
la fermentación del yogur) (8,11).
21
Introducción
Tabla 2- Sustratos de baja absorción (prebióticos) y sus efectos sobre la microflora intestinal.
Acción Dosis diaria Nivel de

Prebiótico Sobre Origen (g/kg peso corp.) Seguridad
Fructooligosacáridos Bifidobacterias y Alcauciles 0.3 FOSHU

Bacteroides (síntesis química de (1991)
sucrosa / inulina)
4’Galacto-oligosacáridos Bifidobacterias y Leche humana/vacuna 0.128 FOSHU
lactobacilos (a partir de lactosa) (1991)
4’Galactosil-lactosa Bifidobacterias Leche humana 0.3
Galactosil-oligosacáridos Bifidobacterias 0.3
Palatinosa Bifidobacterias Síntesis química FOSHU
de sucrosa. Condensación (1991)
intermolecular de glucosa
Rafinosa Bifidobacterias Remolacha blanca 0.45 FOSHU
Oligosacáridos de Bifidobacterias y grano de soja, suero (1991)
Transgalactosil- lactobacilos
oligosacáridos (TOS)
Xilo-oligosacáridos Bifidobacterias Hidrólisis enzimática 0.12 FOSHU
controlada por endo-1,4--xilanasa (1996)
Lactulosa Bifidobacterias Hidrogenación catalítica 0.15 FOSHU
BAL de lactosa a altas temperaturas (1996)
Lactitol Hidrogenación catalítica IDA no
de lactosa/lactulosa a altas especificada
temperaturas. (OMS 1982)
Lactosucrosa Bifidobacterias Transfructosilaciónde lactosa y FOSHU
sucrosa por fructofuranosidasa (1996)
Manitol Flora gram (-) Algas, olivos, higos. 0.17 IDA no
Hidrogenación catalítica de especificada
manosa/fructosa (OMS1982)
GRAS (1973)
Sorbitol Flora gram (-) Cereza, sidra y pera 0.17 IDA no
Hidrogenación catalítica especificada
de glucosa de azúcar invertido (OMS 1982)
GRAS (1973)
IDA: Ingesta Diaria Admitida, FOSHU: Food for Specified Health Use legislated inJapan.
22
Introducción
Tabla 2- Sustratos de baja absorción (prebióticos) y sus efectos sobre la microflora intestinal
(continuación).
Acción Dosis diaria Nivel de

Prebiótico Sobre Origen (g/kg peso corp.) Seguridad
Xilitol Flora gram (+) Frambuesa, hongos, algas 4.5 IDA no

y acidificante Hidrogenación catalítica especificada
de xilasa (OMS 1982)
IDA: Ingesta Diaria Admitida, FOSHU: Food for Specified Health Use legislated inJapan.
23
Introducción
1.5 Características probióticas de bacterias intestinales.
Las bifidobacterias y lactobacilos, para ser utilizados satisfactoriamente como aditivos
alimentarios y ejercer un rol probiótico deben principalmente sobrevivir en gran número en el
alimento al cual fueron adicionadas, tolerar los pH extremos de la secreción gástrica y las
concentraciones de bilis liberadas en duodeno, adquirir residencia y proliferar en la mucosa
intestinal.
1.5.1 Resistencia bacteriana a la secreción gástrica y biliar.
La acidez de la secreción gástrica producida en el estómago es la primera barrera de
defensa y uno de los tantos factores de stress, junto a la bilis y la peristalsis intestinal, que el
organismo posee frente al ingreso de gérmenes durante la ingesta de alimentos. De esta
manera, se mantiene una población bacteriana reducida en el estómago y la porción inicial
del duodeno y se la considera como “zona de transición” entre una escasa microflora hasta la
abundante y compleja mezcla de especies bacterianas en la porción final del tubo digestivo.
La capacidad de sobrevivir al proceso enzimático de la digestión y la acidez del
estómago y a las secreciones biliares intestinales, para poder llegar viables a la mucosa
intestinal y residir en ella es una de las características de especial importancia de un
microorganismo para ser utilizado como probiótico (2,7). En este aspecto, los trabajos
experimentales no han demostado aún resultados lo suficientemente claros, lo cual hace
necesario continuar con futuras investigaciones (13).
24
Introducción
1.5.2 Deconjugación de ácidos biliares y efecto hipocolesterolémico.
La secreción biliar hepática aporta ácidos biliares e inmunoglobulinas, entre otros
componentes, al intestino delgado. Los ácidos biliares participan en la nutrición, solubilizando
los lípidos dietarios como el colesterol, grasas saturadas y vitaminas hidrofóbicas,
promoviendo su absorción.
El colesterol de la dieta, una vez que llega al intestino delgado, es solubilizado
formando parte de micelas mixtas estabilizadas por los ácidos biliares conjugados antes de
ser absorbido por los enterocitos. Posteriormente, es llevado al hígado por el “sistema porta”
para contribuir al pool de colesterol plasmático. Además de esta ruta metabólica, existe una
secreción de colesterol por la pared intestinal, siendo ésta una de las más importantes formas
de eliminación del colesterol endógeno. El colesterol contenido en los alimentos ingeridos
generalmente es menor que el endógeno secretado por intestino. En el ser humano sano, de
500 a 2000 mg de colesterol endógeno y dietario no absorbido, y aproximadamente de 100 a
500 mg de ácidos biliares pasan a través del colon diariamente. Estos últimos son
metabolizados por las bacterias colónicas y excretados como esteroles neutros y sus
derivados.
Los ácidos biliares son un grupo de esteroides ácidos hidrosolubles con propiedades
detergentes, que se sintetizan en el hígado a partir del colesterol endógeno. Dicha biosíntesis
está bajo control por retroalimentación negativa, de manera que cuando la concentración de
los ácidos biliares disminuye, como sucede en una malabsorción o en una marcada excreción
intestinal de los mismos, aumenta hasta veinte veces su síntesis consumiendo mayor cantidad
de colesterol hepático. Cuando se secretan los ácidos biliares se encuentran conjugados con
25
Introducción
glicina o taurina. Los ácidos cólico y quenodeoxicólico son los denominados ácidos biliares
primarios y participan de la circulación enterohepática, siendo de esta manera absorbidos en
el intestino y secretados nuevamente en la bilis luego de cada ingesta. En el individuo sano,
8 nmol de ácidos biliares transitan continuamente por la circulación enterohepática, la cual se
hace más lenta en el ayuno y se acelera durante y después de la comidas. Aquellos ácidos
biliares primarios que escapan a la absorción ileal y por consiguiente pasan al colon, son
modificados por las enzimas bacterianas 7 -dehidroxilasas y convertidos en ácidos biliares
secundarios: deoxicólico y litocólico (7).
La importancia de la capacidad de deconjugación de ácidos biliares conjugados por
parte de ciertos microorganismos, entre ellos las BAL, reside en el potencial efecto reductor
del colesterol plasmático ya que los ácidos biliares al ser deconjugados, no cumplen su
función solubilizadora de lípidos y al cambiar su pKa no son absorbidos, precipitan y se
eliminan junto con las heces. Esto podría conducir a un mayor consumo de colesterol
endógeno para nueva síntesis de los ácidos; y/o a la menor absorción del colesterol dietario a
nivel intestinal, lo que explica en parte el efecto hipocolesterolémico que se les adjudica a las
bacterias acidolácticas probióticas.
Por otro lado, se han publicado datos de diversos trabajos experimentales que
sugieren que las bacterias probióticas utilizarían una vía alternativa para contribuir al
descenso del colesterol plasmático (diferente a las antes mencionadas), que sería la
incorporación del mismo a la membrana celular o citoplasma para su posterior catabolismo,
observándose “in vitro” la desaparición del colesterol del medio. A pesar de los diversos
mecanismos propuestos para tratar de explicar el efecto hipocolesterolémico atribuído a las
BAL utilizadas como probióticos humanos, son necesarios más estudios para llegar a
26
Introducción
conclusiones claras sobre las BAL y su efecto sobre el colesterol (14).
La hidrolasa de sales biliares (BSH: Bile Salt Hidrolase), que como consecuencia de
esta acción libera ácidos biliares y aminoácidos (taurina o glicina), se encuentra presente en
varias especies bacterianas de origen intestinal como Lactobacillus sp, Bifidobacterium
longum, Bifidobacterium bifidum, Enterococcus sp, Bacteroides, Clostridium, etc. (15,16).
Estudios epidemiológicos sugieren que la incorporación de una elevada cantidad de
colesterol y grasas saturadas en la dieta junto a una escasa cantidad de fibra, es un factor de
riesgo para la generación de cáncer de colon en el ser humano, donde los derivados del
colesterol (producto de su metabolismo en el intestino) están mucho más relacionados como
agentes etiológicos de la misma que el colesterol por sí mismo (7).
1.5.3 Estimulación de las respuestas inmunológicas y efecto
antitumoral.
Las propiedades antitumorales atribuídas a estas bacterias se basan en:
1. Inactivación o inhibición de componentes carcinógenos en el tracto
gastrointestinal.
2. Estimulación o mejoramiento de las respuestas inmunológicas.
3. Reducción de actividades enzimáticas de bacterias intestinales como la
27
Introducción
-glucuronidasa, azoreductasa y nitroreductasa, que convierten procarcinógenos en
carcinógenos activos.
Estudios experimentales han demostrado que la ingestión de Lactobacillus en
productos lácteos fermentados o no, inhiben líneas tumorales trasplantables en animales.
Se observó que, alimentando ratas con cepas de Lactobacillus, se podía disminuir la
formación de tumores de colon o bien prolongar su período de latencia, probablemente por
supresión de la actividad metabólica de la microflora colónica.
Además de las bifidobacterias, las principales bacterias ácidolácticas que han sido
estudiadas para evaluar su capacidad antitumoral fueron Lactobacillus acidophilus y casei,
Lactococcus lactis, Streptococcus salivarius y Leuconostoc.
Estudios epidemiológicos sobre el cáncer de colon en humanos han demostrado una
baja incidencia de éste en áreas poblacionales donde se incorpora en la dieta diaria una
elevada cantidad de productos lácteos fermentados con estas bacterias ácidolácticas.
Enzimas producidas por bacterias que residen fundamentalmente en el colon, tales
como -glucosidasa, -glucuronidasa, nitroreductasa, azoreductasa y 7 -dehidroxilasa están
implicadas en la carcinogénesis generando mutágenos carcinógenos y factores promotores
tumorales. La -glucosidasa hidroliza glucósidos a agliconas mutagénicas, la -glucuronidasa
las genera en el colon a partir de hidroxiderivados del glucurónido, la nitroreductasa y
azoreductasa están relacionadas con la formación de aminas aromáticas que pueden
convertirse en nitroso y N-hidroxicompuestos en diversos tejidos.
Se ha observado que, proveyendo a ratas o humanos voluntarios dietas ricas en carnes
y grasas saturadas, se logra un significativo incremento en la actividad de estas enzimas.
28
Introducción
Wood y col. (4) han informado que otros autores demostraron que la suplementación con
Lactobacillus acidophilus en elevada cantidad ( 1010 bacterias viables/día) de una dieta
carnívora para una determinada población en estudio, redujo significativamente las
actividades de -glucuronidasa, nitroreductasa y la 7 -hidroxilasa.
La -glucuronidasa ha sido relacionada frecuentemente con Peptostreptococcus,
Clostridium y Bacteroides. Wood y col (4) tambien informaron que un segundo grupo de
investigadores han descripto como se promueve marcadamente la carcinogénesis ingiriendo
Escherichia coli, Enterococcus faecalis y Clostridium paraputrificum, pero que puede
suprimirse este efecto por la incorporación dietaria de Bifidobacterium longum, Lactobacillus
acidophilus y Eubacterium rectale. Además estudiaron la incidencia de cáncer hepático
cuando se modifica la composición de la microflora intestinal, observando que Lact.
acidophilus o Bifidobacterium longum poseen un gran efecto anticancerígeno: en animales
donde se incorporó Lact. acidophilus en la alimentación, adquiriendo residencia en el
intestino, la incidencia de este tipo de neoplasia fue de un 65%, mientras que cuando se
incorporó Bifidobacterium longum fue de un 46% comparándolos con el grupo de animales
control para el cual la incidencia fue del 100%.
La estimulación antigénica que desencadenan los polisacáridos asociados a la pared
celular y los excretados por las BAL, cuando éstas son incorporadas oral o
intraperitonealmente, se cree que es importante en la inducción de inmunidad hacia tumores
malignos en el huésped (4).
Son conocidos los efectos producidos por Lact. casei Shirota sobre el crecimiento de
tumores de colon y el mejoramiento de la respuesta inmunológica “in vivo”. Está demostrado
que su ingesta prolongada detiene el crecimiento de la masa tumoral, potencia al sistema
29
Introducción
inmunológico por modificación de las funciones de los linfocitos T e incrementa la actividad
de las células NK (Natural Killer) (8).
1.5.3.1 Utilización de Bacterias Probióticas como inmunomoduladores.
Las bacterias probióticas ofrecen una nueva alternativa alimentaria para contrarrestar
las disfunciones inmunológicas locales y estabilizar los mecanismos de defensa de la mucosa
intestinal.
El Tejido Linfoideo Asociado a Mucosas (TLAM) se encuentra ampliamente
distribuido en todo el cuerpo y está verdaderamente “conectado” con las distintas células
inmunológicas de las mucosas como así también con las de orígen sistémico. Aquellas que se
encuentran en la mucosa intestinal, representan el primer punto de contacto con los
constituyentes dietarios como antígenos, alergenos y bacterias de diverso tipo. Se sabe que la
presencia de antígenos en el intestino está asociada a una adquisición de tolerancia oral a los
mismos.
Una de las actividades principales del sistema inmunológico en el intestino es asegurar
y mantener una baja sensibilidad hacia el gran número y variabilidad de antígenos y bacterias
que potencialmente pueden llegar junto con los alimentos lográndose adquirir de esta manera
la tolerancia antes mencionada. Esta inmunomodulación también es provocada
particularmente por las BAL en el ser humano y en los animales, lo cual llevó a utilizar estos
microorganismos como vacunas, adjuvantes, agentes supresores de tumores y
antinflamatorios. Dichos efectos fueron observados únicamente con la incorporación en la
ingesta de bacterias viables y no cuando se utilizan bacterias inactivadas por tratamiento
30
Introducción
térmico.
En diversos desordenes intestinales, se produce la alteración del balance microbiano y
se incrementa marcadamente la permeabilidad a nivel de mucosas, lo cual aparece
acompañado de un proceso inflamatorio que determina el cuadro clínico en el individuo.
Todos estos cambios, en condiciones normales, son impedidos por el correcto funcionamiento
de las barreras de defensa de la mucosa intestinal histológicamente intacta como así también
por el rol que cumple el TLAM. Sin embargo, cuando agentes como virus, bacterias
patógenas, químicos tóxicos o radiaciones alteran la integridad del epitelio y sus funciones,
los defectos en los mecanismos de defensa se vuelven evidentes con lo cual aparece la
sintomatología característica de este tipo de desordenes (8).
Los mecanismos a través de los cuales las BAL contribuyen a la reparación de las
barreras de defensa son:
 Estabilización de la microflora intestinal normal.
 Adherencia a la mucosa, permanencia y prevención de adherencia y/o
activación de microorganismos patógenos.
 Modificación por parte de la microflora intestinal de las proteínas dietarias.
 Modificación de la actividad enzimática de las bacterias colónicas.
 Modificación y/o control de la absorción de antígenos presentes en el intestino.
Uno de los mecanismos de defensa mencionados es la captación y absorción de
antígenos los cuales alcanzan, por procesos de transporte especializados, a las células de las
Placas de Peyer, lográndose de esta manera disminuir el impacto antigénico en la luz
31
Introducción
intestinal. Esto desencadena una respuesta inmunológica específica hacia el antígeno que
incluye no sólo su exclusión por vía entérica, sino también su metabolización y una
hiposensibilidad hacia la noxa, logrando en conjunto la transformación de los antígenos y
alergenos en sus formas tolerogénicas. En neonatos, especialmente prematuros y aquellos que
han interrumpido tempranamente la lactancia materna, estas funciones normales de la mucosa
intestinal se encuentran alteradas debido al grado de inmadurez de las membranas de las
microvellosidades intestinales y puede llevar a consecuencias severas para su salud. En estas
situaciones, se vuelve relevante el uso de BAL probióticas para mejorar la tolerancia a estas
sustancias nocivas, evitando de esta manera reacciones de hipersensibilidad.
Recientes estudios indicaron que la administración vía oral de determinadas cepas de
BAL como Lact. rhamnosus (ATCC 53103), Lact. plantarum (VTT), Lactococcus lactis
(ARH74) y Bifidobacterium animalis en sus formas viables, indujeron la síntesis del Factor de
Necrosis Tumoral  e Interleuquina 6 en humanos (5,8).
Exitosos resultados se han logrado en la complementación con Lact. rhamnosus GG
de tratamientos de diarreas provocadas por rotavirus en la población infantil afectada. Este
lactobacilo estimula la producción de anticuerpos como la IgA sistémica y asociada a
mucosas (entre otros), la cual podría conferir una importante “memoria inmunológica” que
protege al individuo de futuras reinfecciones. Comparando los efectos producidos cuando se
emplean estos lactobacilos viables e inactivados por tratamientos térmicos, se concluye que la
viabilidad de las células es el factor determinante para inducir la inmunoestimulación. Sin
embargo, el Instituto Central de Investigaciones Microbiológicas de Yakult, en Japón, ha
iniciado estudios sobre los efectos protectores de Lact. casei LC 9018 tratado con calor
(muerte térmica), para la identificación de compuestos denominados “inmunomoduladores
32
Introducción
pro-activos” en los extractos celulares de las BAL. Se han identificado sustancias extraídas de
la pared celular de LC9018 o Lact. fermentum YIT0159, como el ácido teicoico, que mejoran
la actividad macrofágica frente a infecciones por Pseudomona aeruginosa, Mycobacterium
fortuitum, Mycobacterium chelonae, Listeria monocytógenes, etc. Se han realizado trabajos
donde se examinaron fracciones celulares provenientes del citoplasma, pared, polisacáridos y
peptidoglicano no sólo de Lact. casei sino también de Lact. acidophilus y Lact. plantarum en
busca de estas sustancias “pro-activas” antimicrobianas. Estas sustancias administradas
intraperitonealmente, provocan la llegada al lugar de células inflamatorias como los
macrófagos los que, inducidos por las paredes celulares de Lact. casei y Lact. acidophilus
mejoran la producción de radicales oxígeno en respuesta al ácido PMA (phorbol myristate
acid) que ellos mismos producen. Sin embargo, Lact. plantarum no muestra la misma
capacidad. Cuando la administración es intravenosa, Lact. casei demostró ser el de mayor
actividad protectora (en comparación a los demás microorganismos) y esto se asoció a las
características composicionales de su pared celular (capa de peptidoglicano) (5).
Si bien más adelante se hará mención al efecto de las BAL frente a rotavirus, debemos
mencionar que también las células muertas de Lact. casei LC9018 poseen actividad antiviral
como se observa frente a Herpes Simplex tipo I (HSV-1) y Citomegalovirus (MCMV). La
administración de este lactobacilo, en combinación con el antígeno inactivado HSV-1, mejora
marcadamente los mecanismos de defensa frente a la infección en comparación a la
administración única del lactobacilo. En la protección atribuída también a este probiótico
frente al MCMV, se cree que existe un mejoramiento en la actividad de las células Natural
Killer (NK) y que la resistencia frente a la noxa estaría inducida por glicoproteínas de la pared
celular.
33
Introducción
En otros estudios comparativos, donde se administró por un lado Lactobacillus
rhamnosus GG y por otro una mezcla de cultivos de Streptococcus thermophilus y Lact.
delbrueckii subsp. bulgaricus se observó que esta última mezcla de bacterias fue mucho
menos efectiva y no modificó la duración de diarreas por rotavirus (8).
Trabajos similares, pero en este caso para evaluar el efecto producido por la
administración de Lact. acidophilus viables e inactivados térmicamente sobre la prevención
de la enteropatía radioterápica, se han llevado a cabo con resultados satisfactorios (5).
Entre las cepas reportadas como efectivas tanto en la profilaxis como en tratamientos
sintomáticos de diversos desordenes, podemos citar a Lact. acidophilus NCFB1478, Lact.
casei Shirota, Lact. rhamnosus GG y Lact. acidophilus LA1 (8).
1.5.4 Propiedades antimicrobianas.
Las propiedades de estas bacterias de prevenir y mejorar la sintomatología de las
infecciones entéricas, obedecen a su capacidad de suprimir el desarrollo de microorganismos
patógenos probablemente a través de la producción de sustancias antimicrobianas como
ácidos orgánicos, peróxidos y bacteriocinas. Sin embargo, la sola capacidad de producir este
tipo de sustancias no sería suficiente y dicha producción “in situ” en el intestino podría ser
mejorada por la mayor adhesión de la bacteria probiótica a la mucosa intestinal. A
continuación se hace una breve reseña sobre los aspectos más importantes de estas
propiedades.
34
Introducción
La fermentación microbiana reduce la cantidad de carbohidratos disponibles y genera
una serie de pequeñas moléculas con actividad antimicrobiana como son los ácidos
orgánicos. Como consecuencia de la producción de los mismos, de la toxicidad inherente a
éstos y de la acidificación propia de la fermentación, se generan cambios en el medio que
llevan a que ciertos microorganismos ganen ventaja sobre otros volviéndose predominantes
dentro de una misma población microbiana (Amensalismo).
Los ácidos orgánicos resultan ser inhibidores más poderosos a valores de pH bajos
que cercanos a la neutralidad. Además, el ácido acético es mucho más activo que el ácido
láctico frente a los microorganismos. El primero posee un espectro de inhibición mucho más
amplio ya que actúa frente a levaduras, hongos y bacterias. Al parecer, esta diferencia se
debería al elevado valor del pKa de ácido acético en comparación al del ácido láctico (4.75 y
3.08 respectivamente).
La forma no disociada del ácido sería la que determina el efecto inhibitorio, la cual
puede difundir a través de la membrana celular por su carácter hidrofóbico y una vez que
llega al interior celular, se disocia. Esto ocasiona en dicho medio (que en condiciones
normales mantiene un pH constante cercano a la neutralidad) la acumulación del anión y por
consiguiente la alteración de la síntesis de moléculas vitales para el microorganismo, además
de afectar severamente los procesos de transporte a través de las membranas. Una
característica típica de las BAL es su capacidad de contrarrestar este efecto nocivo, por
reducción del pH citosólico adquiriendo, de esta manera, ácidotolerancia. Del mismo modo,
también han adquirido resistencia a la liberación de peróxido de hidrógeno por la célula en
presencia de oxígeno, ya que son capaces de descomponerlo a través de catalasas, peroxidasas
o pseudocatalasas, según el microoganismo en cuestión. El efecto bactericida del peróxido de
35
Introducción
hidrógeno es atribuido a su fuerte poder oxidante sobre los grupos sulfidrilos de proteínas y
lípidos de la membrana celular. Algunas de las reacciones productoras de peróxido de
hidrógeno crean un ambiente anaeróbico desfavorable para ciertos microorganismos. Sin
embargo, algunos investigadores han cuestionado si el peróxido producido es, por sí mismo,
el causante del efecto bactericida. En condiciones normales, este efecto letal puede ser
potenciado por la presencia de la peroxidasa y tiocianatos. La enzima
glicoproteinlactoperoxidasa, presente en diversos fluidos biológicos (tal como la leche)
cataliza la reacción entre el tiocianato y el peróxido de hidrógeno generando el anión
hipocianato. En presencia de un exceso de peróxido se suman otros productos de reacción, los
cuales junto al anión hipocianato generan lesiones y cambios estructurales sobre las
membranas bacterianas, responsables del efecto letal. En realidad, el principal efecto
bactericida atribuído al peróxido se observa en el bloqueo de la glicólisis, más puntualmente
en la inactivación de la gliceraldehído-3P-dehidrogenasa (entre otros cambios) lo cual
interfiere en el metabolismo normal bacteriano (8).
El dióxido de carbono y el diacetilo también se encuentran dentro de los productos
que se liberan del metabolismo de las BAL y a los que se les atribuyen ciertos efectos
antibacterianos. El primero, crea un ambiente aneróbico y baja el potencial de oxidoreducción
en el medio, características éstas desfavorables para determinadas bacterias. Si bien no se
conoce con certeza el mecanismo de acción, se cree que además afecta las decarboxilaciones
enzimáticas y los transportes a través de las membranas en las células.
Se sabe que el diacetilo por su parte, actúa más efectivamente a valores de pH por
debajo de 7, además de ser mucho más activo frente a bacterias gram(-), levaduras y hongos
que hacia bacterias gram (+) dentro de las cuales las BAL, a su vez, son las menos suceptibles
(8).
36
Introducción
Dentro de los compuestos antimicrobianos relacionados a las BAL, las bacteriocinas
probablemente han sido los que más han atrapado la atención de muchos investigadores. El
término bacteriocina se asigna a moléculas de naturaleza proteica con actividad
antimicrobiana, de peso molecular relativamente alto y cuyo espectro de acción involucra
tanto a microorganismos de la misma especie como así también a microorganismos
pertenecientes a especies estrechamente relacionadas. Para ejercer su acción, son absorbidas
por la célula blanco, previo reconocimiento y unión a receptores dispuestos en la membrana
celular (8).
1.5.4.1 Usos profilácticos y paliativos de las bacterias probióticas en
diversas patologías.
Diarrea Infantil.
Entre los principales agentes etiológicos reponsables de las diarreas que afectan la
población infantil a nivel mundial, se encuentran los rotavirus, los cuales producen una
disrupción de la mucosa intestinal incrementando la permeabilidad hacia proteínas como
alergenos o antígenos sin “procesar”, lo cual ocasiona una agresiva reacción inmune.
Desde el punto de vista preventivo se ha encontrado que una cantidad
significativamente baja de niños que reciben fórmulas alimentarias suplementadas con
Bifidobacterium animalis y Streptococcus thermophilus (dosis de 1.9 x 108 UFC/g y 0.14 x
108 UFC/g, respectivamente) han desarrollado diarreas (fundamentalmente a rotavirus) en
comparación con aquellos del grupo control.
Combinaciones probióticas de Bifidobacterium animalis, Lact. acidophilus y Lact.
37
Introducción
reuteri podrían también ser de gran utilidad en la prevención de este tipo de diarreas.
Ciertas cepas de BAL, particularmente Lactobacillus rhamnosus GG, promueven
respuestas inmunológicas sistémicas y locales hacia el virus, lo cual podría ser de gran
importancia en la protección frente a posibles reinfecciones (8). La administración de células
viables de Lact. rhamnosus GG durante la etapa aguda de una gastroenteritis por rotavirus
genera la secreción de IgA específica, pero en la etapa de convalecencia de la misma (5,8).
También se supone que el mejoramiento en la respuesta inmunológica responde a la
contribución que hace este microorganismo a la restauración del normal funcionamiento de
las barreras de defensa de la mucosa intestinal. También demuestra mejores aptitudes Lact.
rhamnosus GG como terápico para el tratamiento de la diarrea, en comparación con mezclas
de Streptococcus thermophilus, y Lact. bulgaricus o Lact. rhamnosus.
Se ha sugerido que las leches fermentadas que poseen microorganismos probióticos
tienen una función de “adyuvantes” en el mejoramiento de las infecciones entéricas, basada
esta sugerencia en estudios experimentales donde se han administrado células atenuadas de
Salmonella typhi junto a leches fermentadas con Lact. acidophilus LA1 y Bifidobacterium
BB12 en dosis diarias superiores a 107 células (8).
Diarrea asociada a antibióticoterapia.
Clostridium dificile es el agente etiológico más importante de este tipo de diarreas,
sobre todo en las intrahospitalarias. La terapia con antibióticos altera las funciones de la
mucosa intestinal a través del desequilibrio que ocasiona sobre su microflora lo cual da
posibilidades que el clostridio se vuelva dominante y produzca su toxina.
En estudios realizados con individuos voluntarios sanos, a los cuales se les
38
Introducción
suministraba simultáneamente un producto lácteo con bacterias probióticas y un antibiótico
(especialmente aquellos reconocidos como causantes de este tipo de infecciones) se ha
observado un efecto preventivo importante cuando se emplearon los siguientes
microorganismos: Bifidobacterium longum, Streptococcus faecium, Lact. rhamnosus GG y
Saccharomyces boulardii (8).
Diarrea del viajero.
Este tipo de infecciones, si bien pueden ser causadas por virus y parásitos, en la
mayoría de los casos se asocia a bacterias y en particular a Escherichia coli
enterotoxicogénica.
La incidencia de este tipo de diarreas es muy irregular debido a que se relaciona con
los distintos destinos geográficos, lo cual pone de manifiesto diferentes agentes etiológicos y
su consecuente incidencia.
Se emplean con fines profilácticos cultivos de bacterias probióticas como es el caso de
preparados liofilizados de Lact. acidophilus y Bifidobacterium bifidum junto a Lact.
bulgaricus y Streptococcus thermophilus en una dosis diaria de 109 bacterias, sin dejar de
mencionar a Lact. rhamnosus GG. Se han observado buenos resultados con el uso de las
mezclas antes mencionadas, en la disminución del riesgo de ocurrencia de las infecciones; sin
embargo no se lograron los mismos resultados cuando se administran aisladamente Lact.
acidophilus, Streptococcus faecium, y Lact. fermentun asociado a Lact. acidophilus (8).
Otras infecciones y patologías relacionadas.
La propiedad probiótica de las BAL, especialmente de Lactobacillus rhamnosus GG,
39
Introducción
de normalizar rápidamente el equilibrio microbiano intestinal, justifica el uso de estas
bacterias para desplazar agentes etiológicos de gastroenteritis como Salmonella y Shigella.
Las bacterias del yogur también son capaces de revertir favorablemente el curso de las
infecciones por Salmonella enteritidis, como así también Lact. acidophilus LA1 y Lact.
rhamnosus GG que inhiben el crecimiento de esta bacteria patógena, abriendo nuevas
perspectivas en su uso como bioterápicos.
Un microorganismo que actualmente ha adquirido gran relevancia es el Helicobacter
pylori, reconocido definitivamente como causante de gastritis en adultos. Este patógeno actual
no está fuera del espectro de acción antimicrobiana que poseen las BAL probióticas. Sin
embargo, es importante aclarar algunos aspectos inherentes al proceso infeccioso en sí. La
gastritis es una inflamación e irritación de la mucosa gástrica que en este caso es producida
por una bacteria. La porción del tracto gastrointestinal involucrada se caracteriza por poseer
una elevada acidez que no afecta el desarrollo del Helicobacter pylori, lo cual hace necesario
emplear para el tratamiento de esta afección bacterias probióticas que tengan la capacidad de
resistir las condiciones fuertemente ácidas encontradas en el estómago. Lact. acidophilus LA1
y Lact. rhamnosus cumplen con estas espectativas, demostrando una mayor efectividad en
comparación al uso de Bifidobacterium bifidus, Pediococcus pentosaccus y Lact. delbrueckii
subsp. bulgaricus (8).
En experiencias con ratas, se logró una sobrevida del 100% cuando éstas se pretrataron
suplementando su alimentación en forma contínua con Lact. casei y Lact. acidophilus,
inoculando luego (vía oral), Salmonella typhimurium. En suero y secreciones intestinales de
los animales se encontraron elevados niveles de anticuerpos específicos hacia la noxa. Por
tanto, se sugiere que la protección inmunológica hacia estas infecciones entéricas se alcanza
40
Introducción
cuando, previo a la llegada del patógeno, se ingieren mezclas de estas BAL y no después
(5,8).
También se han reportado actividades antifúngicas por parte de las bacterias
probióticas. Lact. acidophilus, Lact. reuteri, Lact. rhamnosus GG y Bifidobacterium animalis
muestran tener un importante efecto inhibitorio de infecciones sistémicas por Cándida
albicans como así también frente a candidiasis de mucosas. El fundamento es también, en este
caso, la inmunomodulación de la que participan estas bacterias, a nivel local como sistémico,
aunque también se reconocen mecanismos no inmunológicos (2).
Hasta aquí se han mencionado los usos profilácticos y sintomáticos de las BAL en los
distintos desórdenes gastrointestinales de etiología microbiana. Sin embargo, no debemos
dejar de mencionar los resultados satisfactorios que se han logrado con éstas en el tratamiento
de otros tipos de afecciones como el mejoramiento sintomático de pacientes con Síndrome de
Intestino Irritable, tratados con radiaciones, y aquellos que padecen de Encefalopatía Hepática
y de constipación (fundamentalmente a consecuencia del tipo de alimentación). Ésta última
afecta a un gran número de pacientes geriátricos hospitalizados como consecuencia de la
inmovilidad a la que están sujetos. En estos casos, se han evaluado los efectos producidos al
administrarles leches formuladas con bifidobacterias y leches acidófilas, resultando esta
medida muy satisfactoria para el mejoramiento de la motilidad intestinal que hizo, en muchos
casos, innecesario el uso de laxantes (8).
Todas las propiedades probióticas hasta aquí descriptas requieren de una estrecha
relación de la bacteria probiótica con las células del huésped y su población microbiana.
La gran variedad de metabolitos inhibidores producidos por las BAL encuentra su
41
Introducción
blanco de ataque tanto en aquellas bacterias que reconocemos como “nocivas” hacia nuestra
salud como también hacia otras BAL de especies más o menos relacionadas. Esto último
determina su aptitud para ser usadas, por ejemplo, en la elaboración de productos lácteos
fermentados donde se emplean mezclas de bacterias del starter y bacterias probióticas.
La capacidad de adhesión que poseen estas bacterias probióticas juega un rol de gran
importancia en el proceso de colonización, la cual asegura que éstas lleven a cabo sus
acciones benéficas por las cuales fueron seleccionadas.
Luego de alcanzar la porción inicial del intestino delgado, las bacterias probióticas son
capaces de vivir por un período corto de tiempo en estado no proliferativo. Para establecerse
como habitantes permanentes de la mucosa deberían tener la capacidad de adherirse a las
células epiteliales para evitar, de esta manera, ser removidas y eliminadas por los mecanismos
de “limpieza” que posee el intestino (peristalsis, movimientos de fluídos, funciones del
TLAM, etc.).
La adhesión bacteriana involucra una fase inicial no específica e irreversible de
interacción física entre ambas superficies seguida de una fase específica también irreversible
mediada por elementos de adhesión, generalmente proteínas sobre la superficie bacteriana y
por receptores específicos sobre la célula eucariota. Las interacciones se encuentran regidas
por la especificidad entre la bacteria y las propiedades del huésped. Algunos microorganismos
son huésped-específicos pero otros pueden ser capaces de colonizar más de una especie de
mamíferos.
La Tabla 3 aporta datos, obtenidos en diversas experiencias, en cuanto a la
especificidad de adhesión de lactobacilos de diferentes origenes (11).
42
Introducción
Tabla 3- Adhesión de lactobacilos a células epiteliales escamosas.
Origen animal de los lactobacilos Adhesión a células epiteliales de*

Ratón Rata Pollos Cerdos
Estómago de ratón 9/9 1/1 0/5 **

Estómago de rata 4/4 2/2 0/5 0/1
Estómago de rata 0/4 0/1 ** **
Estómago de rata 0/4 0/2 ** **
Estómago de pollo 0/8 0/4 7/7 0/1
Estómago de pollo 0/5 0/1 0/7 **
Estómago de pollo 0/4 0/1 0/5 **
Estómago de pollo ** ** 5/5 **
Estómago de pollo ** ** ** 4/6
Estómago de cerdo 0/5 0/1 0/5 0/1
Intestino de cerdo ** ** ** 15/17
*
número de bacilos adheridos/ número total de bacilos. ** datos no suministrados.
Es ya una aceptación generalizada que se prefiera el uso de bacterias de origen
humano para la elaboración de alimentos probióticos destinados al consumo humano. Sin
embargo, algunas cepas de origen no humano (como por ejemplo el ambiente lácteo) han
demostrado tener buenas propiedades de adhesión hacia líneas celulares humanas, al menos
en estudios “in vitro”. Se han encontrado cepas adherentes a células tipo Caco-2 (entre otras
líneas celulares) tales como Lact. acidophilus NCD 1748, Lact. acidophilus LB, Lact.
rhamnosus GG (ATCC 53103), Lact. reuteri, Lact. rhamnosus (LA 750) y Lact. acidophilus
BG2F04. La aptitud de colonización temporaria de las mismas se ha podido determinar a
través de la realización de recuentos de células viables en la materia fecal posterior a su
43
Introducción
ingesta. Con respecto al género Bifidobacterium, no todas las cepas son capaces de adherir a
líneas celulares Caco-2 humanas sin causar algún daño sobre las mismas. De los lactobacilos
antes mencionados, Lact. rhamnosus GG ha demostrado tener mayor permanencia en el tracto
intestinal humano lo cual determina una propiedad de colonizar por períodos de tiempo más
prolongados.
En la interacción de las BAL probióticas con la mucosa intestinal, no sólo debe
investigarse los mecanismos de unión a las células, sino también con aquellos constituyentes
orgánicos normalmente presentes en dichas secreciones. Es así que han sido numerosos los
estudios comparativos sobre las propiedades adhesivas de los cultivos probióticos y starters
lácticos empleando como soporte de adhesión líneas celulares tipo Caco-2, material
proveniente de la matriz extraceluar (distintos tipos de fibronectinas y colágenos) y material
de la membrana basal intestinal (lamininas y colágeno tipo IV).
Es evidente que estas aptitudes de adhesión, permanencia y colonización de las BAL
probióticas, están en directa relación con su capacidad de competir por nutrientes disponibles
y de eliminar o impedir que microorganismos patógenos puedan ganar una ubicación sobre la
mucosa intestinal, o bien que la flora oportunista se vuelva dominante en la población
microbiana local manifestando su potencial patogenicidad. Existen evidencias de estudios
efectuados para evaluar la capacidad de estas bacterias de inhibir la invasión y adherencia de
Salmonella typhimurium y Yersinia enterocolítica hacia líneas celulares Caco-2 de origen
intestinal (8).
De la misma manera que la adherencia es un factor fundamental en la colonización, el
mucus lo es también para asegurar la estabilidad y permanencia de la lactoflora en el
44
Introducción
intestino. Éste, se compone de sustancias glicoproteicas como la mucina y se distribuye sobre
la superficie celular en capas viscosas de espesor variable. La mucina es degradada por
miembros de la microflora, fenómeno éste que se manifiesta desde los primeros meses de
vida. Uno de los integrantes de la flora degradativa es Lactobacillus, con capacidad de
fermentar monosacáridos como L-fructosa y D-glucosaminas que forman parte de la mucina.
También participan en dicho proceso enzimas como  y  glicosidasas, y proteasas sustrato
específicas.
Los lactobacilos, a lo largo de la vida del individuo, se mantienen en una población
más o menos estable gracias a su capacidad de utilizar los nutrientes endógenos del lugar. Si
bien se producen cambios en la composición de la mucina con el tiempo, este último no afecta
tan drásticamente la flora residente como lo hace el cambio de la lactancia materna a la
incorporación de una dieta sólida. Cepas metabólicamente activas capaces de degradar la
mucina, como son los lactobacilos, alcanzan la aptitud de residencia como población
microbiana estable en función de la estructura y características composicionales de estos
“nichos microbianos” determinadas entre otros por la competitividad hacia los nutrientes
disponibles (2,8).
1.5.4.2 Importancia de las bacterias probióticas en la nutrición
humana.
El rol nutracéutico de las bacterias probióticas ha sido extensamente estudiado.
Los ácidos grasos libres de cadena corta (AGLCC), productos del metabolismo de las
BAL (como ácido láctico, propiónico y butírico) pueden acumularse y manifestar una
45
Introducción
importante actividad biológica en el intestino. También, a partir del metabolismo fermentativo
de las proteínas se liberan AGLCC, los cuales rápidamente son absorbidos (particularmente
ácido propiónico y acético) contribuyendo al “pool” de energía en el huésped. Debido a que la
concentración de AGLCC es un factor determinante del pH en el lúmen colónico y varias
enzimas manifiestan sus actividades en función del mismo, cambios en el nivel de AGLCC
podrían tener una importante implicancia sobre compuestos exógenos y carcinógenos en el
intestino.
Existen numerosos estudios que indican que la fermentación de ciertos alimentos con
BAL incrementa la cantidad, biodisponibilidad y digestibilidad de los nutrientes en ellos
presentes. La fermentación bacteriana produce un incremento en el contenido de niacina y
riboflavina en yogur, vitamina B12 en queso cottage y vitamina B6 en queso Cheddar.
También se les ha adjudicado a las BAL la capacidad de producir vitamina B12 ya sea en
monocultivos como en asociación con hongos (en ciertos productos fermentados de soja).
Lact. casei y Strep. faecalis producen y degradan ácido fólico hacia
poligamaglutamatos en la mucosa intestinal. El ácido orótico, si bien es necesario para el
desarrollo de la microflora entérica, se encuentra disminuído en un 18 a 48% en las leches
fermentadas, y en cierto modo sería beneficioso ya que se sabe que en ratas este ácido en
elevada cantidad induce la transformación a hígado graso (2).
Una de las propiedades “saludables” más importantes de los probióticos que ha
determinado su utilidad como “alimento terapéutico” para individuos intolerantes a la lactosa,
es el aporte de la enzima -galactosidasa (lactasa) en el ambiente intestinal. Esta patología se
caracteriza por la incapacidad en los individuos que la padecen, de producir la enzima
46
Introducción
(normalmente presente en la superficie apical de los enterocitos) lo cual lleva a que no puedan
digerir la lactosa presente en los alimentos y a que el disacárido sea degradado por enzimas
bacterianas intestinales causando diarrea osmótica. Esta enfermedad tiene una alta incidencia
en Japón, China, Africa y en la población indígena australiana (8,10).
Es importante aclarar que la intolerancia a la lactosa puede ser de causa genética o
bien aparecer como consecuencia de una radioterapia, infecciones virales, de patologías como
la Esprúe celíaca, donde el común denominador en todos estos casos es la lesión del
enterocito que sintetiza la beta-galactosidasa. También es importante no confundir la
sintomatología que presenta esta enfermedad con la de otros desordenes de localización
intestinal muy similares.
Los individuos intolerantes a la lactosa inmediatamente después de ingerir leche o
algún alimento que contenga lactosa, desarrollan diarreas acompañadas de flatulencia y
dolores abdominales. La severidad del cuadro clínico es muy variable y depende de cada
individuo. Cuando se reemplaza en la dieta la leche por productos lácteos fermentados, estos
individuos mejoran notoriamente la tolerancia al alimento y los síntomas son mucho más
leves.
Más específicamente son las BAL (entre las cuales consideramos con especial
atención a las probióticas) empleadas en sus formulaciones las responsables de mejorar la
digestibilidad de este tipo de alimentos a través de:
 Menor concentración de lactosa en el producto fermentado, por hidrólisis
parcial efectuada por el fermento en la leche.
47
Introducción
 Elevada actividad de -galactosidasa presente en las bacterias empleadas para
fermentar el producto (bifidobacterias y Lact. acidophilus, entre otras de menor
actividad).
 Progresivo aumento en la actividad de la enzima con el consumo permanente
de este tipo de productos una vez que el probiótico sobrevivió a las condiciones agresivas
de la secreción gástrica y biliar y alcanza la residencia intestinal. Al parecer, la presencia
de bilis generaría en estas bacterias una mayor actividad de lactasa.
 Otro factor que se sugiere contribuye a la digestibilidad de la lactosa es la
menor velocidad de vaciado gástrico cuando se ingiere yogur u otro lácteo fermentado
semisólido, en comparación con la leche fluída.
La metodología más difundida para estudiar la metabolización de los carbohidratos en
el ser humano, es la medición de hidrógeno en el aire expirado.
Si el azúcar es completamente digerido en el intestino no se detectará hidrógeno en el
aire expirado, pero si no se produce dicha digestión los azúcares pasan al colon donde las
bacterias del lugar los metabolizan con producción de hidrógeno el cual es llevado a los
pulmones y eliminado con el aire.
Experiencias con voluntarios sanos han demostrado que realmente el aporte de
bacterias que poseen actividad de lactasa en los alimentos mejora la digestión de los mismos.
Cuando se suministró a éstos leche, yogur, yogur pasteurizado y una solución acuosa de
lactosa, luego de su ingestión la menor cantidad de hidrógeno medido en el aire expirado
correspondió al consumo de yogur en comparación a los otros preparados. Estos resultados
avalan las conclusiones extensamente difundidas sobre el aporte que hacen las BAL
48
Introducción
probióticas de -galactosidasa y P-galactosidasa a los individuos carentes de las mismas
(5,8).
La Tabla 4 resume los principales efectos reportados de los organismos probióticos
sobre la salud humana (8).
1.6 Participación de las bacterias probióticas en la formulación de
productos lácteos.
Los alimentos fermentados poseen una larga trayectoria como parte integrante de la
dieta del ser humano en distintos lugares del mundo, debido a su inocuidad y a que la
fermentación es una de las alternativas más antiguas de preservación de alimentos.
Con el advenimiento de las modernas tecnologías en el procesamiento de alimentos, la
producción en gran escala de productos lácteos fermentados ha sido consumada con el uso de
controles precisos sobre la manipulación de microorganismos y enzimas específicas para el
proceso de fermentación.
En Oriente e India se fermenta la leche para elaborar yogur y otros tipos de productos
lácteos desde hace ya mucho tiempo. Más de 1000 tipos diferentes de quesos han sido
elaborados utilizando BAL tanto en Europa como en varios países del Este. En todo el mundo,
los alimentos fermentados continúan siendo hoy día uno de los componentes más importantes
de la dieta. Tradicionalmente, las bacterias probióticas han sido empleadas en la elaboración
de este tipo de productos, y entre ellas podemos mencionar especies de Lactobacillus,
Bifidobacterium además de Streptococcus thermophilus.
49
Introducción
Tabla 4- Microorganismos probióticos empleados actualmente y sus efectos sobre el status nutricional
y la salud del huésped.
Microorganismo Efectos reportados en estudios clínicos
Lactobacillus johnsonii Adherencia hacia células intestinales humanas, balancea la microflora

LA1 intestinal, mejoramiento inmunológico, adjuvante en el tratamiento de
Helicobacter pylori.
Lactobacillus acidophilus Descenso de actividades enzimáticas y mutagénesis en intestino,
NCFB 1748 prevención de diarrea asociada a radioterapia, mejoramiento de la
constipación.
Lactobacillus rhamnosus Prevención de diarrea asociada a antibióticos, tratamiento y
GG (ATCC 53013) prevención de diarrea por rotavirus, tratamiento de recaídas de
diarreas por Clostridium difficile.
Lactobacillus acidophilus Descenso de actividades enzimáticas intestinales, tratamiento de la
NCFM intolerancia a la lactosa, producción de bacteriocinas.
Lactobacillus casei Prevención de desordenes intestinales, balance microbiano, descenso
Shirota de actividades enzimáticas intestinales, efectos positivos sobre cáncer
de vesícula.
Lactobacillus acidophilus Balance de la microflora intestinal, protección frente a diarrea del
LA5 viajero, mejoramiento inmunológico.
Lactobacillus gasseri Descenso de actividades enzimáticas intestinales, sobrevive en el
(ADH) tracto intestinal.
Lactobacillus reuteri Colonización del tracto intestinal, acortamiento de duración de
diarreas por rotavirus.
Strep. thermophilus, No posee efectos sobre diarrea por rotavirus, mejoramiento
Lact. delbrueckii subsp. inmunológico pero no durante la diarrea por rotavirus, no afecta las
bulgaricus actividades enzimáticas intestinales, paliativo para los síntomas por
intolerancia a la lactosa (dependiente de cada cepa)
Bifidobacterium bifidum Tratamiento de diarreas virales incluyendo rotavirus, balance de la
microflora intestinal.
Saccharomyces boulardii Prevención de diarrea asociada a antibióticos, tratamiento de colitis
por Clostridium difficile.
50
Introducción
Probablemente todo comenzó como un proceso natural donde la disponibilidad de
nutrientes y las condiciones del medio circundante llevaron a la selección de microorganismos
particulares, los cuales modificaron y preservaron de esta manera el alimento.
Actualmente, se cree que existen en el mercado aproximadamente 80 productos
formulados con bifidobacterias, en su mayoría lácteos como yogur, cremas ácidas, suero de
manteca, leches fortificadas y una considerable variedad de postres.
Una especial atención han generado los alimentos considerados “saludables” o
“beneficiosos” para la salud del consumidor y son los hoy conocidos “alimentos probióticos”,
formulados con una variada gama de bacterias: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,
Lactococcus lactis, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Streptococcus
thermophilus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis y Bifidobacterium sp. Estos
microorganismos pueden encontrarse bajo distintas formas de formulación, tales como
comprimidos o en polvo, y también ser incorporados a diversos alimentos como leche y sus
derivados fermentados, gomas masticables, dulces, postres, bebidas, preparaciones a base de
soja etc. (2,8).
1.6.1 Selección de cepas destinadas a la elaboración de productos
probióticos.
Para ser usadas en la formulación de este tipo de alimentos, las cepas deben pertenecer
a los microorganismos Generalmente Reconocidos como Seguros (GRAS). En este aspecto,
nuevas cepas para las cuales no se ha probado su bioseguridad, deben ser testeadas en cuanto
51
Introducción
a su toxicidad y tolerancia antes de ser aceptadas para la elaboración de alimentos probióticos.
En la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo que puede ser de gran utilidad para
seleccionar microorganismos con capacidad probiótica (3).
La selección bacteriana está principalmente determinada por el uso específico que se
le quiere dar al probiótico. Las características más buscadas en bacterias para su uso como
probióticos destinado al consumo humano son:
 Ser de origen humano. Su tolerancia y seguridad deben estar testeadas y
aprobadas.
 Ser capaces de sobrevivir a las condiciones del tracto gastrointestinal.
 Contribuir a la regulación favorable de las funciones de la mucosa y a la
recuperación frente a desordenes intestinales.
 Producir vitaminas (ácido fólico y complejo vitamínico B) y enzimas
beneficiosas que facilitan la digestión de los alimentos, la absorción de los nutrientes
esenciales y la inactivación de carcinógenos y compuestos tóxicos.
 Mejorar la biodisponibilidad en el intestino de minerales y oligoelementos.
 Poseer capacidad de adhesión al epitelio intestinal, colonizar la mucosa y
proliferar en dicho sistema microbiano.
 Producir sustancias antimicrobianas y tener un amplio espectro de actividad
inhibitoria frente a los principales microorganismos patógenos humanos.
 Poseer componentes celulares probio-activos que estimulen las funciones de
defensa en el huésped (sistema inmunológico).
52
Introducción
Origen
Bioseguridad
Aspectos
Resistencia al
Generales pH, secreciones gástricas, biliares y pancreáticas
(Antibióticos)
Aspectos
Actividad y viabilidad
Tecnológicos microbianas Producción/Proceso
Adherencia a tejido y epitelio intestinal
Antagonismo hacia
Estimulación de la
patógenos
respuesta inmune
Actividad antimicrobiana
Aspectos
Funcionales
Influencia en las actividades

metabólicas
Fig. 1- Estrategia para la selección de cepas probióticas.
53
Introducción
Hoy día, el consumidor tiene acceso a mayor información, transformándolo en un
verdadero conocedor de los productos que incorpora en su alimentación y en particular de los
beneficios que pueden ofrecerles los probióticos. Se ha sugerido una dosis terapéutica mínima
de 106 a 109 UFC/ g o ml de producto a incorporar diariamente.
1.6.2 Supervivencia de las bacterias probióticas en los productos
lácteos.
La mayoría de las bacterias probióticas poseen una fase estacionaria muy corta en su
desarrollo, seguida de una rápida pérdida de viabilidad incluso en el almacenamiento a bajas
temperaturas. Esta vida útil tan limitada ha llevado tanto a investigadores como a las
industrias a la búsqueda de nuevas cepas más aptas para su aplicación tecnológica. Es de
suma importancia evaluar la resistencia y viabilidad de estos microorganismos durante el
procesamiento y almacenamiento del producto. Los primeros pasos en la elaboración de
probióticos son el cultivo en gran escala, lavados y deshidratado o secado de los
microorganismos. En general, estos organismos pueden soportar manipulaciones bajo
condiciones rigurosas como el congelamiento y almacenamiento a –20ºC o menos; sin
embargo, son mucho más suceptibles a la deshidratación por congelamiento y en particular al
secado spray.
Cuando se requieren períodos de almacenamiento muy prolongados o bien cuando el
producto va a quedar expuesto a condiciones desfavorables para su conservabilidad, surge
como una alternativa a tener en cuenta la encapsulación de estos microorganismos.
54
Introducción
Exigentes controles de calidad se hacen necesarios para evitar contaminación de estos
productos con microorganismos alterantes y/o patógenos que pueden llevar a fermentaciones
indeseadas, conduciendo a una baja calidad, además de una posible falta de inocuidad del
mismo. El control de calidad debe asegurar el mantenimiento de las propiedades tecnológicas
y la estabilidad de las bacterias probióticas en el producto. A continuación se citan algunas de
ellas (2):
 Mantener viabilidad durante el procesamiento y almacenamiento.
 No alterar el flavor y demás cualidades organolépticas.
 No probocar sobreacidificación en el producto durante el almacenamiento.
 Conservar las propiedades de colonización intestinal durante el procesamiento
y almacenamiento.
 Mantener estabilidad y funcionalidad después del proceso de deshidratación o
congelamiento, entre otros.
 Identificación segura de la cepa y eliminación de contaminantes indeseados.
 Conocer la relación dosis-respuesta para lograr el efecto deseado.
Como se mencionó anteriormente, cuando estas bacterias alcanzan la fase estacionaria,
comienza a hacerse más notoria la muerte celular (fase de muerte celular) lo cual puede
evidenciarse con una caída en los recuentos de células viables de acuerdo a una cinética
exponencial, donde
Xt = X0 –kt
55
Introducción
Xt es la concentración de células vivas luego de un tiempo t.
X0 es la concentración de células vivas iniciales.
k es la constante específica de muerte celular.
Dicha constante de muerte celular depende de cada cepa y de las características
físicoquímicas del medio en el que desarrolla.
 Efecto de la temperatura de almacenamiento.
Cuando el producto es almacenado a temperatura ambiente (25ºC), la viabilidad de
Lact. casei en leche fermentada disminuye 2 ordenes log. en aproximadamente 2 semanas en
comparación con Lact. plantarum, Lact. acidophilus y Bifidobacterium bifidum, los cuales
poseen una mayor tasa de muerte celular a la misma temperatura. Sin embargo, la viabilidad
de los lactobacilos en leche fermentada puede prolongarse cuando se almacenan a 5ºC (Tabla
5).
Una ventaja adicional del almacenamiento a bajas temperaturas es que, si bien la
fermentación y consiguiente acidificación en el producto continúa aún en esas condiciones,
ésta se lleva a cabo muy lentamente evitando de esta manera la sobreacidificación del
producto (8).
 Efecto del pH.
Valores de pH cercanos a la neutralidad en cultivos de Lactobacillus acidophilus,
prolongan marcadamente su sobrevida (8). La Tabla 6 (8) muestra este tipo de resultados.
56
Introducción
Tabla.5- Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre el tiempo requerido para que el recuento
de células viables de bacterias probióticas disminuya 2 ordenes logarítmicos en leche fermentada.
Especie / cepa pH del Temperatura de Recuento inicial Tiempo

producto almacenamiento (UFC/ml) (días)
(ºC)
Lact. casei YIT 9018 3.5 25 5x109 13

(cepa Yakult) 3.8 5 1x109 >30
Lact. plantarum MDI 133 3.4 25 3x109 4

(cepa Malaysia Dairy) 3.8 5 2x109 >30
Lact. acidophilus CH5 4.0 25 3x108 3

(cepa Chr. Hansen) 3.6 5 1x108 15
Bif. bifidum BB12 4.3 25 2x109 4

(cepa Chr. Hansen) 4.3 5 2x109 15
Tabla 6- Efecto del pH del producto sobre el tiempo requerido para que el recuento de células viables
de bacterias probióticas disminuya 2 ordenes logarítmicos en leche fermentada.
Especie /cepa pH del Temperatura de Recuento inicial Tiempo

(ºC)
Lact. casei YIT 9018 3.8 25 5x109 13

(cepa Yakult) 6.5 25 1x109 >30
Lact. plantarum MDI 133 3.4 25 3x109 4

(cepa Malaysia Dairy) 6.5 25 3x109 >30
Lact. acidophilus CH5 4.0 25 3x108 3

(cepa Chr. Hansen) 6.6 25 1x108 >30
Bif. bifidum BB12 4.3 25 3x109 4

(cepa Chr. Hansen) 6.6 25 1x109 >15
57
Introducción
 Efecto de los compuestos de aroma.
Algunas bacterias probióticas como Lactobacillus acidophilus, si bien han demostrado
propiedades probióticas destacables, no generan acetaldehído como producto final del
metabolismo y por lo tanto, cuando se elabora leche acidóphila, ésta resulta un producto muy
pobre en cuanto a su flavor. Para mejorar su aceptabilidad por parte del consumidor, se
suelen adicionar diversos aditivos mejoradores del flavor como jugos de frutas y frutas en
trozos previamente pasteurizados.
Al parecer, no todos los jugos de frutas afectan de igual manera la viabilidad de Lact.
acidophilus en el producto. La Tabla 7 ejemplifica los efectos observados con distintos tipos
de jugos (8).
Tabla 7- Efecto de jugos de frutas adicionados a leche fermentada sobre el tiempo requerido para que
el recuento de células viables de Lact. acidophilus CH5 (cepa Chr. Hansen) disminuya 2 ordenes
logarítmicos.
Leche Fermentada pH del Temperatura de Recuento inicial Tiempo

(ºC)
Leche 3.8 5 1x109 15

9
Leche +3%(v/v) jugo frutilla 3.8 5 1x10 5
8
Leche +3% (v/v) jugo naranja 3.8 5 8x10 15
Leche +3% (v/v) jugo uva 3.8 5 1x109 15
8
Leche +3% (v/v) jugo manzana 3.8 5 9x10 15
Leche + 3% (v/v) jugo mango 3.8 5 1x109 15
9
Leche +3% (v/v) jugo ananá 3.8 5 9x10 15
58
Introducción
La respuesta a la mayor pérdida de viabilidad que sufre Lact. acidophilus cuando se
adiciona jugo de frutillas a estos productos, tiene que ver con la exposición de los productos a
la luz diurna. Se supone que ésto desencadena fotorreacciones que inducirían a la formación
de sustancias aparentemente tóxicas hacia las células bacterianas.
Existen también factores bioquímicos que pueden afectar la estabilidad celular. A
continuación haremos un breve comentario de cada uno de ellos.
 Provisión de energía.
Un metabolismo activo y la consecuente generación de energía son prerrequisitos
fundamentales para el mantenimiento de la integridad celular y la estabilización citosólica de
proteínas en los lactobacilos. Sin embargo, una excesiva generación de energía (ATP) puede
conducir a la inestabilidad celular y favorecer la muerte.
 Oligoelementos.
Existen evidencias certeras del efecto del magnesio sobre la estabilidad de los
lactobacilos, como sucede con Lactobacillus delbrueckii. Al parecer, este catión es requerido
para el normal funcionamiento de las kinasas de la vía glicolítica, además de estabilizar esta
vía metabólica en presencia de glucosa.
 Tolerancia al oxígeno.
El peróxido de hidrógeno producido por los startes del yogur, compromete la
viabilidad de Lactobacillus acidophilus, cuando se adiciona a este tipo de producto
59
Introducción
fermentado. En realidad, Lact. acidophilus también produce peróxido de hidrógeno cuando
desarrolla en presencia de oxígeno. Sin embargo, la célula posee mecanismos para evitar su
acúmulo en el interior autoprotegiéndose del efecto oxidativo del mismo. Otro de los
mecanismos de los que se valen las bacterias para evitar ser dañadas por este agente, es el uso
de enzimas propias que desdoblen el peróxido de hidrógeno como la pseudocatalasa y
peroxidasa.
 Otros factores.
La menor disponibilidad de fuentes de energía y carbohidratos fermentables que se
observa a medida que las bacterias probióticas desarrollan en el producto, inevitablemente
lleva a un descenso en la tasa de crecimiento en el mismo y el hecho de recurrir a fuentes de
energía alternativas no afecta la viabilidad de Lact. acidophilus durante el almacenamiento.
Otra de las causas que puede llevar a un menor desarrollo de estos microorganismos
en el producto, es la acidificación que se produce durante el almacenamiento, pero ésta no
llega a ser importante cuando las condiciones de conservación son las adecuadas.
La ácidofilicidad y ácidoestabilidad de las bacterias probióticas dependen del
funcionamiento de las membranas y su permeabilidad hacia las formas no disociadas de los
ácidos orgánicos producidos por el metabolismo bacteriano.
Complejos mecanismos que involucran el mantenimiento de gradientes de protones y
moléculas cargadas a través de las membranas mitocondriales, la exclusión extracelular de los
ácidos orgánicos producidos, la eliminación de aquellos que ingresan en su forma no
disociada al citoplasma (los cuales ocasionan una serie de cambios en la concentración
60
Introducción
intracelular de protones) y el efecto amortiguador de la ATPasa para mantener dicha
concentración y pH en los valores normales citoplasmáticos, determinan en conjunto que la
célula bacteriana pueda adaptarse y sobrevivir a su propia capacidad acidificante.
Es interesante notar que Lactobacillus casei, el cual fermenta numerosos
carbohidratos, puede sobrevivir por más tiempo en productos lácteos fermentados frente a
Lactobacillus acidophilus, cuyo espectro de fermentación es mucho más limitado.
Probablemente, la diferente composición bioquímica de las membranas celulares sea la razón
por la cual algunas bacterias tengan distinto grado de ácidoestabilidad y, por tanto, distinta
capacidad de sobrevivir en productos lácteos fermentados.
Como se mencionó previamente, la ácidotolerancia es el reflejo de la ácidoestabilidad,
por lo que sería posible seleccionar cepas que sobrevivan largos períodos de tiempo en
ambientes ácidos. Una estrategia simple de selección podría ser el subcultivo de mutantes de
estas bacterias, o el uso de un sistema continuo de cultivos que por adaptación al medio,
condujera a una autoselección de las cepas más ácidotolerantes. Salminen y col. (8) han
informado que otros investigadores propusieron un proceso de selección donde se toma la
producción de ácido como el factor determinante del aislamiento de cepas de lactobacilos. El
procedimiento se basa en dos hechos fundamentales:
1. El pH en el medio (leche) sólo descenderá, en la fermentación, como
consecuencia de la producción de ácido.
2. A valores de pH bajos sólo las variantes ácidotolerantes continuarán con su
desarrollo.
61
Introducción
Internacionalmente, se han establecido stándares para la elaboración de la gran
diversidad de productos lácteos fermentados. En Japón existen stándares especificados
(sujetos a ordenanzas y regulaciones ministeriales de ese país) para cuatro tipos de productos:
leches fermentadas, bebidas lácteas conteniendo células vivas o pasteurizadas y bebidas de
base fundamentalmente láctea.
Fuera de Japón, los stándares internacionales pueden encontrarse en la Comisión del
Codex Alimentarius de la FAO/WHO, que los especifica también para cuatro tipos de
productos: yogur, yogur endulzado, yogur aromatizado y productos que son pasteurizados
post-fermentación.
En diversos países, el uso de Lact. acidophilus en la industria láctea fue anterior al uso
de bifidobacterias, particularmente para la elaboración de las conocidas leches acidófilas,
debido a las ventajas del mismo ya que permite su manipulación de la misma manera que las
BAL normales, además de no presentar generalmente problemas de taxonomía.
Productos que incluyen únicamente Lactobacillus acidophilus son, por ejemplo,
Biolak (Unión Soviética), Arla acidophilus milk (Suecia) y Sweet acidophilus milk (USA).
Aco-yoghurt (Suiza) y Bioghurt (Alemania) contienen Lact. acidophilus en combinación con
BAL termofílicas y Acidophilus cultured milk (Yugoslavia) y Acidophilin (Unión Soviética)
poseen Lactobacillus acidophilus junto a BAL mesofílicas y levaduras.
Cuando se emplean bifidobacterias para la elaboración de leches fermentadas, es
necesario recurrir a complejas técnicas para asegurar la viabilidad durante el almacenamiento,
ya que este microorganismo muere rápidamente cuando el pH alcanza valores por debajo de 5
y cuando queda expuesto al oxígeno del aire. Respecto al uso de este género, existen dos
tipos de productos:
62
Introducción
 Aquellos en los cuales la fermentación de la leche se realiza directamente con
las bifidobacterias y
 Aquellos en los que se adiciona un cultivo concentrado de bifidobacterias a la
leche previamente fermentada.
Cuando se fermenta la leche con bifidobacterias, es necesario adicionar al producto
sustancias que contribuyan al flavor ya que este microorganismo al ser heterofermentativo no
confiere al mismo el flavor deseado. En el segundo tipo de producto, no se presentan
inconvenientes en lo que respecta al flavor obtenido. Sin embargo, serían necesarios nuevos
estudios sobre la preparación y almacenamiento de los cultivos concentrados que se emplean,
lo cual lleva a utilizar equipamientos especiales.
En las bebidas lácteas, Lactobacillus acidophilus es el más comunmente utilizado para
su formulación, y entre las leches fermentadas hay productos que contienen distintas
combinaciones tales como bifidobacterias con Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus y Strep.
thermophilus, Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus reemplazado por Lact. acidophilus y Lact.
acidophilus con Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus y Strep. thermophilus (8).
La legislación vigente para el Mercosur, sugiere un nivel mínimo en el recuento de
bacterias probióticas viables (presente en productos comerciales) de 106 CFU/g de producto,
cuando se trate de bifidobacterias (17). Se ha debatido mucho acerca del control legislativo
existente y si éste es suficiente para la regulación de los alimentos funcionales. También se
plantea si debe ser introducido un registro específico para éstos. En estos momentos, la
definición legal de un alimento funcional ha sido estipulada bajo el sistema FOSHU (Food for
Specific Health Use) perteneciente a la regulación alimentaria japonesa. Dicha definición
63
Introducción
establece que un alimento funcional es aquel que satisface los efectos benéficos hacia la salud
que son exigidos (11).
En la Unión Soviética se han dirigido los estudios hacia el kefir, una interesante leche
fermentada a la cual se le ha dado más bien una importancia “artesanal”. Este tipo de alimento
se elabora con un único starter: los gránulos de kefir. En ellos podemos encontrar, en relación
simbiótica sobre una matriz de polisacáridos, BAL homo y heterofermentantes (Lactococcus,
Leuconostoc), Acetobacter y levaduras. El kefir también es elaborado en otras partes del
mundo como Alemania y Suiza donde existen variantes fluída, set y batida. El kefir europeo
es envasado en recipientes que contienen en sus capas de aluminio pequeños orificios para
eliminar el dióxido de carbono generado por el metabolismo heterofermentativo y así evitar el
hinchado de los envases y la ruptura del sellado de seguridad que identifica la integridad del
producto. Este tipo de packaging no está permitido en otros países y se están desarrollando
numerosos estudios sobre la manufactura y envasado del kefir para lograr una calidad
uniforme y asegurar la inocuidad del mismo. Al kefir se le han atribuido varios efectos
benéficos: aumenta el apetito, colabora en el proceso de digestión de los alimentos y mejora el
funcionamiento renal.
Otra alternativa atrayente, de este tipo de “alimentos saludables” es la formulación de
leches que contienen bacterias probióticas y a las cuales se les ha eliminado el contenido de
colesterol o bien se han fortificado con vitaminas, modificado la composición en proteínas y
grasas con adicionado de leches de soja y proteínas de lactosuero (5). La Tabla 8 (11) detalla
algunos de los numerosos productos probióticos comerciales que existen en el mercado
mundial.
64
Introducción
Tabla 8- Productos probióticos comerciales.
Japón
Bacterias probióticas
Producto Empresa presentes Propiedades funcionales Categoría
Normaliza el balance de la flora Bebida láctea
Yakult 65 Yakult Honsa Lact. casei Shirota intestinal humana fermentada
Yakult 80 Ace Yakult Honsa Lact. casei Shirota intestinal humana fermentada
Morinaga Caldus Morinaga Milk B. longum Normaliza el balance de la flora Bebida láctea y leche
y Bifidus Industry Lact. acidophilus intestinal humana fermetadas
Lact. casei Shirota Normaliza el balance de la flora
Sofuhl Yakult Honsa Strep. thermophilus intestinal humana Leche fermentada
Lact. casei Shirota Normaliza el balance de la flora
Joie Yakult Honsa Strep. thermophilus intestinal humana Leche fermentada
B. breve cepa Yakult
Mil-Mil Yakult Honsa B. bifidum cepa Yakult Normaliza el balance de la flora Leche fermentada
Lact. acidophilus intestinal humana
Mil-Mil E Yakult Honsa Lact. acidophilus Normaliza el balance de la flora Leche fermentada
Strep. thermophilus intestinal humana
Bifiel Yakult Honsa Strep. thermophilus Normaliza el balance de la flora Leche fermentada
L. lactis intestinal humana
Wakamoto Lact. acidophilus Normaliza el balance de la flora Polvo dehidratado
Levenin Pharmaceutical B. infantis, Ent. faecalis intestinal humana congelado
Strep. thermophilus
Lact. delbrueckii subsp.
Onaka He GG Takanashi Milk bulgaricus Normaliza el balance de la flora Bebida láctea
Products Co. Lact. rhamnosus GG intestinal humana fermentada
Asia, Oceanía y Brasil

Yakult Yakult Lact. casei Shirota intestinal humana fermentada
Lact. johnsonii Bebida láctea
CHAMYTO Nestlé Lact. helveticus fermentada
65
Introducción
Tabla 8- Productos probióticos comerciales (continuación).
Malasya Dairy Lact. acidophilus Normaliza el balance de la flora Bebida láctea
Vitagen Industry intestinal humana fermentada
JALNA Dairy Lact. acidophilus
Bio-Garde Food B. bifidum, Lact. casei Leche fermentada
Yoplait National Dairies Lact. acidophilus Leche fermentada

VITA CHARM P.T. Pola Lactobacillus sp. Promotor de salud Leche fermentada
QUF Industries Lact. acidophilus
VAALIA Pauls B. lactis Balance de la flora inestinal Yogurt
Lact. rhamnosus GG Promotor de salud Leche fermentada
Classic Flavor Danone Lact. acidophilus Promotor de salud Leche fermentada
Australia Lact. acidophilus
Ski Cooperation Bifidobacterium Promotor de salud Leche fermentada
Europa.
Yakult Yakult Lact. casei Shirota intestinal humana fermentada
Strep. thermophilus
Lact. delbrueckii subsp.
LC1 Nestlé bulgaricus Estimulación del sistema Leche fermentada
Lact. johnsonii inmunológico
Strep. thermophilus, Lact.
delbrueckii subsp. Mantiene equilibrada la flora
GEFILUS Valio Ltd. bulgaricus, Lact. intestinal.
acidophilus, B. bifidum, Mejoramiento de la respuesta Leche fermentada
Lact. rhamnosus GG inmunológica
Strep. thermophilus, Lact.
delbrueckii subsp.
Actimel Danone bulgaricus, Lact. casei Mejoramiento de la resistencia a Leche fermentada
Imuntass infecciones por bacterias patógenas.
Ventrux Acido AB Cernelle Strep. feacium SF68 Suplemento nutricional Cápsulas
Bra-Mjoelk Arla Lact. reuteri Sistema de defensa del intestino Leche fermentada
66
Introducción
Tabla 8- Productos probióticos comerciales (continuación).
Estados Unidos de América

Classic Flavor Danone Lact. acidophilus Promotor de salud Leche fermentada

Hynson, Lact. acidophilus
Lactinex Westcott and Lact. delbrueckii subsp. Polvo
Dunnig bulgaricus Promotor de salud
LGG ConAgra Lact. rhamnosus GG Promotor de salud Cápsulas
67
Introducción
1.6.3 Inocuidad de los microorganismos probióticos destinados al
consumo humano.
Existe un interés considerable en extender el uso de los microorganismos probióticos
desde las conocidas fórmulas para los productos lácteos hacia otro tipo de productos tales
como fórmulas para infantes, alimentos a base de jugo de fruta y cereales e incluso productos
farmacéuticos (11).
El uso de las bacterias probióticas en la formulación de alimentos tiene ya una extensa
trayectoria, y la mayoría de las cepas empleadas se consideran microorganismos comensales
en el ser humano, sin que se haya demostrado potencial patogénico alguno. La seguridad en la
manipulación de estas bacterias está avalada por el hecho de que vienen siendo empleadas en
la industria desde hace mucho tiempo, no habiéndose informado inconvenientes.
Al género Lactobacillus se lo considera GRAS, mientras que los géneros de
Streptococcus y Enterococcus contienen algunas especies oportunistas y patógenas (Tabla 9)
(8).
Factores inherentes al huésped como el funcionamiento normal de las barreras de
defensa y la integridad de la mucosa intestinal, junto a los microorganismos que constituyen
la microbiota presente en el lugar, conforman un habitat equilibrado. La llegada de
microorganismos foráneos no debe encontrar, en el lugar, oportunidad de manifestar efecto
virulento alguno. La dosis o concentración de estos micorooganismos en la mucosa, y el nivel
inmunológico del huésped pueden transformar, por ejemplo, a enterococos de simples
comensales a patógenos oportunistas (11).
68
Introducción
Tabla 9- Clasificación de microorganismos probióticos en función de su bioseguridad para

consumo humano.
Género Potencial infectivo
Lactobacillus Principalmente no patógenos, algunos oportunistas (especialmente en

inmunocomprometidos)
Lactococcus Principalmente no patógenos
Leuconoctoc Principalmente no patógenos, algunas cepas aisladas de infecciones.
Streptococcus Estreptococos orales principalmente no patógenos, algunos pueden
provocar infecciones como oportunistas
Enterococcus Algunas cepas patógenas oportunistas con actividad hemolítica y
resistencia a ciertos antibióticos.
Bifidobaterium Principalmente no patógenos, algunas cepas aisladas de infecciones.
Saccharomyces Principalmente no patógenos, algunas cepas aisladas de infecciones.
El cuestionamiento del uso de las BAL como probióticos ha surgido como
consecuencia de recientes informes clínicos de bacteremias asociadas a estas bacterias. Cepas
de Lactobacillus (de las especies Lact. rhamnosus, Lact. casei, Lact. paracasei y Lact.
plantarum) se han aislado de casos clínicos. Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis
están mucho más comprometidos en este aspecto, ya que se los ha encontrado más
frecuentemente asociados a infecciones, y debido también a recientes apariciones de cepas
resistentes a la vancomicina (8).
Para evaluar la bioseguridad del empleo de estos microorganismos probióticos se
proponen tres metodologías:
69
Introducción
1. Estudios sobre las propiedades intrínsecas de las cepas.
2. Estudios sobre la farmacocinética de las cepas
3. Estudios para conocer las interacciones cepa-huésped
1. Estudios sobre propiedades intrínsecas
Ciertas actividades enzimáticas de los microorganismos pueden resultar en un daño
hacia el individuo. La intensa deconjugación de sales biliares, la degradación del mucus
intestinal, la agregación plaquetaria y la colonización de válvulas cardíacas son algunos
ejemplos que podemos citar, los cuales pueden ser evaluados por estudios “in vitro” (8). Con
respecto a la degradación del mucus, una microflora estable con un patrón normal de
fermentación, residencia constante y bajo pH son importantes para la protección del mucus
frente a diversas injurias. Aquellas cepas incapaces de degradarlo, o a sus glicoproteínas, se
consideran no invasivas; sin embargo, es importante aclarar que ciertas cepas comerciales
(Lact. rhamnosus GG, Lact. acidophilus y Bifidobacterium bifidum) no poseen la capacidad
de degradar el mismo, pero tienen muy buena capacidad de adherencia a mucosas, propiedad
importante para su uso como probióticos (11). Por otro lado, no se puede asegurar que la
aparición de los efectos indeseados mencionados anteriormente, sea consecuencia del
consumo de alimentos formulados con bacterias probióticas ya que hasta el momento no
existen estudios que confirmen esta relación causa-efecto (8).
2. Estudios sobre la farmacocinética.
La farmacocinética de las bacterias probióticas puede ser medida en estudios “in vivo”
empleando técnicas de entubación o biopsia intestinal que permiten la recolección de material
70
Introducción
del lugar y estudiar la presencia y/o permanencia del probiótico.
La sobrevida de estas bacterias a lo largo de las distintas porciones del TGI humano
no es la misma para todas las cepas, ya que algunas mueren rápidamente al llegar al estómago
mientras que otras, como las bifidobacterias, logran arribar al intestino con mayor éxito.
El uso de marcadores de tránsito gastrointestinal es muy útil para determinar las
propiedades de colonización comparando la cinética de la misma con la del marcador.
Estudios “in vitro” de la resistencia a las secreciones gástrica y biliar (entre otros) nos
permiten predecir el destino de estos microorganismos y su tránsito a través del TGI humano.
3. Estudios sobre interacción cepa-huésped.
Valiéndonos de estudios “in vitro” como “in vivo”, pueden evaluarse propiedades
bacterianas como la invasión a la mucosa y sus interacciones con la célula huésped. En este
aspecto, ha demostrado ser de gran utilidad recurrir a trabajos de investigación
epidemiológica con grupos poblacionales como así también con grupos de individuos
voluntarios sanos o enfermos con distintos tipos de desordenes de origen intestinal y no
intestinal (8).
Hasta el momento son escasos los lineamientos sobre cómo llevar a cabo estudios
acerca de la seguridad en el uso de las bacterias probióticas. Sólo se manejan
recomendaciones de organismos oficiales internacionales y de grupos de investigadores de
reconocida trayectoria en esta área de la microbiología de productos lácteos (3).
Existen actualmente unos pocos estudios en humanos (relativamente bien diseñados y
conducidos) para evaluar el efecto producido por la ingesta de probióticos. También es
71
Introducción
sabido, que los efectos reportados en dichos estudios son cepa dependientes, y aún existiendo
leves diferencias entre las propiedades de las cepas, éstas influyen marcadamente en los
efectos nutricionales y clínicos. Esto hace que sea de gran importancia el chequeo de las
cepas, individualmente o incorporadas a los productos formulados, para lograr las propiedades
funcionales deseadas (11).
A pesar de las contínuas y numerosas promesas, existen ciertos principios claves en el
desarrollo y el marketing de los productos probióticos que necesitan ser tratados, como los
que se detallan a continuación:
 Identificación de biomarcadores fisiológicamente relevantes, los cuales pueden
ser usados para evaluar parámetros de efectividad probiótica en humanos (cepas, dosis,
crecimiento bacteriano, condiciones de producción etc.).
 Definición de principios activos.
 Parámetros de estabilidad para dichos principios activos.
 Resolución de la taxonomía de las especies probióticas y el desarrollo de
métodos confiables y prácticos para evaluar la especiación.
 Aporte científico en la formulación de nuevos productos.
 Estudios humanos epidemiológicos convenientemente controlados para
confirmar la eficacia probiótica.
Los principios microbiológicos y regulatorios involucrados en el surgimiento de
productos probióticos al mercado son vastos y diversos. Futuros descubrimientos ayudarán a
72
Introducción
clarificar cómo y de qué manera cepas específicas probióticas influencian la salud humana.
Una mayor dedicación por parte de los organismos gubernamentales en conjunto con la
industria y las instituciones académicas simplificarán y darán los principios regulatorios de
denominación y del marketing, a nivel mundial, de los productos probióticos. El consumidor
se beneficiará a partir de estos desarrollos con productos más eficaces y mejor categorizados
(3).
73
Introducción
Objetivos
Debido a la importancia cada vez mayor que se está atribuyendo a los Alimentos
Funcionales, y especialmente a los Probióticos, en la dieta del ser humano y como
consecuencia de la emergente necesidad de contar con nuevas cepas de microorganismos
capaces de ofrecer adecuadas propiedades probióticas - tecnológicas, en el presente estudio se
propuso:
 Aislar e identificar (fenotípica y genotípicamente) lactobacilos de orígen intestinal
humano para ser utilizados como potenciales probióticos.
En base a este propósito general, se plantearon los siguientes objetivos particulares:
 Actualización bibliográfica
 Selección y puesta a punto de métodos analíticos para la identificación y el estudio
de propiedades probióticas y tecnológicas. Proponer un esquema analítico que permita una
valoración integral de cepas para aplicaciones comerciales.
 Estudio de la resistencia de los aislamientos a las barreras biológicas del tracto
gastrointestinal humano (secreción gástrica y bilis).
 Estudio del potencial probiótico de los aislamientos: deconjugación de ácidos
biliares, actividad de -galactosidasa (lactasa), hidrofobicidad, inhibición del desarrollo de
bacterias patógenas (Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytógenes y
Staphylococcus aureus).
 Caracterización tecnológica de los aislamientos: resistencia al pH, sobrevida en
leche acidificada a 5ºC, resistencia a compuestos de aroma y sales, interacciones entre los
75
Objetivos
aislamientos intestinales y bacterias lácticas de starters (Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, Streptococcus thermophilus y Lactococcus lactis).
Los resultados obtenidos significarán un importante aporte de conocimientos sobre el
tema, brindando nuevas cepas, caracterizadas probiótica y tecnológicamente.
76
Materiales y Métodos
3.1 Muestras.
Se programó la búsqueda de muestras de materia fecal provenientes de bebés, sobre la
base de los siguientes requisitos:
 Nacimiento: parto natural
 Alimentación: lactancia materna
 Tiempo de vida: 30-90 días.
La finalidad de fijar estos requisitos, fue obtener la mayor recuperación posible de
aislamientos de géneros de interés (Lactobacillus y eventualmente Bifidobacterium) (4,8).
Bajo este esquema de trabajo, se muestrearon ocho bebés de la ciudad de Santa Fe,
para lo cual se entregó a las madres de éstos el siguiente material:
 1 frasco colector estéril conteniendo aproximadamente 30 ml de medio de
transporte Stuart estéril (ver Anexo) y rotulado:
Individuo Nº - Fecha
 1 cucharita descartable esterilizada con una solución de alcohol etílico 90º,
colocada en una bolsa plástica para su uso y posterior descarte.
Se indicó a cada madre el procedimiento correcto de muestreo, entregándoles el
siguiente instructivo:
1. Tomar el pañal del bebé con deposición espontánea de materia fecal.
78
2. Aflojar la tapa del frasco colector, retirar la cucharita descartable de la bolsa y
tomar con ella dos cucharaditas de la materia fecal y depositarlas en el frasco colector.
3. Cerrar bien el frasco colector, dejar a temperatura ambiente hasta su envío a
laboratorio (lo antes posible).
El frasco colector fue previamente tarado, luego de colocarle el medio de transporte
fue nuevamente tarado y por diferencia de peso se calculó la masa en g de medio de transporte
mediante el siguiente cálculo:
Pt – Pv = g de medio de transporte
Donde:
Pt: peso en g del colector con medio de transporte Stuart
Pv: peso en g del colector estéril vacío
A su arribo al laboratorio, el colector conteniendo el medio de transporte y la materia
fecal fue nuevamente pesado. Por diferencia de peso se calcularon los gramos de materia fecal
recolectados:
Pmf – Pt = g de materia fecal
Donde:
Pmf: peso en g del colector con medio de transporte y materia fecal.
79
3.2 Aislamiento y conservación de bacterias intestinales.
3.2.1 Aislamiento y purificación de cepas.
Partiendo del peso de materia fecal y del medio de transporte, y por cálculo de su
cociente (g de materia fecal/g de medio de transporte), se pudo estimar la dilución de la
muestra en el medio a la que llamamos “dilución madre”. A partir de la misma, se hicieron
sucesivas diluciones decimales con agua de peptona 0.1% (p/v) (ver Anexo) hasta alcanzar la
dilución 10-8.
Para el aislamiento y purificación de bacterias, se empleó la técnica de siembra en
superficie en medio sólido.
Debido a que la materia fecal es una muestra con un gran número y diversidad de
microorganismos, se utilizó un medio recomendado por el Manual de Bergey (9), que permite
la recuperación de las bacterias de interés (entre otras) respondiendo a sus complejos
requerimientos nutricionales.
El medio de cultivo seleccionado para el aislamiento fue el agar MRS (ver Anexo).
Una vez esterilizado, fue distribuido en placas de Petri estériles, y éstas fueron
llevadas a gabinete de aire estéril donde se dejaron solidificar y secar antes de su uso.
Posteriormente se rotularon las placas con los siguientes datos:
Individuo Nº - Dilución - Fecha
Se procedió a la siembra en superficie y por duplicado, descargando 0.1 ml de las
80
diluciones 10-5, 10-6, 10-7 y 10-8 de las muestras sobre el medio agarizado. Trabajando entre
mecheros, se espatuló con espátula de vidrio esterilizada a la llama, hasta lograr la absorción
completa en el medio.
Las placas se incubaron a 37ºC durante 48-72 h, una serie en aerobiosis y la otra, en
anaerobiosis (sistema anaeróbico Gas Pack).
Transcurrido el período de incubación, se seleccionaron aquellas placas de la dilución
que permitió aislar entre 10 y 20 colonias por placa. Se tomaron con ansa hojal esterilizada a
la llama, de 4 a 8 colonias por placa (dependiendo del número total de colonias en la placa,
de manera de que sea representativo), se les asignó un número a cada una de ellas para su
identificación y se realizó la observación microscópica directa de las mismas (preparados de
gota fresca) en inmersión, contraste de fases y aumento de 1000 x.
En función de las observaciones microscópicas, se dejaron para su posterior estudio
aquellas colonias integradas por bacilos, y se descartaron las formadas por cocos, bacilos
esporulados o cualquier otro tipo de microorganismo que no respondiera a la morfología de
los géneros de interés.
Las colonias seleccionadas fueron suspendidas con palillos de madera estériles en
tubos con 5 ml de caldo MRS estéril (ver Anexo).
Se le asignó una denominación a cada colonia estudiada y su posterior repique a caldo,
con la letra “F” y un número siguiendo el orden cronológico de hallazgo.
El procedimiento fue el mismo tanto para las colonias desarrolladas en aerobiosis
como anaerobiosis.
Se incubaron los repiques en caldo a 37 ºC durante 24-48h respetando las mismas
atmósferas de las que provenían.
81
La incubación en anaerobiosis se realizó con la finalidad de recuperar eventuales
microorganismos anaerobios estrictos (Bifidobacterium).
Una vez desarrollados los caldos, se realizaron las observaciones microscópicas
directas para constatar la presencia de bacilos regulares o irregulares (solos o acompañados de
otro tipo de células), y se procedió a estriar en la superficie de placas de agar MRS. Se
incubaron las placas sembradas a 37ºC durante 48 h, en aerobiosis o anaerobiosis, según
correspondiera.
Todo el procedimiento aplicado desde la siembra en placa y su paso a caldo fue
repetido dos veces, con la finalidad de obtener aislamientos puros.
El esquema de aislamiento y purificación de cepas que se aplicó a las muestras se
detalla en la Figura 2.
3.2.2 Conservación de los aislamientos.
Los aislamientos fueron conservados por congelamiento a –20ºC y a –80ºC, utilizando
como medio crioprotector caldo MRS adicionado de glicerol (15% v/v) (ver Anexo), el cual
permite mantener fluidas las membranas celulares bajo dichas condiciones.
En función del número total de aislamientos obtenidos, se preparó un volumen
adecuado de caldo MRS-glicerol, se esterilizó y se fraccionó (1 ml) en crioviales estériles.
Partiendo del cultivo de la cepa en caldo MRS (over night), se inoculó con 100 l de
éste, 1 ml de medio crioprotector, por duplicado y para ambas temperaturas de
congelamiento, rotulando en cada criovial la denominación de la cepa, la fecha y la
temperatura a la cual fue conservada.
82
Materia Fecal+Medio 1º Siembra agar MRS Observación microscópica 1º Siembra caldo MRS
Stuart (dilución madre dilución Incubación (48 h-37ºC) directa de colonias. Incubación (24h-37ºC)
aprox 10-1) hasta 10-8 Selección de bacilos.
Observación microscópica 2º Siembra agar MRS Observación microscópica

directa del caldo. Incubación (48 h-37ºC) directa de colonias. 2º Siembra caldo MRS
Selección de bacilos. Selección de bacilos. Incubación (24h-37ºC)
Observación microscópica 3º Siembra agar MRS Observación microscópica

3º Siembra caldo MRS
directa del caldo. Incubación (48 h-37ºC) directa de colonias.
Incubación (24h-37ºC)
Selección de bacilos. Selección de bacilos.
Observación microscópica
AISLAMIENTO directa del caldo.
PURIFICADO Confirmación de pureza.
Fig. 2- Esquema utilizado para el aislamiento y purificación de bacilos intestinales a partir de muestras de materia fecal de bebés.
De esta manera, las bacterias intestinales aisladas y purificadas en el presente trabajo
quedaron integradas al cepario de microorganismos existente en el PROLAIN.
3.3 Identificación de las cepas.
3.3.1 Reactivación y mantenimiento de las cepas para su utilización.
Uno de los duplicados de cada cepa conservada a –20ºC (cepario PROLAIN) fue
reactivada adicionando la totalidad del contenido del criovial a 5 ml de caldo MRS estéril e
incubadas a 37ºC durante 24h en aerobiosis. A partir de este momento, se manipularon las
cepas siempre bajo condiciones de aerobiosis debido a que no se detectaron bacilos
anaerobios estrictos.
Una vez desarrollado el caldo, se inoculó con éste otros 5 ml de caldo MRS estéril y se
incubó respetando las mismas condiciones antes mencionadas.
Al realizar estos dos repiques sucesivos, se obtuvo un cultivo en fase de crecimiento
exponencial (over night) apropiado para proceder con los distintos estudios que se plantearon
para su identificación, resistencia a barreras biológicas, capacidad probiótica y caracterización
tecnológica.
84
3.3.2 Características fenotípicas.
Movilidad, morfología y agrupación celular: a partir de un cultivo de cada
cepa en caldo MRS (over night), se realizó la observación microscópica directa con
inmersión, usando contraste de fases y aumento 1000 x, registrando los siguientes datos:
presencia o ausencia de movilidad, morfología celular (bacilos o cocobacilos), tamaño celular
(cortos, medianos o largos) y agrupación celular (sueltos, de a pares, en cadenas largas o
cortas, en cadenas lineales o curvadas).
Coloración de Gram: a partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over
night), se tomaron varias ansadas (con ansa hojal previamente esterilizada) y se distribuyó el
material sobre un porta objetos bien limpio para hacer un extendido celular. Se dejó secar al
aire y se fijó pasándolo tres veces por la llama. Luego se realizó la tinción de Gram según el
instructivo que se adjunta en el kit comercial (Britania).
Catalasa: para determinar la presencia de la enzima catalasa, se colocó una gota del
cultivo líquido de la cepa sobre un porta objetos bien limpio, se adicionó una gota de agua
oxigenada al 3% (Anedra) y se cubrió con un porta objetos. Se observó macroscópicamente el
desprendimiento de burbujas como consecuencia de la reacción química catalizada por la
catalasa:
H2O2 + ½ O2 H2O + O2 (g)

Catalasa
85
Se utilizó como control positivo de catalasa, un cultivo de Escherichia coli V517

(cepario del PROLAIN).
Crecimiento en leche: para evaluar la capacidad de desarrollo en leche, se partió
de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night) y se inocularon al 2% (v/v) 10 ml de
leche descremada reconstituida estéril al 10%(p/v)(ver Anexo).
Se incubaron los tubos de leche inoculados a 37ºC en aerobiosis. Se realizaron
observaciones a las 24, 48 h y hasta 14 días de incubación. La capacidad de desarrollo en
leche se manifestó como coagulación de la misma bajo las condiciones de cultivo utilizadas.
3.3.3 Quimismo fermentativo: Homofermentación/Heterofermentación.
Se preparó y esterilizó el medio semisólido de Gibson (18) a partir de sus
componentes individuales (ver Anexo). El medio se conservó a temperatura de refrigeración
hasta su uso.
Para su utilización los tubos se fundieron a baño maría y se mantuvieron a 45ºC hasta
su inoculación. A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se sembraron
(0.5 ml) 10 ml de medio Gibson. Como control positivo de heterofermentación se utilizó un
cultivo de Escherichia coli V517.
Los tubos inoculados se enfriaron rápidamente dejándolos en un baño de agua-hielo
hasta que solidificara el medio. Se incubaron a 37ºC por un período máximo de 14 días.
86
Interpretación de los resultados:
Se realizaron observaciones cada 24 h interpretándose los resultados de la siguiente
manera:
Metabolismo Heterofermentante: la producción de CO2 (a partir de la glucosa) por
la bacteria produce “rajaduras” o rotura del medio.
Metabolismo Homofermentante: no se producen cambios en el medio.
3.3.4 Perfil de Fermentación de Carbohidratos.
Se empleó el medio líquido API 50 CHL preparándolo a partir de sus componentes
individuales (ver Anexo). Se fraccionó en quince erlenmeyers colocando 90 ml en cada uno
de ellos y luego se esterilizó (15 min. a 121ºC).
Paralelamente, se prepararon soluciones al 10%(p/v) de los siguientes carbohidratos:
Arabinosa, Celobiosa, Glucosa, Gluconato, Maltosa, Manitol, Manosa, Melezitosa, Melibiosa,
Rafinosa, Ribosa, Trehalosa, Almidón y Xilosa. Estas soluciones se esterilizaron por filtración
(filtros Millipore de 0.45 m).
Se adicionó a cada fracción de 90 ml de medio API, 10 ml de la solución de azúcar de
manera de obtener una concentración de azúcar en el medio del 1%(p/v), rotulando cada
erlenmeyer con el nombre del azúcar que contenía. Luego se distribuyeron las quince
soluciones de API-azúcar resultantes en tubos de hemólisis estériles, colocando 3 ml en cada
uno de ellos, rotulándolos según el azúcar correspondiente.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se inoculó al 2% una
batería de tubos conteniendo los quince azúcares a ensayar. A todos los tubos se les adicionó
87
una pequeña capa de vaselina estéril para provocar un ambiente microaerofílico en el medio
líquido. Se incubó a 37ºC durante 72 h en aerobiosis. En estas condiciones, si no se lleva a
cabo la fermentación del azúcar por parte de la cepa, no se produce acidificación del medio y
por tanto éste conserva su color violeta típico. Como consecuencia de la fermentación del
azúcar se producen ácidos orgánicos, principalmente ácido láctico, lo cual lleva al descenso
del pH con lo que el púrpura de bromocresol vira de violeta a amarillo pasando por diferentes
tonos, según el grado de acidificación del medio.
Para informar el resultado del Perfil de Fermentación de Carbohidratos se fijaron los
siguientes criterios:
Color Fermentación Resultados
Violeta a las 72 h Ausencia -
Verde-amarillento a las 72 h Fermentación débil +/-
Amarillo a las 48h Fermentación moderada +
Amarillo a las 24 h Fermentación intensa ++
La Glucosa se empleó como control positivo de fermentación (++).
88
Los resultados obtenidos, se compararon con los correspondientes patrones de
fermentación según el Manual de Bergey (8va edición) para las distintas especies de
lactobacilos y bifidobacterias y con un patrón simplificado realizado en base al mismo (ver
Anexo Tabla 22 y 23). De esta manera se asignó a cada cepa género y especie.
3.3.5 Desarrollo en medios selectivos (Método Ecométrico).
Para confirmar la identificación previa, se aplicó el Método Ecométrico (19)
evaluando la capacidad de desarrollo de las cepas en tres medios de cultivo selectivos,
previamente testeados para lactobacilos intestinales (17). Es un método semicuantitativo que
evalúa la selectividad y productividad de medios de cultivo sólidos.
Se utilizaron los siguientes medios de cultivo: agar MRS (medio no selectivo) el cual
se tomó como control de crecimiento ya que todos los lactobacilos crecen en él; agar MRS-
Bilis (medio selectivo) (ver Anexo) donde desarrollan los del grupo Lactobacillus acidophilus
y Lactobacillus casei, y agar MRS-LP (medio selectivo) (ver Anexo) donde desarrolla
Lactobacillus casei pero se inhibe Lactobacillus acidophilus.
Una vez esterilizados los tres medios de cultivo, se distribuyeron en placas de Petri
estériles, se dejaron solidificar y se secaron en gabinete de aire estéril durante 30 min. Luego
se marcó sobre la base de cada placa cuatro cuadrantes enumerándolos de 1a 4, rotulando el
nombre del medio de cultivo.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se efectuó con ansa
89
ojal calibrada estéril cinco estrías en cada uno de los cuadrantes (siguiendo el orden numérico
de los mismos) y una estría central final, sin recargar ni flamear el ansa entre estría y estría.
Se procedió con la misma operatoria para los tres medios de cultivo empleados. Se incubaron
las placas a 37ºC durante 48 a 72h. Para favorecer el desarrollo de las bacterias lácticas se
incubaron en anaerobiosis por combustión.
Al cabo de dicha incubación, se realizó la observación del desarrollo de las estrías y se
calculó el índice de crecimiento para cada uno de ellos.
Cálculo del índice de crecimiento absoluto (ICA):
A cada estría desarrollada se le asignó un valor de 0.2 (precisión del método). Este
valor se multiplica por el número de estrías en las que se observó crecimiento; por ejemplo si
presentan desarrollo completo las cinco estrías del mismo cuadrante, el valor es 1. Cuando se
presenta desarrollo completo en las cinco estrías y en la central, el ICA es igual a 5.
Así, el ICA será igual a n (número del cuadrante) cuando todas las estrías del
cuadrante n y de los cuadrantes anteriores muestran un crecimiento completo, mientras
virtualmente no se observa desarrollo en ninguna de las estrías del cuadrante n+1.
Cuando aproximadamente la mitad de las estrías del cuadrante n muestran desarrollo,
mientras virtualmente no hay desarrollo en el cuadrante n+1 y en el cuadrante n-1 se obtiene
un desarrollo completo o casi completo, el ICA es igual a n-0.5.
Interpretación de resultados:
Cuando un microorganismo no desarrolla en un medio de cultivo (medio selectivo) el
ICA en el medio debe ser  2 y cuando el microorganismo desarrolla en el medio de cultivo
90
(medio no selectivo) el ICA debe ser  2.5. Los resultados se expresan como + o –
estableciendo el siguiente criterio de equivalencia:
 cuando el ICA es  2.5 se considera +
 cuando el ICA es  2.0 se considera -
3.4 Diversidad genética de los lactobacilos intestinales (perfiles

RAPD).
Para estudiar el polimorfismo genético de los aislamientos, se estudiaron 19
aislamientos de lactobacilos intestinales por la técnica RAPD-PCR en la Unité de Recherches
Laitières et Genetiqueé Apliqueé del INRA Jouy en Josas (Francia), según el siguiente
esquema:
Extracción del ADN total:
Se centrifugó un cultivo en fase estacionaria de la cepa y el pellet de células se
resuspendió en buffer TS (Tris-ClH 50 mM pH 8, sacarosa 0.25M), conteniendo lisozima
(20mg/ml) para lisar la pared celular. Se incubó 1 h en baño termostatizado a 37ºC y se
adicionó SDS 0.1% (v/v) a partir de una solución al 20%, agitando la mezcla. Se hicieron
extracciones con fenol-cloroformo y cloroformo-alcohol isoamílico recuperando el
sobrenadante de cada extracción. El ADN se precipitó con isopropanol a -20ºC durante 20- 30
min. y el precipitado se lavó con etanol 70% y se separó por centrifugación. El ADN se secó y
91
resuspendió en buffer TE (Tris-HCl 10mM pH 8, EDTA 1 mM) conteniendo RNAsa (2ug/ml)
y se incubó a 37ºC durante 10 a 15 min. para eliminar restos de RNA.
La preparación de ADN se examinó sobre geles de agarosa 0.7% a 0.8% en buffer
TAE (Tris-acetato 0.04 M, pH 8 y EDTA 1mM) conteniendo bromuro de etidio. Los geles
fueron observados y fotografiados en un transiluminador de luz UV para controlar su calidad
y concentración (20,21).
RAPD (Randomly Amplified Polimorphic DNA Fingerprinting):
De 20 a 100 g de ADN se suspendieron en 100 l de buffer Tris HCl 10 mM (pH 9 a
25ºC), conteniendo MgCl2 1.5 mM, 0.5 M del primer (Bioprobe), 2.5 unidades Taq
Polimerasa (Ampli Taq, Apligène) y 200 M de cada uno de los nucleótidos: dATP, dCTP,
dGTP y dTTP (Boehringer Mannheim). Se usaron secuencialmente los siguientes primers:
B06 (5’-TGCTCTGCCC-3’), B08 (5’-GTGACGCAG-3’) y B10 (5’-CTGCTGGGAC-3’)
(Eurogentec, France) en tres amplificaciones PCR diferentes. Dichas amplificaciones se
realizaron en un termociclador Perkin Elmer, modelo 9600, siguiendo 30 ciclos de
amplificación (94ºC-1 min.;36ºC- 2 min. y 72ºC-2 min.). Después de la amplificación, 20 l
del producto se sometieron a electroforesis en gel de agarosa SEAKEM GTG 1%. Los
fragmentos amplificados fueron detectados después de la coloración de los geles en una
solución de bromuro de etidio. En cada gel se incluyó un marker de tamaño: 123bp DNA-
Ladder (Gibco-BRL). Los geles se fotografiaron en un transiluminador de luz UV y los
negativos se procesaron con un “scanner”. Las imágenes fueron tratadas utilizando el
programa Gel Compare (Applied Maths, Belgique) y los perfiles de las cepas fueron
92
reagrupados a través del método UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic
Average) originando el dendrograma correspondiente (20).
3.5 Resistencia a las Barreras Biológicas.
3.5.1 Resistencia a la secreción gástrica.
Para determinar la tolerancia a la exposición de una simulación de jugos gástricos, se
empleó el método de Charteris y col. (13).
Fundamento:
Al exponer las cepas aisladas a una solución gástrica constituida de ClH/NaCl –
pepsina a pH 3 a una temperatura de 37ºC, se pretende “simular” el arribo de estos
microorganismos al estómago luego de la ingesta y su exposición con los jugos gástricos
secretados en el proceso de la digestión. Se busca de esta manera, evaluar durante y al cabo de
tres horas de tratamiento como afecta esta solución la viabilidad de los bacilos y así estimar
qué proporción de ellos arribarán viables al intestino.
Se preparó una solución “gástrica” a partir de una solución de pepsina 3g% (p/v) y de
una solución de NaCl 0.5g% (p/v) en agua acidulada con ácido HCl a pH 3. Por un lado se
esterilizó la solución HCl/NaCl (pH3) y, por otro lado, se preparó la solución de pepsina 3g%
(p/v) y se ajustó el pH a 3. Ésta última se esterilizó por filtración.
93
En un erlenmeyer de adecuada capacidad se mezclaron nueve partes de la solución
HCl/NaCl y una parte de la solución de pepsina. De esta manera quedó preparada la solución
gástrica, que se conservó en refrigeración hasta su uso.
Se preparó buffer fosfato de potasio pH 6.5 (ver Anexo), el cual una vez esterilizado
también se conservó en refrigeración hasta su posterior uso.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), previa
homogeneización en vortex, se tomó 1 ml (procediendo por duplicado para cada cepa) y se
colocó, trabajando bajo condiciones de esterilidad, en tubos eppendorf estériles rotulados. Se
centrifugaron los tubos a 10.000 rpm durante 3 min a 5ºC. Se resuspendieron y lavaron los
“pellets” celulares obtenidos dos veces con el buffer estéril.
Finalmente se obtuvieron dos “pellets” celulares por cepa (duplicados): a uno de ellos
se le adicionó 1 ml de buffer, y se resuspendió y homogeneizó en vortex. Al otro, se le
adicionó 1 ml de la solución gástrica procediendo igual que para la suspensión en buffer.
Luego, se adicionaron 9 ml de buffer y 9 ml de solución gástrica, respectivamente.
Quedaron así, establecidas las diluciones madres (o iniciales) de las cepas en buffer y
solución gástrica. A partir de las mismas, se realizaron diluciones decimales empleando el
mismo buffer.
Ambos tubos por cepa, rotulados con la denominación de la misma y SG o C (SG,
solución gástrica y C, control en buffer) se incubaron en baño de agua termostatizado a 37ºC
durante 3 h.
Se preparó, esterilizó y fraccionó en placas de Petri estériles agar Plate Count (PCA)
(ver Anexo) dejándolas solidificar y secar aproximadamente durante 1 h bajo gabinete de aire
estéril.
94
Se realizaron siembras en superficie, espatulando 0.1 ml de las diluciones 10-6 y 10-7
para los controles (C) y para las cepas tratadas con la solución gástrica (SG) se fueron
probando varias diluciones, desde 10-1 hasta 10-6, ya que no se podía estimar la resistencia de
las cepas al “stress” provocado por el tratamiento.
Se sembró a tiempo cero y al cabo de las 3h, tanto para las cepas C como para SG. Se
incubaron las placas a 37ºC durante 72h en anaerobiosis por combustión.
Comparando los valores de recuento de células viables (SG) al cabo de tres horas de
tratamiento con los valores iniciales (SG t0) y calculando la diferencia entre ambos, fue
obtenida la pérdida de viabilidad de las bacterias, la cual es inversamente proporcional a la
resistencia de las mismas a la secreción gástrica. Los controles se realizaron con la finalidad
de descartar otra causa de muerte celular que no fuera por la acidez gástrica. Los resultados se
expresaron como la reducción de ordenes logarítmicos de los recuentos celulares (SG) para
cada cepa con respecto a su control.
3.5.2 Cinética de muerte celular de los aislamientos en solución

gástrica.
Aplicando la metodología antes descripta, se determinó la cinética de muerte celular
durante el tratamiento de las cepas con la solución gástrica.
Se seleccionaron para estos experimentos, las cepas F37, F37’, F37’a, F64 y F83, en
95
función de los resultados obtenidos en 3.5.1.
Paralelamente se emplearon cepas de origen comercial de Lactobacillus acidophilus
(La5) y Lactobacillus casei (A13) (pertenecientes al cepario del PROLAIN). Para estas cepas,
se realizaron los recuentos de células viables a los siguientes tiempos de tratamiento:
 T0 (0 min. de tratamiento)
 T0.5 (30 min.)
 T1 (1h)
 T2 (2h)
 T3 (3h)
Con los resultados obtenidos de los recuentos de células viables a los distintos tiempos
de tratamiento, se graficaron las cinéticas de muerte celular (log UFC/ml vs T) para cada una
de las cepas ensayadas. De esta manera se pudo estimar la velocidad con que se produce la
muerte celular al exponerse al medio acídico simulado del estómago.
3.5.3 Resistencia a la bilis.
Para este tipo de ensayo se empleó el Ensayo de Difusión en Agar (EDA) (22).
96
Fundamento:
El EDA permite detectar la presencia de agentes inhibidores del crecimiento de un
microorganismo que se encuentra inmerso en una pátina agarizada. En este caso se evaluó el
efecto de distintas concentraciones de bilis (contempladas dentro del rango normal fisiológico
en el ser humano) sobre el crecimiento de los lactobacilos intestinales. De esta manera se
pretendió simular el efecto producido por la secreción de bilis hacia el duodeno (que ocurre
seguidamente a la llegada del bolo alimenticio a esta porción del intestino) y evaluar la
viabilidad de estos microorganismos luego de su paso estresante por el estómago.
Se preparó agar MRS, se fraccionó en porciones de 20 ml, se esterilizó y se mantuvo
el medio de cultivo a 45ºC hasta su posterior uso.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se inoculó con 0.2 ml
del mismo el agar MRS acondicionado, se homogeneizó rápidamente la mezcla en vortex y se
volcó en una placa de Petri estéril, previamente rotulada. Una vez solidificado el medio, se
llevaron las placas a gabinete de aire estéril y se dejó secar durante 20 min. Procediendo de
esta manera, luego de la incubación desarrolla una “pátina” de crecimiento.
Una vez que se secó bien el medio, se realizaron en éste hoyos (10 mm de diámetro)
utilizando un sacabocados estéril. Sobre el fondo de cada placa se rotuló la denominación de
la cepa testeada y en cada hoyo, la concentración de bilis a ensayar.
A partir de soluciones de bilis estériles al 0.15%, 0.3%, 0.6% y 1.0%, se colocaron
180 l de cada una de ellas en los correspondientes hoyos. Se dejaron unos minutos las placas
en el gabinete de aire estéril para que la solución de bilis difunda en el medio y así evitar
derrames. Luego se taparon las placas y se incubaron a 37ºC durante 24h en aerobiosis.
97
Una vez finalizado el período de incubación, se observó presencia o ausencia de halos
de inhibición del crecimiento en el medio agarizado y en el caso de que los hubiere, se
midieron sus diámetros utilizando un calibre adecuado a tal fin.
Se clasificaron los halos en:
 Halos de inhibición total: zona totalmente translúcida en torno al hoyo
(ausencia de crecimiento).
 Halos de inhibición parcial: zona con una turbidez en torno al hoyo menos
intensa que la del resto de la pátina (débil crecimiento).
3.6 Caracterización probiótica de los aislamientos.
3.6.1 Deconjugación de ácidos biliares.
La capacidad de los lactobacilos de deconjugar sales biliares fue determinada de
acuerdo al método de Taranto y col. (23).
Fundamento:
Al hacer desarrollar los lactobacilos en agar MRS conteniendo un ácido biliar que se
encuentra soluble como sal sódica de conjugados de glicina o taurina, se producen ácidos
orgánicos como consecuencia de la fermentación de carbohidratos, los cuales descienden el
98
pH del medio. Paralelamente, si los lactobacilos poseen la enzima hidrolasa de sales biliares,
ésta deconjuga el ácido, el cual posee un pKa distinto y al encontrar un medio acidificado con
un pH que se aproxima al de su pKa se vuelve insoluble y precipita en el medio. La actividad
de deconjugación de ácidos biliares puede manifestarse de dos formas: como zonas blancas,
opacas, de precipitación en torno a las colonias del lactobacilo, o bien produciendo cambios
en el aspecto de las colonias (blancas y más opacas) sin halos de precipitación a su alrededor.
Esto último, sólo se observa con determinados ácidos biliares.
Se prepararon los siguientes medios de cultivo (ver Anexo):
Agar MRS-taurocolato de sodio (MRS-TC)
Agar MRS-taurodeoxicolato de sodio (MRS-TDC)
Agar MRS-glicolato de sodio (MRS-GC)
Agar MRS-glicodeoxicolato de sodio (MRS-GDC)
Los medios fueron formulados de manera tal que los ácidos biliares quedaron en una
concentración final de 0.5%.
Una vez esterilizados, se distribuyeron en cajas de Petri estériles dejándolas solidificar
y secar bajo gabinete de aire estéril. Hasta su posterior uso, las placas fueron conservadas en
anaerobiosis y refrigeración evitando de esta manera la oxidación de los ácidos biliares por
contacto con el oxígeno del aire.
Al momento de utilizarse, se realizaron radialmente en las placas 6 divisiones y se
rotuló cada una de ellas con la identificación de la cepa a inocular, además del ácido biliar
contenido en el medio.
99
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se estriaron los medios
adicionados de ácido biliar. Se estrió desde el borde de la placa hacia el centro en cada
división marcada (en cada división se inoculó una cepa distinta), descargando la mayor parte
del inóculo al principio y abriendo la estría hacia el centro y de manera de evitar
superposición de zonas de precipitación del ácido biliar en el medio entre una estría y la
adyacente. Se procedió de la misma manera para los restantes cuatro medios de cultivo.
Finalmente las placas fueron incubadas a 37ºC durante 48h en anaerobiosis.
La actividad de deconjugación de sales biliares, adjudicada a la enzima hidrolasa de
ácidos biliares conjugados provoca, como ya se dijo, la precipitación en el medio de los
ácidos biliares deconjugados que se observa como zonas blancas de distinta intensidad en
torno a las colonias formadas. Además de observar precipitación del ácido biliar en el medio,
también se tuvo en cuenta si dicho ácido afectaba de alguna manera el crecimiento de la cepa.
3.6.2 Actividad de -galactosidasa (lactasa).
Para determinar la actividad de -galactosidasa en las células íntegras de los
lactobacilos se empleó el método de Miller (24) con algunas modificaciones, que se detallan
a continuación.
100
Fundamento:
Si se emplea como medio de cultivo un caldo donde la lactosa es el único sustrato
limitante de carbono y energía para el crecimiento celular y para la producción de ácido, la
enzima -galactosidasa debe estar presente para asegurar el crecimiento del microorganismo.
Esta enzima hidroliza la lactosa en dos monosacáridos: glucosa y galactosa. El método de
Miller se basa en una técnica colorimétrica que emplea el ONPG (orto-nitro fenil
galactopiranósido) como único sustrato para la enzima, la cual lo hidroliza y libera ONP
(orto- nitro fenilo) de color amarillo, que se mide a través de la absorbancia (A) a 420 nm.
Como la reacción enzimática es estequiométricamente proporcional sustrato a producto, la
cantidad de ONP liberado nos permite calcular la cantidad de enzima presente en el medio de
reacción (en este caso, de las células).
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se trasvasaron 5 ml del
mismo a tubos de centrífuga estériles y rotulados convenientemente, que se centrifugaron a
6000 rpm durante 10 min. a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y el pellet
celular se resuspendió y lavó dos veces con buffer fosfato de potasio estéril. Finalmente, se
obtuvo una suspensión de la cepa en buffer (volumen final de 5 ml). A partir del mismo, se
hizo un inóculo al 2% en tubos conteniendo 3 ml de caldo MRS base-lactosa (ver Anexo). Se
dejó un caldo sin inocular para ser utilizado posteriormente como blanco de lectura.
Todos los tubos inoculados y rotulados con la cepa correspondiente, fueron incubados
a 37ºC durante 24h en aerobiosis.
Posteriormente, se midió la densidad óptica (D.O.) de los cultivos crecidos a 550 nm
frente a blanco de medio (valor A), utilizando para tal fin un Espectrofotómetro UV-Visible
(Metrolab 1700).
101
Se obtuvo un extracto celular para cada cepa, colocando 1ml de cada cultivo crecido
en caldo lactosado, en tubos eppendorf plásticos y centrifugándolos a 12.000 rpm durante 2
min. a 5ºC. El sobrenadante fue eliminado y el pellet de células se resuspendió y lavó dos
veces con buffer fosfato de potasio estéril.
Se resuspendió el pellet en 1 ml de buffer y se permeabilizaron las membranas
celulares mediante el agregado de 50 l de una mezcla de tolueno:acetona (ver Anexo).
Inmediatamente, se agitó a máxima velocidad en vortex durante 7 min. a temperatura
ambiente para facilitar la acción de la mezcla previamente adicionada, la cual produce
“poros” en las membranas, sin llegar a lisarlas.
La reacción de color que pone de manifiesto la presencia de la enzima lactasa se
realizó de la siguiente manera:
Se colocaron en tubos de hemólisis bien limpios y rotulados con la identificación de la
cepa:
 100 l del extracto celular permeabilizado + 900 l de buffer fosfato de potasio
pH 6.5 (valor B)
 200 l de una solución de ONPG (ver Anexo)
La mezcla fue inmediatamente incubada a 37ºC en baño de agua termostatizado, hasta
desarrollo de color amarillo (en nuestro caso se estandarizó dicho tiempo en 15 min., valor C).
Al cabo de dicho tiempo, se detuvo la reacción de color mediante el agregado de 0.5ml
de la solución stop de NaCO3 (106 g/l). Se homogeneizó y se dejó en baño de agua-hielo
hasta su lectura de A.
102
Paralelamente, se procesó el blanco de lectura de la misma manera que las muestras,
con la única diferencia de que no se adicionaron los 200 l de ONPG.
Se midieron los valores de A y D.O. para cada una de las muestras correspondientes a
las cepas ensayadas frente a blanco a 420 nm (valor D) y a 550 nm (valor E).
Se expresó la actividad de -galactosidasa en Unidades Miller (UM) mediante el
siguiente cálculo:
Actividad -galactosidasa (UM) = D - (1.75 x E) / (C x B x A) x 1000
Donde:
A es la D.O. del cultivo crecido inicial a 550 nm.
B es el volumen inicial del cultivo en la mezcla de reacción.
C es el tiempo de reacción en minutos.
D es la A correspondiente a la cantidad de ONP liberado a 420 nm.
E es la D.O. correspondiente a los deshechos celulares, que dan fondo a
550 nm.
A partir de los valores obtenidos de A a 420 nm y D.O. a 550 nm y su aplicación en la
fórmula antes descripta, se pudo obtener la actividad enzimática total de -galactosidasa
expresada en UM para la totalidad de los bacilos intestinales. De esta manera, la
determinación de la actividad enzimática incluyó tanto a la enzima presente en el citoplasma
103
como así también aquella asociada a la pared celular. Además, este ensayo sólo puede revelar
la presencia de la enzima -galactosidasa pero no la P-galactosidasa, la cual hidroliza la
lactosa 6-P (fosforilada por el sistema PEP-PTS asociado a la membrana celular) ya que el
sustrato de reacción no es en este caso el adecuado para la misma.
Lo expuesto anteriormente es importante para comprender que pueden existir cepas de
lactobacilos que pueden tener una u otra enzima y que se podría establecer una correlación
entre los lactobacilos que desarrollan y coagulan la leche cuando se los hace crecer en ésta,
independientemente de que posean o no la enzima -galactosidasa.
3.6.3 Hidrofobicidad.
Se empleó la metodología descripta por Kociubinski y col. (6) con ciertas
modificaciones, que se detallan a continuación.
Fundamento:
Se busca cuantificar la tendencia que poseen los bacilos intestinales de pasar de una
fase polar (buffer fosfato de potasio) a otra hidrofóbica (n-hexadecano u otro hidrocarburo) en
función de la hidrofobicidad superficial, asegurando un íntimo contacto entre ambas. Cuanto
mayor sea dicha hidrofobicidad, mayor cantidad de células pasarán a la fase orgánica.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), y trabajando en
gabinete de aire estéril, se trasvasaron los 5 ml de caldo a un tubo de centrífuga estéril y se
104
centrifugó a 6000 rpm durante 10 min. a temperatura ambiente.
Se descartó el sobrenadante y el pellet de células fue resuspendido y lavado dos veces
con buffer estéril. La suspensión celular así obtenida se diluyó con la misma solución tampón
hasta alcanzar una D.O. de 1 leída a 560 nm (D.O. inicial). A cada una de estas suspensiones
celulares, correspondientes a las distintas cepas, se les adicionó 600 l de n-hexadecano
(Merck). Seguidamente, se agitó vigorosamente en vortex durante 4 min. para asegurar un
íntimo contacto entre ambas fases y así favorecer el pasaje de células de una a otra.
Posteriormente, la mezcla se trasvasó a pequeños vasos de precipitado de boca ancha de
manera de facilitar la separación de las fases. Se dejó reposar durante 2h a temperatura
ambiente y luego con agujas y jeringas se tomó un volumen mínimo de 2 ml de la fase polar
(solución de buffer fosfato), realizándose 3 lecturas de D.O. a 560 nm (para promediar sus
valores) (D.O. final).
El porcentaje de Hidrofobicidad se calculó a través de la siguiente fórmula:
% Hidrofobicidad = [(DO final – DO inicial)/ DO inicial] x 100
Se confirmó el pasaje de los bacilos a la fase orgánica mediante la observación
microscópica de un preparado de gota fresca con el agregado del colorante orgánico Negro
Sudán para identificar mejor la fase no polar.
105
Esta determinación permitió “predecir” la capacidad de los bacilos estudiados para
adherirse a las microvellosidades que forman histológicamente la mucosa intestinal, la cual es
naturalmente hidrofóbica.
Debido a los escasos antecedentes bibliográficos en el tema, no se hallaron valores de
referencia de hidrofobicidad para Lactobacillus que permitieran clasificar las cepas en función
de este parámetro.
3.6.4 Inhibición de bacterias patógenas.
Se empleó el Ensayo de Difusión en Agar (EDA), anteriormente descripto.
Fundamento:
El fundamento del EDA fue previamente descripto para determinar la resistencia de
los lactobacilos a las secreciones biliares (ver 3.5.3). Pero en este caso, se buscó determinar la
presencia de agentes antimicrobianos en el sobrenadante libre de células (SLC) de los
lactobacilos que manifiesten algún efecto sobre el crecimiento de las bacterias patógenas más
relevantes como causantes de infecciones intestinales.
Las “pátinas”, en este caso, se realizaron con las bacterias patógenas (una por pátina),
todas ellas provenientes del cepario del PROLAIN, y fueron las siguientes:
106
 Staphylococcus aureus 76, coag. (+)
 Salmonella OMS-Ca
 Listeria monocytógenes ATCC 15313
 Escherichia coli V517
Las cepas se obtuvieron de stocks congelados (–20ºC), del cepario antes mencionado.
Por tanto, para su utilización fueron reactivadas en diferentes medios de cultivo ya que no
todas tienen los mismos requerimientos nutricionales.
La totalidad del contenido del criovial fue adicionado a 5 ml de caldo Triptona Soja
(TS) estéril (ver Anexo) para la reactivación de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
Salmonella. En el caso de Listeria monocytógenes, por ser una bacteria nutricionalmente más
exigente, se emplearon 5 ml de caldo BHI estéril (ver Anexo).
Una vez inoculados, los caldos fueron incubados a 37ºC durante 24h a 48h en
aerobiosis hasta observar un desarrollo evidente.
Para encontrar la proporción adecuada de volúmenes a mezclar para realizar las
pátinas, se ensayaron distintas alícuotas del cultivo over-nigth de las bacterias patógenas,
decidiéndose adoptar el siguiente procedimiento:
Escherichia coli
Salmonella 0.2 ml de cultivo (caldo TS) + 20 ml de agar Nutritivo  PÁTINA
Satphylococcus aureus (ver Anexo)
Listeria monocytógenes: 0.2 ml de cultivo (caldo BHI) + 20 ml de agar BHI  PATINA

(ver Anexo)
107
Posteriormente, se procedió de la misma manera como previamente fue descripto para
el EDA en cuanto a manipulación, secado, realización de hoyos etc.
En este caso, como se quiso evaluar el poder inhibitorio adjudicado a algún agente o
sustancia activa presente en el SLC de cultivos de los bacilos intestinales, en los hoyos se
colocaron dichos sobrenadantes.
Para la obtención de los sobrenadantes, se partió de cultivos de las cepas en 5 ml de
caldo MRS (over night) que fueron centrifugados a 10.000 rpm durante 3 min. a 5ºC. De esta
manera, los sobrenadantes obtenidos se distribuyeron en tubos eppendorf plásticos estériles
(de capacidad volumétrica de 2 ml aproximadamente), previamente rotulados con la
identificación de las cepas.
Se obtuvieron unos 2 ml de SLC por cada cepa, que se conservaron congelados a
-20ºC hasta su uso. Por cada pátina se practicaron siete hoyos solamente, para evitar
superposición de zonas de inhibición adyacentes en caso de que éstas fueran de considerable
tamaño.
Cada placa se rotuló sobre su fondo con la identificación de la bacteria patógena y en
cada hoyo, la del lactobacilo del cual se obtuvo el SLC. Se dejaron descongelar los SLC, a
temperatura ambiente, y luego se tomaron 180l, trabajando siempre bajo gabinete de aire
estéril, que se colocaron en el hoyo correspondiente a la cepa, en las placas sembradas con las
cuatro bacterias patógenas empleadas.
Se taparon las placas y después de dejarlas unos minutos en reposo para permitir que
el SLC difundiera en el medio agarizado, se llevaron a incubar a 37ºC durante 24h a 48h en
aerobiosis.
108
Finalizado el período de incubación, se observó presencia o ausencia de halos de
inhibición de crecimiento en la pátina. Se midieron los diámetros de los halos formados y
éstos se clasificaron de la siguiente manera:
 Halos de inhibición total: zona totalmente translúcida en torno al hoyo
(ausencia de crecimiento).
 Halos de inhibición parcial: zona con una turbidez en torno al hoyo menos
intensa que la del resto de la pátina (débil crecimiento).
3.7 Caracterización tecnológica de los aislamientos.
3.7.1 Resistencia al pH.
Para este estudio, se empleó el método cualitativo de Desarrollo en Medio Líquido
(DML).
Fundamento:
Aplicando el método de DML se pretende determinar si el pH del medio es un agente
inhibidor del desarrollo de los lactobacilos intestinales. Es una técnica análoga al EDA sólo
que en este caso se emplea un medio de cultivo líquido en lugar de un medio sólido. Los
valores de pH seleccionados corresponden al rango de pH que posee la mayoría de los

109
productos lácteos fermentados (4.5 a 5.5).
Se preparó y fraccionó caldo MRS en 3 erlenmeyers colocando 150 ml en cada uno de
ellos, que se rotularon de la siguiente manera: MRS pH 4.5, MRS pH 5.0, MRS pH 5.5.
Por otro lado se prepararon 100 ml de caldo MRS el cual se rotuló MRS Control.
Todos los caldos fueron esterilizados y en el caso del caldo Control, éste fue
fraccionado en tubos de hemólisis estériles que luego fueron utilizados como control (+) de
crecimiento. A los demás caldos, y trabajando siempre en gabinete de aire estéril, se les
adicionó ácido láctico concentrado (Anedra) hasta alcanzar los pH 4.5, 5.0 y 5.5 para cada
erlenmeyer, previamente rotulado. Se utilizó para esto un pHmetro Orion SA720. Los caldos
con diferentes pH se fraccionaron en porciones de 2.5 ml en tubos de hemólisis estériles,
rotulando los tubos con los valores de pH correspondientes y conservándolos a temperatura
de refrigeración hasta su uso.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se inocularon al 2%
con cada cepa los tubos conteniendo el caldo MRS pH 4.5, pH 5.0 y pH 5.5 (previamente
rotulados con la identificación de la cepa). Se dejó un tubo con caldo MRS sin inocular como
control (-) de desarrollo y como control (+) se utilizó un tubo con caldo MRS sin ajuste de pH
e inoculado con la cepa en cuestión.
Se incubaron todos los tubos a 37ºC durante 24 h y posteriormente se los observó para
determinar ausencia o presencia de crecimiento (turbidez del caldo) comparando con los
tubos controles.
110
A partir de la observación macroscópica, se realizó la siguiente clasificación
semicuantitativa:
Desarrollo Resultado
Ausencia de crecimiento (comparable al C (-)) Negativo (-)
Desarrollo débil (turbidez menor al C (+)) Débil (d)
Desarrollo abundante (turbidez comparable al C (+)) Positivo (+)
3.7.2 Resistencia a sales.
Se empleó el método cualitativo de Desarrollo en Medio Líquido (DML).
Fundamento: ver 3.7.1.
Se preparó caldo MRS adicionado de sales: NaCl y KCl, pesando el medio junto a las
sales de manera tal que la concentración de las mismas sea del 1%, 2% y 3% (p/v) para cada
una de ellas.
Una vez esterilizados, los caldos fueron distribuidos en tubos de hemólisis estériles y
rotulados convenientemente.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se inoculó en una
proporción del 2% los cuatro tubos conteniendo caldo MRS-NaCl 1%, MRS-NaCl 2%, MRS-
NaCl 3%, MRS-KCl 1%, MRS-KCl 2% y MRS-KCl 3%. Se rotularon los tubos con la
111
denominación de la cepa correspondiente y posteriormente se empleó la misma metodología
que se explicó para determinar la resistencia de los lactobacilos a distintos pH (ver 3.7.1) con
respecto a las condiciones de incubación, controles (+) y (-) e interpretación de resultados.
3.7.3 Resistencia a compuestos de aroma (diacetilo y acetaldehído).
Se empleó el método cualitativo de Desarrollo en Medio Líquido (DML).
Fundamento: ver 3.7.1.
Se preparó caldo MRS, distribuyéndolo en cuatro erlenmeyers y rotulándolo de la
siguiente manera:
 MRS-acetaldehído 1000 ppm
 MRS-acetaldehído 2500 ppm
 MRS-diacetilo 1000 ppm
 MRS-diacetilo 2500 ppm
Se adicionó al erlenmeyer correspondiente 102 l y 255 l de una solución de
diacetilo (Sigma) de manera de obtener una concentración de éste en el caldo de 1000 ppm y
2500 ppm en el caldo respectivamente. A los otros erlenmeyer se les adicionó 128 l y 319 l
de una solución de acetaldehído (Sigma) de manera de obtener una concentración de éste en el
112
caldo de 1000 ppm y 2500 ppm respectivamente.
Los cuatro caldos con sus correspondientes compuestos de aroma fueron distribuidos
en tubos de hemólisis estériles colocando en cada uno de ellos 2.5 ml y se rotuló cada tubo
con el compuesto de aroma que contenía y su concentración. No se conservaron en
refrigeración los caldos adicionados de estos compuestos ya que tanto el acetaldehído como el
diacetilo son muy inestables bajo estas condiciones y por este motivo se prepararon en el
momento de usar.
A partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se inocularon los
cuatro caldos en una proporción del 2%. Posteriormente, se empleó la misma metodología que
se utilizó para determinar la resistencia de los lactobacilos a distintos pH (ver 3.7.1), con
respecto a las condiciones de incubación, controles positivos y negativos e interpretación de
resultados.
3.7.4 Viabilidad celular de los aislamientos en leche acidificada y

conservada a 5ºC.
Para determinar la viabilidad de los lactobacilos en leche acidificada y conservada a
temperatura de refrigeración se empleó la técnica de recuento en placa de células viables (25)
luego de un período determinado de almacenamiento, comparándolo con el recuento de
partida.
113
Fundamento:
Al adicionar los lactobacilos en elevada concentración (108 UFC/ml) a leche
acidificada a pH 4 y 5 y evaluar al cabo de 30 días de almacenamiento a temperatura de
refrigeración la pérdida o no de viabilidad, se pretendió reproducir las condiciones
tecnológicas en las que estos microorganismos se encuentran en los productos lácteos
fermentados. A diferencia del estudio de la resistencia al pH (evaluación del desarrollo de los
lactobacilos en dichas condiciones), en este caso se pretende evaluar la sobrevida de los
lactobacilos a valores de pH similares a los de productos lácteos fermentados. Visto que los
resultados obtenidos para el estudio 3.7.1 indicaron que pH  5 no afectan el desarrollo de los
lactobacilos intestinales, la viabilidad en leche acidificada fue adicionalmente estudiada a pH
4.
Para conocer aproximadamente el volumen de ácido láctico que debería adicionarse a
la leche descremada estéril reconstituida al 10% para llevar su pH a valores de 4 y 5, se
realizó una experiencia previa con 200 ml de leche estéril a la cual se le fue adicionando ácido
láctico concentrado (Anedra), monitoreando el pH luego de cada adición. Así se obtuvo la
siguiente relación:
 Para alcanzar un pH 4 (en 200 ml de leche) se requirieron 0.64 ml de ácido
láctico.
 Para alcanzar un pH 5 (en 200 ml de leche) se requirieron 1.26 ml de ácido
láctico.
Teniendo en cuenta esta relación de volúmenes se ajustó el pH de 3 erlenmeyers
114
conteniendo leche estéril de la siguiente manera: a uno de ellos no se le practicó ajuste de pH
y se rotuló como leche control (C); al segundo se le adicionó un volumen algo inferior al
previamente calculado y monitoreando el pH en pHmetro se fue adicionando de a 100 l de
ácido láctico hasta ajustar el pH al valor de 5, agitando vigorosamente entre agregado y
agregado y trabajando bajo gabinete de aire estéril, rotulándolo como leche pH 5.
Finalmente, se procedió de la misma manera para el tercer erlenmeyer pero en este caso hasta
alcanzar el pH de 4 y se rotuló como leche pH 4. La leche control y acidificada se fraccionó
en tubos con tapa a rosca estériles de 12 ml de capacidad, colocando en cada uno de ellos 10
ml de manera de dejar un espacio de cabeza reducido. Todos los tubos fueron rotulados (C,
pH 4 y pH 5) y se conservaron a 5ºC hasta su uso.
La suspensión de bacilos que se empleó para inocular las leches se preparó de la
siguiente manera: a partir de un cultivo de cada cepa en caldo MRS (over night), se realizó un
segundo repique en 5 ml del mismo caldo pero en tubos de centrífuga, que se incubaron a
37ºC durante 24h. Una vez desarrollados los caldos, se centrifugaron a 6000 rpm durante 10
min. a temperatura ambiente con la finalidad de cosechar las células. Trabajando siempre bajo
condiciones de esterilidad, se eliminó el sobrenadante y el pellet celular obtenido se
resuspendió y lavó dos veces con 5 ml de buffer fosfato de potasio estéril. La operación se
repitió dos veces. Finalmente, se resuspendió el pellet en 500 l de buffer de manera de
concentrar diez veces la población celular inicial (aproximadamente 108 UFC/ ml). Se
homogeneizó en vortex y con esta suspensión celular se inocularon tres tubos de leche (C,
pH 4 y pH 5) por cada cepa, adicionando a cada uno de ellos 150 l de suspensión, para
lograr en la leche una concentración celular aproximada de 108 CFU/ ml. Una vez inoculados,
se almacenaron los tubos a temperatura de refrigeración durante 30 días.
115
Al momento de la inoculación (tiempo cero) se determinó:
 Recuento de lactobacilos viables (técnica de recuento en placa)
 Valor de pH a leche control (C)
Para el recuento de lactobacilos se realizaron diluciones decimales con agua de
peptona al 0.1%(p/v) a partir de los tubos de leche inoculados C (para cada cepa) y se sembró
en superficie con 0.1 ml de las diluciones 10-4 y 10-5 empleando Agar para recuento en placa
(APC).
Al cabo de los 30 días de almacenamiento, se retiraron los tubos de leche del
refrigerador y se procedió a realizar nuevamente el recuento de lactobacilos y la medida de
pH. Se empleó la metodología antes descripta (sembrando las mismas diluciones) pero en este
caso se sembraron tanto los controles como los tubos de leche de pH 4 y 5 por cada cepa.
Las placas, una vez sembradas fueron incubadas a 37ºC durante 48 a 72 h en
anaerobiosis por combustión. Transcurrido el período de incubación se realizaron los
correspondientes recuentos celulares en un Cuenta colonias (JP Selecta SA, Comecta SA
DigitalS).
Comparando los valores de pH inicial y final para cada una de las tres leches
inoculadas por cepa, se determinó si hubo acidificación del medio como consecuencia de la
fermentación de carbohidratos llevada a cabo por la bacteria o si permaneció sin cambios.
Con respecto al recuento de células viables se determinó si la conservación a temperatura de
116
refrigeración de los lactobacilos en leche estéril acidificada afectaba la viabilidad de los
mismos, lo cual se ve reflejado como una caída en los ordenes logarítmicos entre los
recuentos a tiempo cero y a 30 días, comparando esos valores con los del control.
3.7.5 Interacciones entre lactobacilos intestinales y bacterias lácticas

de starters.
Fundamento general:
Ver 3.5.3. En este ensayo se pretendió determinar la presencia o no de agentes
antimicrobianos en el SLC de los lactobacilos intestinales frente a las bacterias lácticas
ensayadas (utilizadas como starters en la industria láctea fermentativa) y viceversa (3.7.5.a y
3.7.5. b)
3.7.5.a Evaluación del efecto producido por SLC de lactobacilos intestinales
sobre el desarrollo de bacterias lácticas de starter.
Para conocer dicho comportamiento, se empleó el método semicuantitativo de Ensayo
de Difusión en Agar (EDA), previamente descripto.
Las bacterias lácticas usadas (pertenecientes al cepario del PROLAIN) fueron las
siguientes: dos cepas de Streptococcus thermophilus (176 y A4), dos cepas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus (Ab1 y Hb2) y dos cepas de Lactococcus lactis (A6 y Mo12).
117
Las pátinas fueron realizadas con las bacterias lácticas, pero en este caso empleando
como medios agarizados, los siguientes: para el género Lactobacillus, agar MRS y para
Lactococcus y Streptococcus, agar Elliker (ver Anexo). Estos medios fraccionados en
porciones de 20 ml y esterilizados se dejaron enfriar hasta 45ºC.
Partiendo de cultivos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en caldo MRS
(over night) y de Lactococcus lactis y Streptococcus thermophilus en caldo Elliker (over
night), se procedió a adicionar 0.3 ml de dichos cultivos a los 20 ml del medio agarizado
correspondiente, homogeneizando rápidamente con vortex de manera de lograr una
distribución del microorganismo en el medio lo más uniforme posible. Se volcó la mezcla en
placas de Petri estériles, previamente rotuladas con la identificación de la bacteria láctica
contenida. Una vez solidificadas se llevaron las placas a gabinete de aire estéril donde se
dejaron secar por un tiempo aproximado de 1 h. Luego se hicieron, con sacabocados estériles,
ocho hoyos (diámetro, 10 mm) por cada placa y rotulando en el fondo de la misma y en cada
hoyo la denominación del SLC del lactobacilo correspondiente (ej. SLC F3). De este modo, se
testearon ocho cepas de lactobacilos por cada pátina de bacteria láctica de starters.
Para obtener los SLC de los lactobacilos intestinales se procedió de la siguiente
manera:
Cultivos de cada cepa en 5 ml de caldo MRS (over night) se fraccionaron (1ml) en
cinco tubos eppendorf plásticos estériles previamente rotulados y se centrifugaron a 12.000
rpm durante 10 min. a 5ºC. Se tomaron los SLC obtenidos y se colocaron en frascos plásticos
previamente esterilizados (bajo gabinete de aire estéril) con una mezcla alcohol-agua,
conservándolos por congelamiento a –20ºC hasta su uso.
Se depositaron en el hoyo correspondiente 180 l del SLC del lactobacilo,
118
procediendo de la misma manera para los restantes siete SLC, de manera tal que en las seis
pátinas de bacterias lácticas se colocó el mismo juego de SLC de lactobacilos intestinales. Se
dejaron las placas en reposo unos minutos para evitar derrames de sobrenadante en el agar y
luego se incubaron a 37ºC durante 48 h en aerobiosis para las pátinas conteniendo
Lactobacillus y Streptococcus mientras que aquellas formuladas con Lactococcus se
incubaron a 25ºC durante 48h en aerobiosis.
Se registró presencia o ausencia de halos de inhibición de crecimiento de las bacterias
por parte de los SLC de los lactobacilos intestinales. En aquellos casos en que se encontró
inhibición, se midió el diámetro de los halos utilizando un calibre adecuado a tal fin.
3.7.5. b Evaluación del efecto producido por SLC de Lact. delbrueckii
subsp. bulgaricus Ab1, Streptococcus thermophilus 176 y
Lactococcus lactis Mo12 sobre el desarrollo de lactobacilos
intestinales.
En este caso, se aplicó la misma metodología y criterio de interpretación de resultados
que en el punto anterior (ver 3.7.5.a) sólo que en este caso las pátinas estaban formuladas con
los lactobacilos y se adicionaron SLC en los hoyos provenientes de las mismas bacterias
lácticas antes empleadas.
119
3.7.5.c Determinación de la naturaleza del agente inhibidor presente en
SLC de Lact. gasseri F37” frente a Streptococcus thermophilus 176,
Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 y Lactococcus lactis Mo12.
Para este ensayo, se empleó nuevamente el método cualitativo de Desarrollo en Medio
Líquido (DML).
Fundamento:
Ver 3.7.1. En este caso, no sólo se pretendió determinar la presencia de un agente
inhibidor del crecimiento microbiano sino realizar distintos tratamientos (químicos y físicos)
en los SLC para determinar la naturaleza química del mismo. La neutralización pone de
manifiesto que la acción inhibitoria se basa en la producción de ácido, la esterilización
manifiesta la naturaleza química termoestable o no del inhibidor (proteínas, glicoproteínas o
carbohidratos) y el tratamiento con pepsina manifiesta la naturaleza proteica del mismo.
A partir de un cultivo de Lactobacillus gasseri F37” en caldo MRS (over night), se
repicó en 45 ml del mismo caldo colocados en un tubo de centrífuga tapa a rosca estéril de 50
ml de capacidad. El inóculo se hizo al 2% y se incubó a 37ºC durante 24h en aerobiosis. Una
vez desarrollado el cultivo, se centrifugó a 6000 rpm durante 10 min. a temperatura ambiente.
Bajo gabinete de aire estéril, se separaron aproximadamente unos 40 ml de SLC los que se
guardaron en frascos plásticos tapa a rosca esterilizados como se mencionó en el punto
3.7.5.a.
A partir del SLC, se tomaron varias alícuotas y se sometieron a los tratamientos
120
descriptos a continuación:
 A una porción de 10 ml colocada en un vaso de precipitado, se le neutralizó el
pH por agregado de pequeñas granallas de Na(OH) (para evitar diluir el sobrenadante) y
se esterilizó por filtración.
 A una porción de 10 ml colocada en un tubo tapa a rosca se la sometió a un
tratamiento térmico de 15 min. a 121ºC.
 A una porción de 10 ml colocada en un tubo estéril, se le adicionó 1ml de una
solución de pepsina 100g/ml. Se incubó la mezcla a 37ºC durante 3h en baño de agua
termostatizado.
 A una porción de 10 ml se la dejó tal cual (Control).
Las cuatro alícuotas de SLC se colocaron en tubos eppendorf plásticos estériles de 2
ml de capacidad y se rotularon: SLC-N (SLC neutralizado), SLC-E (SLC esterilizado), SLC-
P (SLC tratado con pepsina) y SLC-C (SLC control). Se concentraron los SLC durante cuatro
horas y media a 45ºC bajo vacío en equipo Speed Vac (Savant, DNA 120).
Se calculó el factor de concentración F para los sobrenadantes y con éste se determinó
el volumen a agregar de SLC-N, SLC-E, SLC-P y SLC-C a los cultivos de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1, Streptococcus thermophilus 176 y Lactococcus lactis
Mo12.
A partir del cultivo en caldo MRS de Lact. bulgaricus Ab1 y en caldo Elliker para
Strep. thermophilus 176 y L. lactis Mo12 (over night) se inoculó al 2% en 60 ml del caldo
correspondiente y se fraccionó (3 ml) en tubos de hemólisis estériles, los cuales se rotularon
121
como: C (control), E (esterilizado), P (tratamiento con pepsina), N (neutralizado) y CL
(Control cultivo bacteria láctica sin agregado de SLC).
A continuación, la Figura 3 muestra el esquema de la metodología que se siguió para
este ensayo.
60 ml de caldo inoculados (2%)

con la bacteria láctica (starter)
Fraccionar de a 3ml
CL C (con SLC-C) E (con SLC-E) P (con SLC-P) N (con SLC-N)
Adicionar Vx de SLC correspondiente
Fig. 3- Metodología para evaluar la naturaleza química de agentes inhibidores del crecimiento
de la cepa Lactobacillus rhamnosus F37”.
Como se mencionó anteriormente con el factor F, se calculó un volumen de SLC a
agregar, que llamamos Vx.
122
Una vez adicionados la totalidad de los tubos con los SLC correspondientes, se
incubaron a 37ºC durante 24h en aerobiosis. Al cabo de dicho tiempo se leyeron las D.O. a
560 nm, cuyos valores se graficaron (diagrama de barras).
El valor de D.O. del Control (cultivo láctico con SLC-C) permite conocer sólo la
magnitud de la inhibición que se produce sobre el desarrollo de la bacteria láctica, en cambio
al comparar los valores de D.O. obtenidos para los SLC con los tratamientos antes
mencionados, se puede concluir a qué tipo de sustancia/s (proteínas, ácidos orgánicos,
sustancias termosensibles, o una mezcla de éstos) obedece dicha inhibición.
3.7.5.d. Efecto de SLC de Lact. gasseri F37” y Lact. rhamnosus F71 frente a
bacterias lácticas de starters (cinéticas de crecimiento).
Fundamento:
A partir de los resultados obtenidos en condiciones de desarrollo normal (cultivo sin
adición de SLC) puede graficarse la cinética de crecimiento control: D.O. vs Tiempo (horas).
Si se desea evaluar qué tipo de efecto produce el agregado de un SLC de una bacteria sobre el
desarrollo de otra, se procede a determinar la curva de crecimiento correspondiente a la
combinación cultivo-SLC. Comparando esta última con la correspondiente cinética de
crecimiento control de la cepa en estudio, puede concluirse:
 Cuando no existe efecto inhibidor del desarrollo, ambas curvas de crecimiento
123
(control y con agregado de SLC) se superponen.
 Cuando hay inhibición total, no hay desarrollo de la bacteria en el cultivo y por
tanto la curva de crecimiento para el agregado de SLC mostrará un valor constante de
D.O. y, naturalmente, estará ubicada debajo de la curva de crecimiento control del cultivo
microbiano.
 Cuando hay inhibición parcial, la curva de crecimiento para el agregado de
SLC mostrará una evolución similar a la curva control pero con valores de D.O. menores.
Para obtener el SLC de ambos lactobacilos intestinales se procedió de la siguiente
manera: a partir de un cultivo de cada uno de ellos en caldo MRS (over night) se hizo un
inóculo al 2% en 45 ml de caldo MRS estéril dispuestos en un tubo de centrífuga plástico
estéril de 50 ml de capacidad. Se incubó a 37ºC durante 24h en aerobiosis y una vez
desarrollado el cultivo se centrifugó a 6000 rpm durante 10 min. a temperatura ambiente. Bajo
gabinete de aire estéril, se separaron aproximadamente unos 40 ml de SLC los que se
guardaron en frascos plásticos esterilizados como se mencionó en el punto 3.7.5.a, los cuales
fueron conservados por congelamiento a –20ºC hasta su uso.
Para poner de manifiesto las interacciones entre cepas, se eligieron las siguientes
combinaciones, teniendo en cuenta los tres tipos de comportamientos (inhibición total o
parcial, y ausencia de inhibición) observados (ver 3.7.5.a):
124
Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 vs Lact. gasseri F37”
Streptococcus thermophilus 176 vs Lact. gasseri F37”
Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 vs Lact. rhamnosus F71
Lactococcus lactis Mo12 vs Lact. gasseri F37”
Se descongelaron los SLC a utilizar, se concentraron (según 3.7.5.a) y se calculó el
factor de concentración F para determinar el volumen de SLC de F37” y F71 o caldo estéril a
agregar a los cultivos de las bacterias lácticas. La Figura 4 muestra el esquema de la
metodología que se siguió para este ensayo.
La totalidad de los tubos adicionados de los correspondientes SLC y sus controles,
fueron incubados a 37ºC en baño de agua termostatizado, realizándose las lecturas de D.O. a
560 nm a los intervalos de tiempo predeterminados.
A t =0 se midió la D.O. en un excedente de aproximadamente 1 ml que quedó luego de
fraccionar en 18 tubos cada medio.
Como puede apreciarse, cada dos horas se retiraron del baño los tubos
correspondientes a las muestras y sus controles, efectuándose dos lecturas en cada uno de los
tres tubos rotulados para una misma combinación (ver triplicados Fig. 4). De esta manera se
obtuvieron, en cada caso, seis valores para promediar.
Con los valores de D.O. promedio determinados para las combinaciones microbianas
ensayadas se obtuvieron las cinéticas de crecimiento correspondientes. Comparando con las
de los controles, se evaluó el tipo de inhibición que el SLC producía sobre el crecimiento de
las bacterias lácticas usadas.

125
Lact. Ab1 2% Lact. Ab1 2% Strep. 176 2% L. Mo12 2%

Caldo MRS (120 ml) Caldo MRS (120 ml) Caldo Elliker (120 ml) Caldo Elliker (120 ml)
Fraccionar cada cultivo en 2 alícuotas de 55 ml y adicionar a cada una de ellas, un

volumen Vx del SLC correspondiente o caldo estéril de la siguiente manera:
SLC F37” Caldo MRS SLC F71 Caldo MRS SLC F37” Caldo Elliker SLC F37” Caldo Elliker
(Control) (Control) (Control) (Control)
Fraccionar cada combinación (cultivo-SLC y cultivo-caldo) en 18 tubos de 3ml c/u y rotular por
triplicado: Ab1/F37” y su CAb1, Ab1/F71 y su CAb1, 176/F37” y su C176, Mo12/F37” y su CMo12; y
para cada una de ellas los tiempos de lectura: 2, 4, 6, 8, 10 y 24h.
Fig. 4- Metodología para evaluar las interacciones entre las cepas de Lact. gasseri F37” y Lact.
rhamnosus F71 frente a bacterias lácticas de starters (Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1,
Streptococcus thermophilus 176 y Lactococcus lactis Mo12).
126
Resultados
4.1 Aislamiento y Purificación de bacterias intestinales.
Se procesaron ocho muestras de materia fecal provenientes de bebés lactantes, una por
cada uno, de las cuales las dos primeras permitieron recuperar únicamente bacilos
esporulados, microorganismos que no eran de interés para los objetivos propuestos en el
presente trabajo. Por tanto, dichas muestras no fueron tenidas en cuenta y, por esto, en el
presente estudio sólo se mencionan 6 individuos para identificar el origen de los aislamientos
obtenido, cuyo número se detalla a continuación:
 Individuo 1: 7 aislamientos
 Individuo 2: 1 aislamiento
4.2 Identificación de las cepas aisladas.
4.2.1 Características Fenotípicas.
La totalidad de los aislamientos resultaron ser bacilos no móviles, gram (+) y catalasa
(-). Aquellos provenientes de los individuos 1, 4 y 6 coagularon la leche en 24h, los
128
Resultados
provenientes de los individuos 2 y 3 lo hicieron en 48 h y finalmente 4 aislamientos del
individuo 5 no coagularon la misma, 2 lo hicieron muy lentamente (luego de 14 días de
incubación) y el resto se comportó de manera similar a los provenientes del individuo 1.
En cuanto a la morfología, a excepción de los aislamientos del individuo 3, los
restantes se mostraron similares en cuanto a tamaño y forma (bacilos irregulares, en su
mayoría medianos), y longitud y disposición de las cadenas (generalmente irregulares, en
forma de rulos). Los bacilos aislados del individuo 3 mostraron una morfología bastante
diferente a los demás, ya que resultaron más largos y rectos, con menor tendencia a formar
cadenas y cuando lo hacían éstas eran menos enroscadas sobre sí mismas y más lineales. La
Tabla 10 muestra los resultados obtenidos en la caracterización fenotípica de los bacilos
intestinales.
Como puede observarse en dicha Tabla, la denominación de los aislamientos no es
correlativa, lo cual fue debido a la pérdida que se produjo de algunos de ellos durante el
aislamiento y purificación.
4.2.2 Quimismo Fermentativo: Homofermentación/Heterofermentación
De los resultados obtenidos en la determinación del Quimismo Fermentativo, a través
del Ensayo de Gibson, pudo concluirse que todos los aislamientos llevaron a cabo un
metabolismo homofermentante (Tabla 10).
129
Resultados
Tabla 10- Características fenotípicas de los aislamientos intestinales estudiados.
fermentación
Coag. Leche
Aislamiento
Movilidad
Individuo
Catalasa
Tipo de
Gram Observaciones Morfológicas
F3 - + - Hom +24h Bacilos medianos, sueltos y en cadenas cortas irreg.

F16 - + - Hom +24h Bacilos cortos, medianos y gruesos en cadenas más largas.
F18 - + - Hom +24h Bacilos muy cortos y gruesos en cadenas enroscadas.
F19 - + - Hom +24h Bacilos medianos, algo rectos en cadenas enroscadas.
1 F20 - + - Hom +24h Bacilos medianos, algo rectos en cadenas más abiertas.
F21 - + - Hom +24h Bacilos medianos, sueltos y en cadenas cortas irreg.
F22 - + - Hom +24h Bacilos medianos, algo rectos en cadenas abiertas.
2 F30 - + - Hom +48h Bacilos cortos, medianos y algunos largos en cadenas irregulares.
F37 - + - Hom +48h Bacilos más rectos, cortos y medianos en cadenas cortas.
F37’ - + - Hom +48h Bacilos más rectos, en V, empalizada, sueltos o en cadenas
cortas.
3 F37’a - + - Hom +48h Bacilos más rectos, medianos en cadenas cortas.
F37” - + - Hom +48h Bacilos más rectos, cortos en cadenas cortas e irregulares.
F44 - + - Hom +24h Bacilos medianos gruesos en cadenas cortas enroscadas.
F45 - + - Hom +24h Bacilos medianos y largos en cadenas enroscadas.
F46 - + - Hom +24h Bacilos medianos gruesos en cadenas cortas enroscadas.
F49 - + - Hom +24h Bacilos muy cortos en cadenas enroscadas.
F50 - + - Hom +24h Bacilos medianos en cadenas más lineales.
F53 - + - Hom +24h Bacilos cortos y medianos en cadenas irregulares.
F56 - + - Hom +24h Bacilos muy cortos en cadenas enroscadas.
F57 - + - Hom +24h Bacilos cortos en cadenas irregulares.
4 F57’ - + - Hom +24h Bacilos cortos y medianos en cadenas irregulares.
F57’’ - + - Hom +24h Bacilos cortos gruesos en cadenas irregulares.
F57* - + - Hom +24h Bacilos cortos gruesos en cadenas irregulares.
F58g - + - Hom +24h Bacilos cortos gruesos en cadenas irregulares.
F58ch - + - Hom +24h Bacilos cortos en cadenas cortas y enroscadas.
F62 - + - Hom +24h Bacilos cortos en cadenas cortas y enroscadas.
F64’ - + - Hom +24h Bacilos cortos en cadenas cortas y más lineales.
+24h/+48h/+14d: coagula la leche en 24h /48h/14 días, respectivamente.

Hom: Homofermentante
130
Resultados
Tabla 10- Características fenotípicas de los aislamientos intestinales estudiados (continuación).
fermentación
Aislamiento
Coag. leche
Movilidad
Individuo
Catalasa
Tipo de
Gram Observaciones Morfológicas
F65 - + - Hom +14d Bacilos medianos en cadenas lineales y enroscadas.

F66 - + - Hom +14d Bacilos medianos en cadenas lineales y muy poco enroscadas.
F67 - + - Hom - Bacilos medianos en cadenas lineales y muy enroscadas.
F68 - + - Hom +24h Bacilos medianos gruesos en cadenas levemente curvas.
F69 - + - Hom +24h Bacilos cortos en cadenas irregulares.
F70 - + - Hom +24h Bacilos medianos en cadenas cortas irregulares.
F71 - + - Hom +24h Bacilos cortos y medianos en cadenas cortas irregulares.
F72 - + - Hom +24h Bacilos medianos en cadenas cortas irregulares.
5 F74 - + - Hom +24h Bacilos medianos y largos en cadenas cortas irregulares.
F75 - + - Hom - Bacilos cortos y medianos en cadenas más lineales.
F76 - + - Hom - Bacilos medianos en cadenas cortas irregulares.
F77 - + - Hom - Bacilos cortos y medianos en cadenas cortas enroscadas.
F80 - + - Hom +48h Bacilos cortos y gruesos en cadenas cortas enroscadas.
F81 - + - Hom +24h Bacilos cortos en cadenas enroscadas.
F83 - + - Hom +24h Bacilos cortos y medianos en cadenas enroscadas.
6 F90 - + - Hom +24h Bacilos cortos en cadenas enroscadas.
+24h/+48h/+14d: coagula la leche en 24h /48h/14 días, respectivamente.

Hom: Homofermentante
131
Resultados
4.2.3 Perfil de Fermentación de Carbohidratos.
Como se mencionó en el punto 3.3.4 de la sección Materiales y Métodos, los
resultados obtenidos en la determinación del Perfil de Fermentación de Carbohidratos se
compararon inicialmente con un patrón general que contempla no sólo la totalidad de los
grupos de bacilos (homofermentantes obligados, heterofermentantes obligados y facultativos)
sino también todos los carbohidratos que el manual de Bergey considera (Ver Anexo Tabla
22). En esta primera evaluación resultó muy difícil comparar los perfiles obtenidos entre sí,
por lo que se compararon con un segundo patrón de fermentación simplificado (Ver Anexo
Tabla 23), considerando únicamente aquellos carbohidratos más representativos y con mayor
capacidad diferencial del grupo homofermentante. Se asignó así género y especie a los
aislamientos estudiados:
 Aislamientos del individuo 3: Lactobacillus del grupo 1
 Aislamientos de los individuos 1, 2, 4, 5 y 6: Lactobacillus del grupo
casei
La denominación “Lactobacillus del grupo 1” incluye a las especies Lact. acidophilus,
Lact. crispatus y Lact. gasseri; debido a las similitudes observadas en sus patrones de
fermentación ( Bergey (9)) (ver Tabla 22).
El perfil de fermentación obtenido para los bacilos intestinales aislados puede
observarse en la Tabla 11.
132
Resultados
Tabla 11-Perfil de Fermentación de carbohidratos de los aislamientos intestinales (Método API).
Aislamiento
Melezitosa
Gluconato
Arabinosa
Trehalosa
Galactosa
Celobiosa
Melibiosa
Individuo
Rafinosa
Almidón
Glucosa
Maltosa
Manitol
Manosa
Ribosa
Xylosa
F3 - ++ ++ ++ +/- +/- ++ ++ + - - ++ ++ - -
F16 - ++ ++ ++ +/- +/- ++ ++ + - - ++ ++ - -
F18 - ++ ++ ++ + + ++ ++ + +/- - ++ ++ - -
1 F19 - ++ ++ ++ + + ++ ++ + - - ++ ++ - -
F20 - ++ ++ ++ + + ++ ++ + +/- +/- ++ ++ - +/-
F21 - ++ ++ ++ + + ++ ++ + - +/- ++ ++ - +/-
F22 - ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + - - ++ ++ - +/-
2 F30 +/- ++ ++ ++ +/- - ++ ++ + - - +/- ++ - +/-
F37 - ++ ++ ++ - ++ - ++ - - + - ++ - -
3 F37’ - ++ ++ ++ - ++ - ++ - - - - ++ - -
F37’a - ++ ++ ++ - ++ - ++ - - - - ++ - -
F37” + ++ ++ ++ + ++ + ++ + - - - ++ - -
F44 ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ - +/- ++ ++ - -
F45 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F46 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F49 - ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + - +/- + ++ - -
F50 + ++ ++ ++ - ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F53 + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F56 - ++ ++ ++ + + ++ ++ + - - ++ ++ - -
F57 - ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + - - ++ ++ - -
4 F57’ +/- ++ ++ ++ + + ++ ++ + - +/- ++ ++ - -
F57’’ - + ++ ++ ++ + ++ ++ + - - ++ ++ - -
F57* +/- ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F58g - ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + - - ++ ++ - -
F58ch - ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F62 ++ ++ ++ ++ +/- ++ ++ ++ ++ - - - ++ - -
F63 + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ - - - ++ - -
F64 ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - ++ ++ - +/-
F64’ ++ ++ ++ ++ + - ++ ++ ++ - - - ++ - -
F65 + ++ - ++ + +/- +/- ++ + - - - ++ - -
5 F66 + ++ ++ ++ + +/- ++ ++ + - - +/- ++ - -
F67 + ++ ++ ++ + - ++ ++ + - - +/- ++ - -
F68 + ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - + ++ - -
- No fermenta, +/- Fermentación débil, + Fermentación moderada y ++ Fermentación intensa.
133
Resultados
Tabla 11-Perfil de Fermentación de carbohidratos de los aislamientos intestinales (Método API)

(continuación).
Aislamiento
Individuo
Melezitosa
Arabinosa
Gluconato
Trehalosa
Galactosa
Melibiosa
Celobiosa
Rafinosa
Almidón
Glucosa
Maltosa
Manosa
Manitol
Ribosa
Xylosa
F69 +/- ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F70 - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F71 +/- ++ ++ ++ +/- ++ ++ ++ ++ - - +/- ++ - -
F72 +/- ++ ++ ++ +/- - ++ ++ ++ - - - ++ - -
F73 + + ++ ++ +/- - ++ ++ +/- - - - ++ - -
F74 - ++ ++ ++ +/- - ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F75 + ++ - ++ + - ++ ++ + - - +/- ++ - -
5 F76 + ++ ++ ++ + +/- ++ ++ + - - +/- ++ - -
F77 + ++ ++ ++ + + ++ ++ + - - +/- ++ - -
F78 + ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - - ++ - -
F79 +/- - ++ ++ +/- - ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F80 - ++ ++ ++ + - ++ ++ ++ - - - ++ - -
F81 - ++ ++ ++ + - ++ ++ + - - - + - -
F83 - ++ - ++ +/- +/- ++ ++ + - - - ++ - -
F84 - ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F85 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - - ++ - -
F86 ++ ++ ++ ++ +/- ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
6 F90 ++ ++ ++ ++ + +/- ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F93 ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F94 ++ ++ ++ ++ + - ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
F95 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ - -
- No fermenta, +/- Fermentación débil, + Fermentación moderada y ++ Fermentación intensa.
134
Resultados
4.2.4 Desarrollo en medios selectivos. Método Ecométrico.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el estudio de fermentación de
carbohidratos y en el desarrollo en medios selectivos, se encontró una coherencia en los
mismos ya que los cuatro aislamientos del individuo 3, que anteriormente habían sido
asignados como Lactobacillus del Grupo 1, no desarrollaron en presencia de cloruro de litio y
propionato de sodio mientras que sí lo hicieron en presencia de bilis. Los aislamientos
provenientes de los restantes individuos, desarrollaron en los tres medios de cultivo utilizados
en este ensayo, apoyando de este modo la identificación como Lactobacillus casei. La Tabla
12 muestra los resultados obtenidos para este ensayo.
Además del desarrollo selectivo, también se encontraron diferencias morfológicas en
las colonias desarrolladas en los tres medios de cultivo. Por ejemplo, los aislamientos
provenientes de los individuos 1 y 2 formaron colonias blancas convexas de bordes regulares,
los provenientes del individuo 3 (que también en este aspecto se diferenciaron de los demás)
formaron colonias muy particulares, con el aspecto de “gotitas de rocío” muy pequeñas y
transparentes. Los aislamientos de los individuos 4, 5 y 6 se mostraron como grupos
heterogéneos de cepas donde la morfología de sus colonias se distribuyó entre colonias
blancas convexas, de bordes regulares y otras convexas, más translúcidas y cremosas de
bordes irregulares, generalmente de mayor tamaño.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la caracterización fenotípica y el perfil
de fermentación de carbohidratos así como el desarrollo en medios selectivos, se ajustó la
clasificación de los aislamientos como pertenecientes al grupo Lactobacillus casei a aquellos
135
Resultados
Tabla 12- Desarrollo de lactobacilos intestinales en medios selectivos (Método Ecométrico).
MRS (ICA)
(ICA/ICR)
(ICA/ICR)
Aislamiento
MRS-Bilis
Morfología de colonias
MRS-LP
Individuo
Convex. bordes reg. Blancas Convex. bordes irreg. crem-trans.
MRS MRS-LP MRS-Bilis MRS MRS-LP MRS-Bilis
F3 5 5/1 5/1 x x x
F16 5 5/1 5/1 x x x
F18 5 5/1 5/1 x x x
1 F19 5 5/1 5/1 x x x
F20 5 5/1 5/1 x x x
F21 5 5/1 5/1 x x x
F22 5 5/1 5/1 x x x
2 F30 5 5/1 5/1 x x x
F37 5 0 5/1 x x
3 F37’ 5 0 5/1 x x
F37’a 5 0 5/1 x x
F37” 5 0 5/1 x x
F44 5 5/1 5/1 x x x

F45 5 5/1 5/1 x x x
F46 5 5/1 5/1 x x x
F49 5 5/1 5/1 x x x
F50 5 5/1 5/1 x x x
F53 5 5/1 5/1 x x x
F56 5 5/1 5/1 x x x
4 F57 5 5/1 5/1 x x x
F57’ 5 5/1 5/1 x x x
F57* 5 5/1 5/1 x x x
F58g 5 5/1 5/1 x x x
F58ch 5 5/1 5/1 x x x
F62 5 5/1 5/1 x x x
F63 5 5/1 5/1 x x x
F64 5 5/1 5/1 x x x
F64’ 5 5/1 5/1 x x x
F65 5 5/1 5/1 x x x

F66 5 5/1 5/1 x x x
5 F67 5 5/1 5/1 x x x
F68a 5 5/1 5/1 x x x
F68b 5 5/1 5/1 x x x
F69 5 5/1 5/1 x x x
ICA: Indice de Crecimiento Absoluto

ICR: Indice de Crecimiento Relativo
136
Resultados
Tabla 12- Desarrollo de lactobacilos intestinales en medios selectivos (Método Ecométrico)

(continuación).
MRS (ICA)
(ICA/ICR)
(ICA/ICR)
Aislamiento
MRS-Bilis
Morfología de colonias
MRS-LP
Individuo
Convex. Bordes reg. blancas Convex. Bordes irreg. Crem-trans.
MRS MRS-LP MRS-Bilis MRS MRS-LP MRS-Bilis
F70 5 5/1 5/1 x x x

F71 5 5/1 5/1 x x x
F72 5 5/1 5/1 x x x
F73 5 5/1 5/1 x x x
F74 5 5/1 5/1 x x x
F75 5 5/1 5/1 x x x
5 F76 5 5/1 5/1 x x x
F77 5 5/1 5/1 x x x
F78 5 5/1 5/1 x x x
F79 5 5/1 5/1 x x x
F80 5 5/1 5/1 x x x
F81 5 5/1 5/1 x x x
F83 5 5/1 5/1 x x x
F84 5 5/1 5/1 x x x

F85 5 5/1 5/1 x x x
F86 5 5/1 5/1 x x x
6 F90 5 5/1 5/1 x x x
F93 5 5/1 5/1 x x x
F94 5 5/1 5/1 x x x
F95 5 5/1 5/1 x x x
ICA: Indice de Crecimiento Absoluto

ICR: Indice de Crecimiento Relativo
137
Resultados
obtenidos de los individuos 1, 2, 4, 5 y 6 (50 aislamientos) y como Lactobacillus acidophilus
a los provenientes del individuo 3 (4 aislamientos.)
4.3 Diversidad genética de los lactobacilos intestinales (perfiles
RAPD).
La Figura 5 corresponde al dendrograma obtenido al procesar 17 aislamientos de
lactobacilos intestinales, pertenecientes a los individuos 1, 2, 4, 5 y 6, empleando los primers
arbitrarios B06 (5’-TGCTCTGCCC-3’), B08 (5’-GTGACGCAG-3’) y B10 (5’-
CTGCTGGGAC-3’).
Como puede observarse, los 3 aislamientos del individuo 5 (F74, F81 y F83) podrían
pertenecer a la misma cepa puesto que el coeficiente de similitud entre ellas supera el 90%; en
cambio, la cepa F70 demuestra tener un coeficiente de similitud muy distinto a las anteriores y,
por tanto, se trataría de una cepa distinta.
Para el individuo 6 podrían reconocerse dos cepas diferentes (cada una de ellas con
dos aislamientos) que muestran perfiles RAPD distintos. Ellas son: F84 - F85 y F93 – F95 donde
una de las duplas serían dos cepas iguales pero a su vez diferentes a las otras dos, que también
son iguales entre ellas.
En el caso del individuo 4, los aislamientos F53, F64’ y F64 pertenecerían a la misma
cepa, dado que sus coeficientes de similitud superan el 90%; los aislamientos F49, F56 y F57 en
cambio, podrían pertenecer a una o dos cepas diferentes a las previamente mencionadas.
Refiriéndonos ahora al individuo 1, ambos aislamientos analizados (F16 y F22) podrían
138
F70 Individuo 5
Fig. 5- Dendrograma obtenido por comparación (Programa Gel Compare, Applied Maths, Bélgica) y reagrupamiento (Método UPGMA:
Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Average) de los perfiles RAPD de cepas de Lact. rhamnosus aisladas de bebés.
Resultados
pertenecer a la misma cepa puesto que el coeficiente de similitud entre ellas supera el 90%.
Con respecto al individuo 2 se analizó el único aislamiento del mismo y se obtuvo el
correspondiente perfil. Finalmente, la cepa de colección utilizada (Lact. rhamnosus Z212T)
mostró estar más emparentada genéticamente con aislamientos del individuo 4 (F57, F56 y F49)
e individuo 5 (F70) (coeficiente de similitud 60%).
La Figura 6 corresponde al dendrograma obtenido al procesar los aislamientos
anteriormente mencionados, pero ahora junto a los dos aislamientos del individuo 3 (F37 y
F37”), utilizando los primers B06 (5’-TGCTCTGCCC-3’) y B10 (5’-CTGCTGGGAC-3’).
Estos últimos podrían pertenecer a la misma cepa puesto que el coeficiente de similitud entre
ellos supera el 90%, y por otro lado, sus perfiles son muy diferentes a los de los demás
aislamientos; lo cual indicaría que se trata de dos cepas pertenecientes a otra especie.
El programa que se utilizó para comparar los perfiles obtenidos de los distintos
individuos, los agrupa en función del número y posición de bandas determinando así Clusters
y Subclusters. Si bien la técnica RAPD-PCR no se utiliza para el fin taxonómico de asignar la
especie a una cepa, la presencia en los perfiles RAPD de ciertas bandas muy conservadas
entre cepas de la misma especie, permitieron a los expertos de la Unité de Recherches
Laitières et Genetiqueé Apliqueé del INRA establecer la siguiente asignación de especies:
Lactobacillus gasseri (antes grupo Lact. acidophilus): F37 y F37’’
Lactobacillus rhamnosus (antes grupo Lact. casei): F16,F22, F30, F49, F53, F56, F57, F64,
F64’, F70, F74, F81, F83, F84, F85, F93 y F95
140
Primer B06 Primer B10

% de Similitud
(Coeficiente de Pearson)
F95
F93 Individuo 6
F85
F84
F83
F81 Individuo 5
F74
F30 Individuo 2
F64’
F64 Individuo 4
F53
F22
Individuo 1
F16
F57
F56 Individuo 4
F49
F70 Individuo 5
F37 Individuo 3
F37”
Fig. 6- Dendrograma obtenido por comparación (Programa Gel Compare, Applied Maths, Bélgica) y reagrupamiento (Método UPGMA:
Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Average) de los perfiles RAPD de cepas de Lact. rhamnosus y Lact. gasseri aisladas de bebés.
Resultados
La Tabla 13 muestra los valores correspondientes a la pérdida de viabilidad de las
cepas estudiadas en solución gástrica simulada.
Exceptuando el aislamiento F3, los aislamientos de los individuos 1 y 2 demostraron
afectarse poco en este ensayo, al verificarse una caída promedio de 1.9 ordenes logarítmicos
en los recuentos celulares al cabo de 3h.
Distintos fueron los resultados obtenidos para los aislamientos provenientes de los
individuos 3, 4, 5 y 6. Los cuatro aislamientos de Lactobacillus gasseri fueron severamente
afectados en su viabilidad por el tratamiento gástrico, ya que dos de ellos (F37’ y F37”)
perdieron, en promedio, 5.3 ordenes logarítmicos en sus recuentos celulares; mientras que los
otros dos sufrieron una caída promedio de 4.3 ordenes log. Para las cepas de Lactobacillus
rhamnosus provenientes de los restantes tres individuos, se observaron caídas de entre 1.9 a
5.4 ordenes logarítmicos (individuo 4), de 2.9 a 6.6 ordenes logarítmicos (individuo 5) y de
2.6 a 5.1 ordenes logarítmicos (individuo 6).
Si bien esta pérdida de viabilidad es bastante marcada, dos lactobacilos: F58ch y F64
merecen ser tenidos en cuenta, ya que sobrevivieron satisfactoriamente al tratamiento con
solución gástrica y sus recuentos celulares sólo cayeron en 1.2 y 0.9 ordenes log.,
respectivamente.
142
Resultados
Tabla 13- Pérdida de viabilidad celular para los aislamientos intestinales en solución gástrica (pH3,
37ºC, 3h), expresada como disminución en los recuentos (ordenes log).
Aislamiento Recuento Recuento Reducción Reducción Reducción

Individuo
inicial final Sol. Gástrica(2) Control(2) Neta(3)

Sol. Gástrica(1) Sol. Gástrica(1) (log UFC ml-1) (log UFC ml-1) (log UFC ml-1)
(log UFCml-1) (log UFC ml-1)
F3 9.97 ± 0.11 3.99 ± 0.55 5.98 0.11 5.87

F16 10.41 ± 0.20 8.07 ± 0.41 2.34 0.10 2.24
1 F20 9.57 ± 0.35 7.76± 0.40 1.81 0.04 1.77
F21 9.67 ± 0.19 7.40 ± 0.11 2.27 0.16 2.11
F22 8.79 ± 0.07 6.78 ± 0.35 2.01 0.24 1.77
2 F30 9.68 ± 0.10 7.70 ± 0.10 1.98 0.16 1.82
F37 9.12 ± 0.22 4.63 ± 0.10 4.49 0.21 4.28
F37’ 9.69 ± 0.02 4.22 ± 0.32 5.46 0.22 5.24
3
F37’a 8.54 ± 0.34 4.10 ± 0.18 4.44 0.08 4.36
F37” 10.21± 0.05 4.76 ± 0.51 5.45 0.07 5.38
F44 9.86 ± 0.29 5.88 ± 0.10 3.98 0.16 3.82
F49 8.81 ± 0.47 6.15 ± 0.31 2.66 0.25 2.41
F50 8.48 ± 0.43 5.21 ± 0.61 3.27 0.14 3.13
F53 9.77 ± 0.30 7.18 ± 0.26 2.59 0.04 2.55
F56 9.47 ± 0.56 4.78 ± 0.21 4.70 0.22 4.48
F57 10.23 ± 0.12 7.48 ± 0.43 2.76 0.27 2.49
4 F57* 9.83 ± 0.36 4.21 ± 0.19 5.61 0.17 5.44
F58ch 8.70 ± 0.28 7.46 ± 0.11 1.24 0.06 1.18
F62 8.73 ± 0.25 4.60 ± 0.41 4.13 0.10 4.03
F63 9.07 ± 0.07 7.09 ± 0.44 1.98 0.11 1.87
F64 9.39 ± 0.10 8.29 ± 0.36 1.11 0.16 0.95
F64’ 9.37 ± 0.10 4.40 ± 0.31 4.98 0.21 4.77
F65 9.91 ± 0.16 4.31 ± 0.41 5.60 0.33 5.27
F67 9.37 ± 0.09 2.55 ±0.17 6.82 0.21 6.61
F68a 9.75 ± 0.14 4.41 ± 0.11 5.34 0.16 5.18
F68b 9.92 ± 0.18 4.91 ± 0.15 5.01 0.27 4.74
F70 9.30 ± 0.09 4.61 ± 0.18 4.68 0.14 4.54
F71 9.64 ± 0.06 5.30 ± 0.21 4.34 0.14 4.20
F73 9.63 ± 0.13 4.57 ± 0.66 5.07 0.16 4.91
5 F74 8.98 ± 0.14 4.08 ± 0.07 4.90 0.37 4.53
F75 9.66 ± 0.11 4.07 ± 0.09 5.58 0.05 5.53
F77 9.31 ± 0.15 4.08 ± 0.07 5.23 0.14 5.09
F78 9.92 ± 0.13 6.61 ± 0.47 3.31 0.19 3.12
F79 9.70 ± 0.35 3.73 ± 0.06 5.97 0.15 5.82
F80 9.44 ± 0.14 4.88 ± 0.46 4.57 0.35 4.22
F81 9.39 ± 0.10 6.31 ± 0.10 3.08 0.20 2.88
F83 9.81 ± 0.10 3.68 ± 0.03 6.14 0.15 5.99
(1)
Recuentos bacterianos expresados como promedio ± desviación standard
(2)
Reducción (log UFC ml-1) = (Recuento inicial – Recuento final), para recuentos de Sol Gástrica y de Control.
(3)
Reducción Neta (log UFC ml-1) = (Reducción Sol. Gástrica – Reducción Control)
143
Resultados
Tabla 13- Pérdida de viabilidad celular para los aislamientos intestinales en solución gástrica (pH3,
37ºC, 3h), expresada como disminución en los recuentos (ordenes log) (continuación).
Aislamiento Recuento Recuento

Individuo
Reducción Reducción Reducción

inicial final Sol. Gástrica (2)
Control(2) Neta(3)
Sol. Gástrica(1) Sol. Gástrica(1) (log UFC ml-1) (log UFC ml-1) (log UFC ml-1)
(log UFCml-1) (log UFC ml-1)
F84 9.73 ± 0.11 7.08 ± 0.26 2.65 0.06 2.59

F85 9.08 ± 0.14 4.18 ± 0.26 4.90 0.12 4.78
6
F86 8.94 ± 0.13 3.71 ± 0.02 5.23 0.08 5.15
F93 8.86 ± 0.05 4.22 ± 0.09 4.64 0.13 4.51
F94 8.72 ± 0.09 5.32 ± 0.15 3.40 0.11 3.29
F95 9.59 ± 0.10 5.17 ± 0.18 4.41 0.04 4.37
(1)
Recuentos bacterianos expresados como promedio ± desviación standard
(2)
Reducción (log UFC/ml) = (Recuento inicial – Recuento final), para recuentos de Sol Gástrica y de Control.
(3)
Reducción Neta (log UFC ml-1) = (Reducción Sol. Gástrica – Reducción Control)
144
Resultados
Los controles de todos los aislamientos se mantuvieron sin cambios significativos (p >
0.05), de manera tal que, las caídas en los recuentos celulares pueden considerarse en práctica,
sólo consecuencia del tratamiento con la solución gástrica.
4.4.2 Cinética de muerte celular de los aislamientos en solución
gástrica.
Como puede observarse en la Figura 7, la pérdida de viabilidad celular del
Lactobacillus gasseri F37 se produjo de manera progresiva durante las 3h de tratamiento.
La Figura 8, muestra los resultados obtenidos para Lactobacillus gasseri F37’. En este
caso no se registró una caída significativa en los recuentos durante los primeros 30 minutos,
para luego caer abruptamente 3 ordenes log. durante la siguiente media hora y
aproximadamente 2 ordenes log. adicionales durante las restantes 2 h.
Para las cepas Lactobacillus gasseri F37’a y F37’’, los resultados del tratamiento gástrico
se observan en las Figuras 9 y 10, respectivamente. Para ambos, la pérdida de viabilidad
celular fue muy importante (5.5 y 4.5 ordenes log., respectivamente) y progresiva durante las
3 h de exposición.
La Figura 11 muestra los resultados obtenidos para Lactobacillus rhamnosus F64. Se
puede apreciar que su escasa pérdida de viabilidad celular se produjo muy lentamente a lo
largo del tiempo de tratamiento.
Para Lactobacillus rhamnosus F83 (Figura 12), podríamos considerar que su pérdida de
viabilidad celular a lo largo del tratamiento gástrico se produjo en dos etapas. Durante los
145
Resultados
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 7- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37 en solución gástrica (37ºC, 3h, pH 3)
() y en buffer fosfato (control,  ), (valores medios de 3 determinaciones).
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 8- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37’ en solución gástrica (37ºC, 3h, pH3)
() y en buffer fosfato (control, ), (valores medios de 3 determinaciones).
Resultados
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 9- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37’a en solución gástrica (37ºC, 3h, pH3)
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 10- Cinética de muerte celular de Lactobacillus gasseri F37” en solución gástrica (37ºC, 3h, pH3)
Resultados
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 11- Cinética de muerte celular de Lactobacillus rhamnosus F64 en solución gástrica (37ºC, 3h,
pH3) () y en buffer fosfato (control, ), (valores medios de 3 determinaciones).
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 12- Cinética de muerte celular de Lactobacillus rhamnosus F83 en solución gástrica (37ºC, 3h,
pH3) () y en buffer fosfato (control ), (valores medios de 3 determinaciones).
Resultados
primeros 60 minutos hubo una caída de 1.5 ordenes log. en sus recuentos celulares,
incrementándose significativamente la muerte celular a partir de este momento, alcanzando el
valor final de 5.5 ordenes log.
En cuanto a las cepas comerciales testeadas, la Figura 13 corresponde a Lactobacillus
acidophilus La5. En ella se observa un descenso progresivo de 3 ordenes log. en los recuentos
celulares, en el tiempo ensayado.
Por su parte, para Lactobacillus casei A13, los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 14. Los primeros 60 minutos fueron significativamente letales para el microorganismo,
ya que se produjo una fuerte caída en más de 3 ordenes log. en sus recuentos y luego de lo
cual los mismos se mantuvieron prácticamente invariables.
Como puede observarse en todas las Figuras, la pérdida de viabilidad celular en los
experimentos control, no resultaron significativas (p > 0.05).
La inhibición del crecimiento bacteriano observado por el Ensayo de Difusión en Agar
(EDA) fue, en todos los casos, de tipo parcial.
De las cuatro concentraciones de bilis ensayadas, 0.15% (p/v) no produjo efecto
alguno sobre el desarrollo de los lactobacilos observándose los mismos resultados cuando se
ensayó 0.3% (p/v) para los aislamientos de los individuos 2, 3 y 6. Para los restantes
aislamientos, los halos de inhibición mostraron diámetros promedio de 0.5 ± 0.0 cm para el
individuo 1, 0.20 ± 0.041 cm para el individuo 4, y 0.13 ± 0.047 cm para el individuo 5. Para
149
Resultados
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 13- Cinética de muerte celular de Lactobacillus acidophilus La5 en solución gástrica (37ºC, 3h,
pH3) () y en buffer fosfato (control, ), (valores medios de 3 determinaciones).
12
11
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Fig. 14- Cinética de muerte celular de Lactobacillus casei A13 en solución gástrica (37ºC, 3h, pH3)
Resultados
0.6 % de bilis, los halos de inhibición resultaron de 0.6 ± 0.057cm para el individuo 1, 0.3 cm
 0.0 (individuo 2), 0.44 ± 0.061 cm (individuo 4), 0.47 ± 0.109 (individuo 5) y 0.48 ± 0.089
cm (individuo 6). Finalmente, para la concentración 1.0% (p/v) se observó una gran
heterogeneidad en los halos de inhibición. Para el individuo 1 el promedio de los diámetros
fue de 0.70 ± 0.119 cm, 0.5  0.0 cm (individuo 2), 0.64 ± 0.061 cm (individuo 4), 0.73 ±
0.141 cm (individuo 5) y 0.68 ± 0.134 cm (individuo 6). Resultó muy similar el
comportamiento de los aislamientos de los individuos 4, 5 y 6 frente a las concentraciones de
bilis ensayadas.
Las cuatro cepas de Lactobacillus gasseri demostraron ser prácticamente resistentes a
todas las concentraciones de bilis. Sólo se observó una ligera inhibición a 1.0% de bilis para
los aislamientos F37 y F37’.
La Tabla 14 muestra el tamaño de los halos de inhibición registrados para los
aislamientos estudiados.
Por considerar suficientes los datos disponibles hasta este momento de la
caracterización de los aislamientos, se realizó una evaluación comparativa entre éstos, para
cada individuo. Dado que algunas de ellas mostraban un perfil fenotípico y propiedades
bioquímicas idénticas, se descartaron algunos aislamientos para estudios posteriores,
manteniendo los siguientes:
Individuo 1: F3, F16,F20, F21 y F22.
Individuos 2 y 3: sin cambios.
Individuo 4: F44, F49, F50, F53, F56, F57, F57*, F58ch, F62, F63, F64 y F64’.
Individuo 5: F65, F67, F68a, F68b, F70, F71, F73, F74, F75, F77, F78, F79, F80, F81 y F83.
Individuo 6: F84, F85, F86, F93, F94 y F95.
151
Resultados
Tabla 14- Resistencia a la bilis de lactobacilos intestinales (Ensayo de Difusión en Agar - EDA).
Diámetros de halos de inhibición (cm) *

Individuo Aislamiento 0.15%** 0.30%** 0.60%** 1.0%**
F3 0.0 0.0 0.6 0.8

F16 0.0 0.0 0.0 0.5
F18 0.0 0.0 0.5 0.6
1 F19 0.0 0.0 0.6 0.6
F20 0.0 0.5 0.6 0.8
F21 0.0 0.0 0.6 0.8
F22 0.0 0.5 0.7 0.8
2 F30 0.0 0.0 0.3 0.5
F37 0.0 0.0 0.0 0.3

3 F37’ 0.0 0.0 0.0 0.3
F37’a 0.0 0.0 0.0 0.0
F37” 0.0 0.0 0.0 0.0
F44 0.0 0.2 0.4 0.7

F45 0.0 0.0 0.4 0.6
F46 0.0 0.0 0.6 0.6
F49 0.0 0.0 0.4 0.6
F50 0.0 0.2 0.4 0.7
F53 0.0 0.0 0.5 0.6
F56 0.0 0.3 0.5 0.6
F57 0.0 0.2 0.5 0.6
4
F57’ 0.0 0.2 0.5 0.7
F57* 0.0 0.2 0.5 0.6

F58g 0.0 0.2 0.4 0.6
F58ch 0.0 0.2 0.4 0.6
F62 0.0 0.2 0.4 0.8
F63 0.0 0.2 0.4 0.6
F64 0.0 0.1 0.4 0.7
F64’ 0.0 0.2 0.4 0.7
F65 0.0 0.2 0.4 0.6

5 F66 0.0 0.1 0.5 0.8
F67 0.0 0.1 0.5 0.6
F68a 0.0 0.2 0.4 0.5
*
diámetro halo de inhibición (cm) – diámetro del hoyo (cm) (valor medio de 3 determinaciones).
**
Concentraciones de bilis ensayadas.
152
Resultados
Tabla 14- Resistencia a la bilis de lactobacilos intestinales (Ensayo de Difusión en Agar - EDA)
(continuación).
Diámetros de halos de inhibición (cm) *

Individuo Aislamiento 0.15%** 0.30%** 0.60%** 1.0%**
F68b 0.0 0.1 0.3 0.6

F69 0.0 0.1 0.6 0.7
F70 0.0 0.2 0.4 0.5
F71 0.0 0.2 0.3 0.5
F72 0.0 0.2 0.3 0.7
F73 0.0 0.1 0.5 0.6
F74 0.0 0.1 0.4 0.8
5 F75 0.0 0.1 0.4 0.7
F76 0.0 0.2 0.5 0.8
F77 0.0 0.3 0.3 0.9
F78 0.0 0.2 0.4 0.5
F79 0.0 0.1 0.4 0.6
F80 0.0 0.2 0.4 0.7
F81 0.0 0.2 0.5 0.7
F83 0.0 0.2 0.5 0.6
F84 0.0 0.0 0.5 0.6

F85 0.0 0.0 0.5 0.8
F86 0.0 0.0 0.4 0.7
6 F90 0.0 0.0 0.5 0.7
F93 0.0 0.0 0.4 0.6
F94 0.0 0.0 0.4 0.5
F95 0.0 0.0 0.5 0.8
*
**
Concentraciones de bilis ensayadas.
153
Resultados
Se observó un desarrollo normal de colonias para todos los aislamientos en los medios
adicionados de taurocolato y taurodeoxicolato de sodio. Sin embargo, sólo los cuatro
aislamientos de Lactobacillus gasseri manifestaron actividad de deconjugación y
precipitación de estos ácidos biliares, las cuales fueron intensas en el caso del
taurodeoxicolato de sodio y moderada para el taurocolato de sodio.
También se observó un desarrollo normal para casi todos los aislamientos en el medio
adicionado de glicolato de sodio, si bien no se observó actividad de deconjugación y
precipitación del ácido biliar.
En el medio adicionado de glicodeoxicolato de sodio, no hubo desarrollo microbiano
para la mayoría de los lactobacilos y en aquellos donde se observó desarrollo, éste fue muy
débil. La actividad de deconjugación y precipitación del ácido biliar, también en este caso
estuvo ausente.
La Tabla 15 muestra los resultados obtenidos en este estudio.
154
Resultados
Tabla 15- Desarrollo de lactobacilos intestinales en presencia de ácidos biliares.
Aislamiento
MRS-TC (0.5%) MRS-TDC (0.5%) MRS-GC (0.5%) MRS-GDC (0.5%)
Individuo
Desarrolla Deconjuga Desarrolla Deconjuga Desarrolla Deconjuga Desarrolla Deconjuga
F3 + - + - + - + -
F16 + - + - + - d -
1 F20 + - + - + - d -
F21 + - + - + - d -
F22 + - + - + - d -
2 F30 + - + - + - + -
F37 + + + ++ + - d -
3 F37’ + + + ++ + - d -
F37’a + + + ++ + - d -
F37” + + + ++ + - d -
F44 + - + - + - - -
F49 + - + - - - - -
F50 + - + - + - - -
F53 + - + - + - - -
F56 + - + - + - - -
4 F57 + - + - + - - -
F57* + - + - + - - -
F58ch + - + - + - - -
F62 + - + - + - - -
F63 + - + - + - - -
F64 + - + - + - - -
F64’ + - + - + - - -
F65 + - + - + - + -
F67 + - + - + - - -
F68a + - + - + - + -
F68b + - + - + - + -
5 F70 + - + - + - + -
F71 + - + - + - + -
F73 + - + - + - + -
F74 + - + - + - d -
F75 + - + - + - + -
F77 + - + - + - - -
+ desarrolla o deconjuga, - no desarrolla o no deconjuga.

++ intensa deconjugación, d desarrollo débil.
MRS-TC: agar MRS-Taurocolato de sodio
MRS-TDC: agar MRS-Taurodeoxicolato de sodio
MRS-GC: agar MRS-Glicolato de sodio
MRS-GDC: agar MRS-Glicodeoxicolato de sodio
155
Resultados
Tabla 15- Desarrollo de lactobacilos intestinales en presencia de ácidos biliares (continuación).
Aislamiento
MRS-TC (0.5%) MRS-TDC (0.5%) MRS-GC (0.5%) MRS-GDC (0.5%)
Individuo
Desarrolla Deconjuga Desarrolla Deconjuga Desarrolla Deconjuga Desarrolla Deconjuga
F78 + - + - + - + -
F79 + - + - + - d -
5 F80 + - + - + - d -
F81 + - + - + - + -
F83 + - + - + - + -
F84 + - + - + - - -
F85 + - + - + - - -
6 F86 + - + - + - - -
F93 + - + - + - - -
F94 + - + - + - - -
F95 + - + - + - - -
+ desarrolla o deconjuga, - no desarrolla o no deconjuga.

++ intensa deconjugación, d desarrollo débil.
MRS-TC: agar MRS-Taurocolato de sodio
MRS-TDC: agar MRS-Taurodeoxicolato de sodio
MRS-GC: agar MRS-Glicolato de sodio
MRS-GDC: agar MRS-Glicodeoxicolato de sodio
156
Resultados
Luego, las Figuras 15, 16, 17, 18 y 19 permiten observar diferentes tipos de
crecimiento por parte de los aislamientos en los distintos medios agarizados, y/o sus
actividades de deconjugación; como así también crecimiento sin deconjugación; e incluso
ausencia de crecimiento.
Para la totalidad de los aislamientos, se obtuvieron valores inferiores a 0.2 UM de
actividad -galactosidasa y por tanto se interpretó estos resultados como la falta de esta
actividad enzimática en las cepas. Sin embargo, se observó un desarrollo óptimo en leche con
coagulación de la misma (con excepción de Lactobacillus rhamnosus F67,F75, F76 y F77), lo
cual demostraría que los bacilos cuentan con otra enzima diferente de -galactosidasa para la
metabolización de la lactosa, posiblemente P--galactosidasa. En la Tabla 16 se muestran los
resultados obtenidos de actividad -galactosidasa para la totalidad de los aislamientos.
Para las cepas aisladas de los individuos 1 y 2, se obtuvieron porcentajes de
hidrofobicidad reducidos (entre 15% y 27%).
En cambio, para los cuatro aislamientos del individuo 3 los valores encontrados fueron
bastante diferentes a los anteriores y a su vez muy variables (entre 9% y 53%).
157
Resultados
F49
F44
F37
F37”
F37’
F37’a
Fig. 15- Características del crecimiento de Lact. gasseri F37, F37’, F37’a y F37” y Lact. rhamnosus F44 y
F49 en agar MRS-taurocolato de sodio 0.5%.
F50
F53
F37’
F49
F37’a
F44
Fig. 16- Características del crecimiento de Lact. gasseri F37’ y F37’a y Lact. rhamnosus F44, F49, F50, y
F53 en agar MRS-taurocolato de sodio 0.5%.
Resultados
F37’
F37’a
F37
F37”
F49
F44
F49 en agar MRS-taurodeoxicolato de sodio 0.5%.
F44
F49 F37”
F37
F37’a
F37’
F49 en agar MRS-glicolato de sodio 0.5%.
Resultados
F44
F49
F37”
F37
F37’a
F37’
F49 (ausencia de desarrollo) en agar MRS-glicodeoxicolato de sodio 0.5%.
Para el individuo 4, los porcentajes de hidrofobicidad variaron entre 18% y 36% (salvo
para la cepa F64, cuyo valor fue de casi 50%). Para el individuo 5, la mayoría de los
aislamientos mostraron valores entre 15% y 30% aproximadamente, con excepción de uno de
ellos (Lactobacillus rhamnosus F70) que demostró poseer una hidrofobicidad del 41%.
Finalmente, para el individuo 6, los valores estuvieron comprendidos entre un 16% y
28%.
La Tabla 17 muestra los valores de % de Hidrofobicidad calculado según fórmula (ver
3.6.3).
La Figura 20 muestra la interfase orgánica (n-hexadecano)/acuosa (caldo MRS) teñida
con Negro Sudán donde se observa la distribución de los bacilos entre ambas fases, en
relación a su porcentaje de hidrofobicidad.
160
Resultados
Tabla 16- Actividad de -Galactosidasa para lactobacilos intestinales (Método de Miller modificado)
(valores medios de 2 determinaciones).
Individuo Aislamiento Unidades Miller (UM)
F3 0.082
F16 0.087
1 F20 0.079
F21 0.084
F22 0.080
2 F30 0.078
F37 0.084
3 F37’ 0.090
F37’a 0.095
F37” 0.086
F44 0.088
F49 0.085
F50 0.087
F53 0.078
F56 0.074
4 F57 0.082
F57* 0.081
F58ch 0.080
F62 0.087
F63 0.087
F64 0.094
F64’ 0.097
F65 0.077
F67 0.076
F68a 0.103
F68b 0.111
F70 0.114
F71 0.101
F73 0.098
5 F74 0.095
F75 0.090
F77 0.099
F78 0.101
F79 0.089
F80 0.096
F81 0.091
F83 0.085
161
Resultados
Tabla 16- Actividad de -Galactosidasa para lactobacilos intestinales (Método de Miller modificado)
(valores medios de 2 determinaciones) (continuación).
Individuo Aislamiento Unidades Miller (UM)
F84 0.099
F85 0.092
6 F86 0.094
F93 0.095
F94 0.096
F95 0.092
162
Resultados
Tabla 17- Hidrofobicidad (%) de los aislamientos intestinales, medida luego de la partición de los
mismos entre la fase polar (caldo MRS) y no polar (n-hexadecano).
Individuo Aislamiento Hidrofobicidad (%)(*)
F3 27.04 ± 1.48
1 F16 25.08 ± 1.37
F20 15.04 ± 1.57
F21 19.43 ± 1.71
F22 23.48 ± 1.03
2 F30 27.15 ± 3.71
F37 53.15 ± 3.02
F37’ 9.21 ± 2.74
3 F37’a 38.29 ± 3.58
F37” 50.84 ± 6.97
F44 24.67 ± 2.48
F49 22.68 ± 3.09
F50 23.11 ± 1.72
F53 35.97 ± 1.93
F56 18.54 ± 2.53
F57 31.69 ± 3.03
4 F57* 23.43 ± 1.03
F58ch 21.76 ± 5.97
F62 35.79 ± 3.79
F63 26.46 ± 0.39
F64 49.51 ± 2.47
F64’ 33.04 ± 2.21
F65 27.62 ± 1.15
F67 24.67 ± 1.54
F68a 29.80 ± 3.38
F68b 24.56 ± 13.66
F70 41.06 ± 12.25
F71 16.69 ± 4.41
F73 26.20 ± 2.49
5 F74 16.00 ± 1.22
F75 17.82 ± 2.70
F77 17.90 ± 0.89
F78 21.77 ± 1.46
F79 24.16 ± 0.72
F80 22.09 ± 2.66
F81 21.20 ± 2.55
F83 14.87 ± 2.09
F84 27.89 ± 2.82
F85 26.11 ± 2.52
6 F86 26.28 ± 3.65
F93 16.54 ± 2.79
F94 16.09 ± 1.15
F95 25.98 ± 1.28
(*)
Hidrofobicidad expresada en porcentaje promedio ± desviación standard (n= 3).
163
Resultados
Fase orgánica
Fase acuosa
Fig. 20- Observación microscópica de la distribución de un lactobacilo intestinal entre las fases
orgánica y acuosa (contraste de fases, 1000 x).
4.5.4. Inhibición de bacterias patógenas.
Prácticamente todos los aislamientos demostraron tener algún efecto inhibitorio frente
a las cuatro bacterias indicadoras patógenas usadas.
Frente a Salmonella OMS-Ca, todos los lactobacilos, excepto Lactobacillus
rhamnosus F83 (que no mostró efecto alguno) demostraron un poder inhibitorio total, con un
diámetro promedio de los halos de inhibición de 0.94  0.23 cm.
Frente a Staphylococcus aureus 76, se observó en la mayoría de los casos una
inhibición de tipo parcial, siendo el diámetro promedio de los halos registrados de 0.81  0.27
164
Resultados
cm. Sólo hubo un caso de inhibición total entre los aislamientos del individuo 3
(Lactobacillus gasseri F37), dos para el individuo 4 (Lactobacillus rhamnosus F53 y F64), dos
para el individuo 6 (Lactobacillus rhamnosus F93 y F95).
Frente a Escherichia coli V517, y exceptuando los Lactobacillus rhamnosus F84, F85 y
F86, que ejercieron un poder inhibitorio parcial, el resto de los aislamientos demostró un
efecto inhibitorio total, con diámetros para los halos de inhibición formados, de 0.73  0.24
cm.
Con respecto a Listeria monocytógenes ATCC 15313, la mayoría de los aislamientos
ejercieron un efecto inhibitorio total, con excepción de Lactobacillus rhamnosus F70 y F86 que
no lo evidenciaron. Para los primeros, el promedio del diámetro de los halos fue de 0.99 
0.27 cm.
La Tabla 18 muestra los resultados obtenidos en el Ensayo de Difusión en Agar (EDA)
empleado para evaluar el poder inhibitorio de los lactobacilos intestinales frente a las
bacterias patógenas usadas.
La Figura 21 muestra una observación macroscópica del EDA donde se ensayaron
cinco SLC de los lactobacilos intestinales frente a Staphylococcus aureus 76 (pátina).
165
Resultados
Tabla 18- Poder inhibitorio de los aislamientos intestinales frente a Salmonella OMS-Ca, Staphylococcus aureus
76, Escherichia coli V517 y Listeria monocytógenes ATCC 15313 (Método EDA).
Diámetro halos de inhibición (cm)(1)

Individuo SLC del
Salmonella Staphylococcus Escherichia coli Listeria
aislamiento
OMS-Ca aureus Nº76 V517 monocytógenes
ATCC Nº15313
F3 1.08t 0.82p 0.80t 1.17t

1 F16 1.19t 0.91p 0.91t 1.49t
F20 1.04t 1.06p 0.69t 1.89t
F21 0.89t 0.63p 0.49t 0.62t
F22 1.00t 0.83p 0.90t 0.90t
2 F30 1.18t 0.97p 0.81t 1.03t
F37 1.42t 1.07t 1.06t 1.05t
F37’ 0.84t 0.68p 0.86t 0.91t
3
F37’a 1.09t 1.05p 0.85t 1.12t
F37” 0.83t 0.84p 0.67t 0.59t
F44 0.85t 0.61p 0.74t 0.77t
F49 0.44t 0.00 0.42t 0.55t
F50 0.66t 0.59p 0.21t 0.90t
F53 1.17t 0.69t 0.97t 1.07t
F56 1.07t 1.17p 0.60t 1.14t
F57 0.95t 1.25p 0.77t 0.99t
4 F57* 0.84t 1.12p 0.80t 0.95t
F58ch 0.92t 0.96p 0.84t 0.90t
F62 0.82t 1.12p 0.87t 1.13t
F63 1.02t 1.09p 0.88t 1.08t
F64 1.35t 1.17t 1.32t 1.30t
F64’ 1.11t 0.21p 0.64t 1.41t
F65 1.16t 0.93p 0.83t 1.46t
F67 0.96t 1.02p 0.93t 1.53t
F68a 1.07t 0.92p 0.92t 1.38t
F68b 0.97t 0.78p 0.90t 1.52t
F70 0.34t 0.00 0.21t 0.00
F71 1.13t 0.40p 0.75t 0.88p
F73 0.65t 0.16p 0.59t 0.73t
5 F74 0.92t 0.49p 0.85t 1.15t
F75 1.23t 0.80p 0.95t 1.26t
F77 1.12t 0.83p 0.99t 1.20t
F78 1.06t 0.75p 0.83t 0.90t
F79 0.75t 0.22p 0.63t 0.66t
F80 1.14t 0.00 0.65t 1.06t
F81 0.90t 0.83p 0.75t 1.08t
F83 0.00 0.00 0.87t 0.68t
(1)
p
halos de inhibición parcial. t halos de inhibición total. SLC Sobrenadante Libre de Células.
166
Resultados
Tabla 18- Poder inhibitorio de los aislamientos intestinales frente a Salmonella OMS-Ca, Staphylococcus aureus
76, Escherichia coli V517 y Listeria monocytógenes ATCC 15313 (Método EDA) (continuación).

Individuo SLC del
Salmonella Staphylococcus Escherichia coli Listeria
aislamiento
OMS-Ca aureus Nº76 V517 monocytógenes
ATCC Nº15313
F84 0.74t 0.00 0.49p 0.67t
F85 0.82t 0.00 0.45p 0.61t
6 F86 0.40t 0.00 0.50p 0.00
F93 0.84t 0.56t 0.19t 0.89t
F94 0.95t 0.00 0.38t 0.74t
F95 0.68t 0.75t 0.45t 0.56t
(1)
p
halos de inhibición parcial. t halos de inhibición total. SLC Sobrenadante Libre de Células.
167
Resultados
F3
F37” F44
F37’ F64’
Fig. 21- Capacidad inhibitoria de Lact. gasseri F37’, F37” y Lact. rhamnosus F3, F44 y F64’ frente a
Staphylococcus aureus 76 (Método EDA).
Se observó un desarrollo normal para la totalidad de los lactobacilos aislados en los
medios de cultivo a pH 5.0 y 5.5. En cambio, para pH 4.5 se obtuvieron resultados muy
dispares, ya que aproximadamente el 50% del total de los aislamientos de cada individuo
mostró un desarrollo débil en esas condiciones.
La Tabla 19 muestra los resultados obtenidos en este ensayo.
168
Resultados
Tabla 19- Resistencia al pH, sales y compuestos de aroma de lactobacilos intestinales (Método
Desarrollo en Medio Líquido-DML).
Individuo Aislamiento pH NaCl (% p/v) KCl (%p/v) Diacetilo (ppm) Acetaldehído (ppm)
4.5 5.0 5.5 1.0 2.0 3.0 1.0 2.0 3.0 1000 2500 1000 2500
F3 + + + + + + + + + - - + -
F16 d + + + + + + + + - - + d
1 F20 d + + + + + + + + - - + -
F21 + + + + + + + + + - - + -
F22 + + + + + + + + + d - + d
2 F30 + + + + + + + + + + - + -
F37 d + + + + + + + + - - d -
3 F37’ + + + + + + + + + - - d -
F37’a + + + + + + + + + + d + d
F37” - + + + + + + + + - - + -
F44 + + + + + + + + + + d + d
F49 + + + + + + + + + - - + -
F50 + + + + + + + + + + - + d
F53 + + + + + + + + d d - + d
F56 + + + + + + + + + - - + -
4 F57 d + + + + + + + + - - + d
F57* + + + + + + + + + - - + d
F58ch + + + + + + + + + - - + -
F62 d + + + + + + + + + - + d
F63 + + + + + + + + + + d + d
F64 + + + + + + + + + + d + d
F64’ d + + + + + + + + + - + d
F65 d + + + + + + + + + d + +
F67 d + + + + + + + + + d + d
F68a + + + + + + + + + + d + +
F68b d + + + + + + + + + - + -
F70 + + + + + + + + + + d + d
5 F71 d + + + + + + + + + - + +
F73 + + + + + + + + + + - + +
F74 d + + + + + + + + + - + +
F75 + + + + + + + + + + - + d
F77 + + + + + + + + + + - + d
F78 d + + + + + + + + - - + -
F79 + + + + + + + + + + - + d
- Ausencia de desarrollo, d desarrollo débil, + desarrollo normal.

169
Resultados
Tabla 19- Resistencia al pH, sales y compuestos de aroma de lactobacilos intestinales (Método
Desarrollo en Medio Líquido-DML) (continuación).
Individuo Aislamiento pH NaCl (% p/v) KCl (%p/v) Diacetilo (ppm) Acetaldehído (ppm)
4.5 5.0 5.5 1.0 2.0 3.0 1.0 2.0 3.0 1000 2500 1000 2500
F80 d + + + + + + + + d - + -
5 F81 + + + + + + + + + + - + d
F83 + + + + + + + + + + d + +
F84 + + + + + + + + + + - + +
F85 d + + + + + + + + + - + +
6 F86 + + + + + + + + + + - + +
F93 + + + + + + + + + + - + d
F94 + + + + + + + + + - - + d
F95 d + + + + + + + + + - + +
- Ausencia de desarrollo, d desarrollo débil, + desarrollo normal.
170
Resultados
Los aislamientos no fueron afectados en su desarrollo por la presencia de las sales
NaCl y KCl, a las concentraciones de 1%, 2% y 3 %(p/v). La Tabla 19 muestra los resultados
obtenidos en este ensayo.
Tanto para el diacetilo como acetaldehído, se observó un importante efecto inhibidor
en el desarrollo de los lactobacilos intestinales a la concentración de 2500 ppm, para la cual se
obtuvieron resultados de desarrollo débil e inhibición completa del mismo para la mayoría de
los aislamientos (tanto Lactobacillus rhamnosus como Lactobacillus gasseri), con excepción
de Lactobacillus rhamnosus F65, F68a, F71,F73, F74 y F83 (individuo 5) y Lactobacillus
rhamnosus F84, F85, F86 y F95 (individuo 6), los cuales demostraron un desarrollo óptimo a
2500 ppm para el compuesto acetaldehído. Para la mayoría de los lactobacilos el diacetilo en
la concentración de 1000 ppm resultó ser mucho más inhibitorio del desarrollo celular que el
acetaldehído a la misma concentración.
La Tabla 19 muestra los resultados obtenidos en este ensayo.
171
Resultados
conservada a 5ºC.
Para la mayoría de los aislamientos se obtuvo una buena sobrevida en leche para las
condiciones estudiadas de pH y temperatura. Todas las caídas registradas en los recuentos
celulares, respecto a sus controles, fueron inferiores a 1 orden log. En algunos casos se
observó desarrollo celular, obteniéndose diferencias negativas (inferiores a 1 orden log.). Un
comportamiento opuesto manifestó el aislamiento F53 del individuo 4, ya que a pH 4 su
recuento celular disminuyó más de 6 ordenes log.
La Tabla 20 resume los resultados obtenidos para la sobrevida de los lactobacilos
intestinales bajo las condiciones antes mencionadas. En la sección Anexo la Tabla 24 muestra
de manera más detallada los resultados de los recuentos expresados en órdenes logarítmicos y
sus respectivas variaciones al cabo de cuatro semanas de refrigeración.
de starters.
4.6.5.a Evaluación del efecto producido por SLC de lactobacilos intestinales
sobre el desarrollo de bacterias lácticas de starters.
No se observó actividad inhibitoria alguna (Ensayo de Difusión en Agar) del SLC de
172
Resultados
Tabla 20- Sobrevida de los lactobacilos intestinales en leche acidificada a 5ºC (valores medios de 2
determinaciones).
Diferencia C(1) Diferencia pH4(2) Diferencia pH 5(3)

Individuo Aislamiento (log UFC ml-1) (log UFC ml-1) (log UFC ml-1)
F3 0.15 0.24 0.15

F16 0.40* 0.19 0.25
1 F20 0.17 0.69* 0.43*
F21 0.30 0.20 0.53
F22 0.07 0.34 0.19
2 F30 0.25* 0.16* 0.23*
F37 0.93 0.76 0.75
F37’ 0.30 0.12 0.19
3 F37’a 0.44 0.24 0.72
F37” 0.19 0.38* 0.04
F44 0.17 0.09 0.22
F49 0.22* 0.01* 0.12*
F50 0.19 0.04* 0.18
F53 0.48* 6.39 0.53*
F56 0.36* 0.20* 0.20*
F57 0.44 0.22 0.60
4 F57* 0.40 0.39 0.23
F58ch 0.42* 0.31* 0.37*
F62 0.16* 0.14* 0.03*
F63 0.18* 0.06* 0.05*
F64 0.36 0.02 0.04*
F64’ 0.03 0.17* 0.03*
F65 1.20* 1.15* 1.10*
F67 0.07* 0.04* 0.04
F68a 0.14* 0.23* 0.22*
F68b 0.31* 0.07 0.07*
F70 0.14* 0.07* 0.21*
F71 0.12 0.38 0.49
F73 0.08* 0.09* 0.08*
5 F74 0.06* 0.50* 0.27*
F75 0.94 0.12 0.15*
F77 0.23 0.35 0.60
F78 0.06* 0.10* 0.18
F79 0.67 0.11* 0.04
F80 0.14* 0.33* 0.24*
F81 0.14 0.29* 0.12
F83 0.42 0.35 0.44
F84 0.12* 0.14 0.10
F85 0.37* 0.13* 0.36*
F86 0.19* 0.50* 0.58*
6 0.62 0.78* 0.16*
F93
F94 1.22 0.36 0.29
F95 0.16* 0.27* 0.13
(1)
Diferencia entre los recuentos correspondientes a t 30 días y t 0 días para el Control,(2) pH 4 y (3) pH 5.
*
Incremento en los recuentos.
173
Resultados
todos los lactobacilos intestinales frente a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 y
Hb2. En cambio, se registraron halos de inhibición de diferentes diámetros cuando se los
enfrentó a las demás especies de bacterias lácticas.
Tanto para Lactococcus lactis A6 y Mo12 como para Streptococcus thermophilus 176
y A4, prácticamente todos los lactobacilos ejercieron un efecto de inhibición parcial del
crecimiento con halos promedios de 0.90  0.09cm y 0.75  0.17 cm para las 2 cepas de
lactococos, y 1.41  0.17 cm y 1.31  0.19 cm para los estreptococos, respectivamente. Sin
embargo, hubo tres aislamientos del individuo 6 que no produjeron efecto alguno sobre
Lactococcus lactis Mo12 y dos de ellos tampoco ejercieron efecto alguno sobre el crecimiento
de Lactococcus lactis A6.
La Tabla 21 muestra los efectos producidos por el SLC de los lactobacilos intestinales
sobre el desarrollo de las bacterias lácticas.
4.6.5.b Evaluación del efecto producido por SLC de Lact. delbrueckii subsp.
bulgaricus Ab1, Strep. thermophilus 176 y L. lactis Mo12 sobre el
desarrollo de lactobacilos intestinales.
Al estudiar la presencia de agentes inhibidores en SLC de las bacterias lácticas de
starters sobre el desarrollo de los lactobacilos intestinales, no se detectó efecto alguno.
174
Resultados
Tabla 21- Poder inhibitorio de SLC de los aislamientos intestinales sobre el crecimiento de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 y Hb2, Lactococcus lactis A6 y Mo12 y
Streptococcus thermophilus 176 y A4 (Método EDA).

SLC del Lact. delbrueckii Lact. delbrueckii L. lactis L. lactis Streptococcus Streptococcus
Individuo aislamiento subsp. subsp. bulgaricus A6 Mo12 thermophilus 176 thermophilus A4
bulgaricus Ab1 Hb2
F3 0.00 0.00 0.96 1.02 1.26 1.40

F16 0.00 0.00 0.82 1.08 1.12 1.35
1 F20 0.00 0.00 0.83 0.61 1.48 1.22
F21 0.00 0.00 0.91 0.95 1.63 1.30
F22 0.00 0.00 1.02 0.68 1.41 1.30
2 F30 0.00 0.00 0.95 0.66 1.38 1.24
F37 0.00 0.00 0.97 1.00 1.73 1.59
F37’ 0.00 0.00 0.90 0.82 1.59 1.31
3 F37’a 0.00 0.00 0.93 0.75 1.68 1.48
F37” 0.00 0.00 0.74 0.38 1.33 1.06
F44 0.00 0.00 0.83 0.77 1.41 1.59
F49 0.00 0.00 0.96 0.54 1.33 1.45
F50 0.00 0.00 0.92 0.76 1.28 1.40
F53 0.00 0.00 0.80 0.90 1.49 1.26
F56 0.00 0.00 1.05 0.79 1.45 1.16
F57 0.00 0.00 0.86 0.34 1.26 1.25
4
F57* 0.00 0.00 0.68 0.00 1.39 1.43
F58ch 0.00 0.00 0.91 1.08 1.89 1.44
F62 0.00 0.00 0.77 0.52 1.40 1.38
F63 0.00 0.00 0.84 0.47 1.23 1.32
F64 0.00 0.00 0.92 0.65 1.50 1.16
F64’ 0.00 0.00 0.85 0.89 1.46 1.26
F65 0.00 0.00 1.10 0.95 1.47 1.27
F67 0.00 0.00 0.98 0.76 1.46 1.52
F68a 0.00 0.00 0.86 0.69 1.17 1.11
F68b 0.00 0.00 0.98 0.92 1.24 1.30
F70 0.00 0.00 0.83 0.96 1.37 1.02
F71 0.00 0.00 0.75 0.61 1.41 1.13
F73 0.00 0.00 0.72 0.85 1.27 1.38
5 F74 0.00 0.00 0.92 0.68 1.13 1.23
F75 0.00 0.00 0.94 0.78 1.78 1.54
F77 0.00 0.00 1.03 0.74 1.60 1.19
F78 0.00 0.00 1.02 0.90 1.59 1.57
F79 0.00 0.00 0.84 0.83 1.23 1.45
F80 0.00 0.00 0.86 0.67 1.32 1.21
F81 0.00 0.00 0.90 0.69 1.53 1.94
F83 0.00 0.00 0.87 0.68 1.34 1.04
F84 0.00 0.00 0.00 0.00 1.28 1.21
F85 0.00 0.00 0.94 0.00 1.31 1.14
F86 0.00 0.00 0.00 0.00 1.10 0.80
6 F93 0.00 0.00 0.99 0.50 1.34 1.17
F94 0.00 0.00 0.00 0.77 1.41 1.35
F95 0.00 0.00 0.93 0.58 1.36 1.37
(1)
175
Resultados
4.6.5.c Determinación de la naturaleza del agente inhibidor presente en SLC
de Lact. gasseri F37” frente a Strept. thermophilus 176, Lact.
delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 y Lactococcus lactis Mo12.
Como puede observarse en la Figura 22, el inhibidor encontrado en el SLC del
Lactobacillus gasseri F37” sobre el crecimiento de Strept. thermophilus 176 es de naturaleza
ácida ya que en las situaciones donde se evaluó la presencia de compuestos termosensibles y
de naturaleza proteica, al neutralizar la posible presencia de éstos el bacilo igualmente fue
inhibido; en cambio cuando se trató el SLC con un álcali no se registró dicho efecto.
Por otro lado, la Figura 23 muestra los resultados obtenidos cuando se adicionó SLC
de este mismo lactobacilo intestinal a un cultivo de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus Ab1. En este caso, puede apreciarse una contribución mayor en el efecto inhibidor
por parte de sustancias de naturaleza proteica (probablemente bacteriocinas) y, en menor
medida, por ácidos orgánicos.
La Figura 24 muestra los resultados obtenidos al ensayar el SLC de Lactobacillus
gasseri F37” frente a Lactococcus lactis Mo12. En ella se aprecia claramente, que el agente
responsable de la inhibición de crecimiento del lactococo es un compuesto de naturaleza
ácida, producto del metabolismo del lactobacilo intestinal.
176
Resultados
1.8
1.6
1.4
1.2
DO (560 nm)
1
0.8
0.6
0.4
0.2 1 2 3 4 5
0
Fig. 22- Naturaleza del agente inhibidor del SLC de Lactobacillus gasseri F37” sobre el crecimiento de
Streptococcus thermophilus 176. (1) Control estreptococo, (2) estreptococo y SLC tal cual, (3)
estreptococo y SLC tratado térmicamente, (4) estreptococo y SLC tratado con pepsina y (5)
estreptococo y SLC adicionado de NaOH (37ºC, 24h) (valores medios de 2 determinaciones).
1.75
1.5
1.25
DO (560 nm)
0.75
0.5
0.25 1 4
2 3 5
0
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1. (1) Control lactobacilo, (2) lactobacilo y SLC tal
cual, (3) lactobacilo y SLC tratado térmicamente, (4) lactobacilo y SLC tratado con pepsina y (5)
lactobacilo y SLC adicionado de NaOH (37ºC, 24h) (valores medios de 2 determinaciones).
Resultados
1.6
1.4
1.2
1
DO (560 nm)
0.8
0.6
0.4
0.2 5
1 2 3 4
0
Lactococcus lactis Mo12. (1) Control lactococo, (2) lactococo y SLC tal cual, (3) lactococo y SLC
tratado térmicamente, (4) lactococo y SLC adicionado de NaOH y (5) lactococo y SLC tratado con
pepsina (37ºC, 24h) (valores medios de 2 determinaciones).
Resultados
3.6.5.d Efecto de SLC de Lactobacillus gasseri F37” y Lactobacillus rhamnosus
F71 frente a bacterias lácticas de starters (cinéticas de crecimiento).
La Figura 25 muestra la cinética de crecimiento de Streptococcus thermophilus 176,
en presencia y ausencia del SLC de Lactobacillus gasseri F37”. Comparando ambas curvas
puede observarse que el SLC del lactobacilo intestinal produjo una inhibición total sobre el
desarrollo del streptococo. Por el contrario, la Figura 26 muestra que cuando se agregó el SLC
del streptococo al cultivo de Lactobacillus gasseri F37”, no se registró efecto alguno sobre el
desarrollo.
La Figura 27 por su parte, muestra la cinética de crecimiento de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 con y sin agregado del SLC del Lactobacillus gasseri F37”.
En este caso, también se produjo una inhibición total por parte del lactobacilo intestinal sobre
el desarrollo del lactobacilo de origen comercial. La situación inversa, que se muestra en la
Figura 28, en cambio muestra que éste último lactobacilo sólo produce un leve efecto
inhibitorio sobre el desarrollo de Lactobacillus gasseri F37”.
En la Figura 29 se observa el efecto producido por el agregado del SLC de
Lactobacillus rhamnosus F71 a un cultivo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1,
el cual se manifestó como un retardo en el crecimiento del lactobacilo comercial (es decir una
inhibición parcial) pero que se revierte al cabo de las 20 h de incubación aproximadamente ya
que a las 24h se obtuvo una D.O. que incluso superó a la correspondiente al control
(lactobacilo comercial sin SLC). Por otro lado, la Figura 30 muestra resultados muy similares
para la situación inversa. Es decir que, también el agregado de SLC del lactobacilo comercial
ha producido una inhibición parcial en el desarrollo del lactobacilo intestinal.
179
Resultados
1.5
DO 560 nm
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)
Fig. 25- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Streptococcus thermophilus 176 control () y con
adición de SLC de Lactobacillus gasseri F37” () (37ºC, 24h), (valores medios de 3 determinaciones).
2.5
2
DO 560 nm
1.5
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)
Fig. 26- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lactobacillus gasseri F37” control () y con
adición de SLC de Streptococcus thermophilus 176 () (37ºC, 24h), (valores medios de 3
determinaciones).
Resultados
2.5
DO 560 nm 2
1.5
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)
Fig. 27- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1
control () y con adición de SLC de Lactobacillus gasseri F37” () (37ºC, 24h), (valores medios de 3
determinaciones).
2.5
2
DO560 nm
1.5
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)
Fig. 28- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lactobacillus gasseri F37” control () y con
adición de SLC de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 () (37ºC, 24h), (valores medios
de 3 determinaciones).
Resultados
2.5
2
DO 560 nm
1.5
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)
Fig. 29- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1
control () y con adición de SLC de Lactobacillus rhamnosus F71 () (37ºC, 24h), (valores medios de 3
determinaciones).
2.5
2
DO560 nm
1.5
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)
Fig. 30- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lactobacillus rhamnosus F71 control () y con
adición de SLC de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 () (37ºC, 24h), (valores medios
de 3 determinaciones).
Resultados
Finalmente, el efecto producido por el agregado de SLC de Lactobacillus gasseri F37” a un

cultivo de Lactococcus lactis Mo12 puede observarse en la Figura 31. En ella vemos que, al
igual que en la Figura 25, el agregado del SLC del lactobacilo intestinal produce una
inhibición total de desarrollo sobre el lactococo, no habiéndose registrado efecto alguno
cuando se investigó la situación inversa (datos no mostrados).
1.75
1.5
1.25
1
DO560 nm
0.75
0.5
0.25
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)
Fig. 31- Cinéticas de crecimiento correspondientes a Lactococcus lactis Mo12 control () y con
adición de SLC de Lactobacillus gasseri F37” () (37ºC, 24h), (valores medios de 3 determinaciones).
158
Discusión
5.1 Identificación de las cepas aisladas.
Determinados géneros de bacterias gram (+) y catalasa (-), algunas productoras de
ácido láctico a partir de la fermentación de la glucosa, constituyen la microflora normal del
TGI humano. Dentro de ésta, se encuentran los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium (1).
En el presente trabajo se obtuvieron, inicialmente, 54 aislamientos de heces de bebés
alimentados con leche materna, que respondieron a las características morfológicas de interés
(bacilos gram (+), catalasa (-)). Al comparar los perfiles de fermentación de carbohidratos de
nuestros aislamientos con los patrones de fermentación de carbohidratos para Lactobacillus
(Manual de Bergey) (ver Anexo Tabla 22 y Tabla 23), se asignó a los mismos la
identificación de Lactobacillus del grupo 1 (aislamientos del individuo 3) y Lactobacillus del
grupo casei a los demás aislamientos de los restantes individuos. Comparando los perfiles
RAPD-PCR de los aislamientos estudiados, pero separadamente por individuo, se encontraron
coeficientes de similitud elevados para las cepas obtenidas de los individuos 1, 2 y 3. De este
modo, se obtuvo 1 cepa determinada para dichos individuos. Para los 6 aislamientos del
individuo 4, se reconocieron 2 cepas diferentes cada una con 3 aislamientos; para el individuo
5, 1 cepa con 3 aislamientos y otra cepa diferente (F70); finalmente para el individuo 6, 2
cepas diferentes, cada una con 2 aislamientos
Reniero y col (26) estudiaron la permanencia de especies de Lactobacillus en el
intestino de bebés lactantes a través de su detección en la materia fecal, a diferentes tiempos
luego de la última ingesta. Éstos, muestreando al 4° y 8° día, encontraron una permanencia de
bacilos que por sus perfiles de fermentación de azúcares (entre otras pruebas bioquímicas),
185
Discusión
asignaron a la especie Lactobacillus casei. Concluyeron entonces que, su detección
permanente hasta 8 días posteriores a la ingesta y en elevados recuentos (7 ordenes log.),
sugeriría que el género Lactobacillus es un miembro predominante de la microflora intestinal
en los bebés lactantes.
Estos resultados se correlacionan con los obtenidos en el presente trabajo donde
también el género Lactobacillus (particularmente Lactobacillus rhamnosus) resultó ser
dominante entre nuestros aislamientos.
Xanthopoulos y col (27) trabajaron también con muestras de materia fecal de bebés y
realizaron la caracterización fenotípica y genotípica. Encontraron bacilos gram (+) catalasa (-)
y aislamientos, que por sus perfiles de fermentación de carbohidratos, denominaron como
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (6 aislamientos) y Lactobacillus rhamnosus (6
aislamientos). Todos fermentaron, entre otros, los 4 azúcares típicos que en el presente trabajo
se consideraron para Lactobacillus grupo casei (ver Anexo Tabla 23). Por otro lado,
encontraron 3 aislamientos que fermentaron celobiosa pero no los 4 azúcares típicos antes
considerados y denominaron Lactobacillus gasseri. Los mismos investigadores encontraron
otro aislamiento (con las mismas características antes descriptas) que denominaron
Lactobacillus acidophilus y diferenciaron de Lactobacillus gasseri por su capacidad de crecer
a 45°C, hidrolizar arginina, producir CO2 a partir de glucosa, además de su perfil de
fermentación de carbohidratos.
Estos resultados (características morfológicas y perfil de fermentación de
carbohidratos) se correlacionan con los obtenidos para nuestros aislamientos, tanto para
Lactobacillus grupo 1 como para los restantes aislamientos.
Prasad y col (28) trabajaron con diferentes cepas de Lactobacillus, entre ellas 2 de
186
Discusión
origen humano (HN y HN067), estudiaron la fermentación de carbohidratos y la
identificación a nivel de especie con la técnica RAPD-PCR. Estos investigadores observaron
que la cepa HN067 fermentó, entre otros, los 4 azúcares típicos anteriormente considerados
para Lactobacillus grupo casei y que denominaron Lactobacillus rhamnosus. Con la
utilización de la técnica RAPD-PCR lograron diferenciar aislamientos pertenecientes a un
mismo género y especie.
El método de RAPD-PCR se basa en la utilización de secuencias cortas arbitrarias de
nucleótidos sintéticos o primers, que se hibridan de forma específica con cada una de las dos
hebras complementarias de DNA, las cuales flanquean la región de interés. La amplificación
se consigue por ciclos repetitivos donde se desnaturaliza el DNA molde o templado, se
hibridan los primers con el templado y se sintetiza el DNA complementario por medio de la
enzima polimerasa del DNA. Los productos obtenidos en la amplificación pueden analizarse
mediante diversas técnicas como hibridación dot blot, visualización del producto en geles de
agarosa o poliacrilamida, el análisis de restricción, etc.
Esta metodología no permite la identificación de microorganimos a nivel de género y
especie, sino que permite estudiar la diversidad genética entre cepas que pertenecen a un
mismo género y especie.
Sus ventajas son: ser una técnica eficaz y rápida, permitir la amplificación de cualquier
secuencia de DNA, obtener suficiente cantidad de material genético (a partir de muy pequeñas
cantidades) para su posterior estudio molecular, etc. Por otro lado, sus desventajas son su
elevado costo, las posibilidades de contaminación con material genético extraño, etc. (29).
Las ventajas de los métodos utilizados en el presente trabajo para la caracterización
fenotípica de los aislamientos, son: ser técnicas sencillas, de bajo costo, etc. pero poseen
187
Discusión
desventajas como, por ejemplo, tener escasa especificidad, requerir mayor tiempo para
obtener resultados, etc.
Aproximadamente 2.5 L de jugo gástrico son secretados cada día, generando en el
estómago un pH de entre 1 y 2 y una compleja mezcla de sales y enzimas. Ambos factores
representan los primeros obstáculos que los gérmenes que se incorporan con los alimentos,
deben salvar para alcanzar la mucosa intestinal (7).
La caída en alrededor de 2 ordenes log. en los recuentos celulares para la mayoría de
los aislamientos de los individuos 1 y 2, para 5 aislamientos del individuo 4 y sólo de 1 orden
log. para los aislamientos F64 y F58ch permitiría atribuirles a todos ellos una buena resistencia
a la secreción gástrica. Para los demás aislamientos, la pérdida de viabilidad se manifestó con
resultados muy variables.
Charteris y col., y Goldin y Gorbach (13), trabajando con Lactobacillus rhamnosus
GG encontraron resultados similares entre sí pero poco comparables a los obtenidos en este
trabajo. Los primeros, observaron una escasa sobrevida en solución gástrica simulada a pH 2
durante 1.5 h (inferior al 0.1% de células viables). Si bien las condiciones de trabajo fueron
diferentes (pH y tiempo de incubación), esta gran susceptibilidad a la secreción gástrica de
Lactobacillus rhamnosus GG podría extrapolarse con aquellos resultados encontrados para
188
Discusión
aislamientos de los individuos 4, 5, y 6 donde las caídas en los recuentos celulares fueron de 3
a 5 ordenes log. Por otro lado, Goldin y Gorbach encontraron caídas en 2 ordenes log. en los
recuentos celulares a pH 2.5 (valor de pH cercano al ensayado para los aislamientos
intestinales) durante 30 minutos, resultados éstos más parecidos a los obtenidos para aquellos
aislamientos intestinales más susceptibles, ya que podría estimarse que bajo esas condiciones
a las 3h de incubación la pérdida de viabilidad sería mucho mayor.
Para los aislamientos del individuo 3, que fueron fuertemente afectados por la
secreción gástrica (caídas entre 4 y 5 ordenes log. en los recuentos celulares), los resultados
obtenidos podrían relacionarse sólo relativamente a los hallados por Marteau y col. (30)
debido a que para los aislamientos intestinales del presente trabajo no se evaluaron los efectos
producidos sucesivamente por factores de stress como plantean estos autores, los cuales
trabajaron con cepas de Lactobacillus acidophilus, exponiéndolas a factores tales como el
descenso de pH desde 5 a 3 en 40 minutos. Bajo esas condiciones, los recuentos celulares
cayeron 2 ordenes log. y al cabo de 3 h sólo se mantuvo un 10% de células viables.
Resultados opuestos encontraron Lankaputhra y Shah (31) al estudiar la sobrevida de 6
cepas de Lactobacillus acidophilus expuestos a pH 3 durante 3h, ya que los recuentos
celulares se mantuvieron prácticamente constantes en algunos casos y en otros sólo cayeron 1
orden log.
Prasad y col (28) al evaluar criterios de selección de cepas de Lactobacillus
rhamnosus tolerantes a la bilis y a valores bajos de pH, encontraron resultados similares a los
hallados por Lankaputhra y Shah (31).
También Chou y Weiner (32), trabajando con 7 cepas de Lactobacillus acidophilus,
encontraron que todas poseían una buena sobrevida en medio líquido acidificado (caldo MRS
189
Discusión
pH 3.5) durante 1 h 30 minutos y, por lo tanto, opuestos a los obtenidos para Lactobacillus
gasseri en el presente trabajo.
Usman y Hosono (33) publicaron resultados poco comparables a los encontrados para
el grupo de Lactobacillus gasseri del presente trabajo, ya que sometieron a 2 cepas de
Lactobacillus gasseri a pH de 2.5 y 3.5 y encontraron que, bajo esas condiciones, los
recuentos celulares cayeron sólo entre 1 y 2 ordenes log.
La tasa de secreción biliar y la concentración de bilis en las distintas porciones del
intestino son muy variables, dependiendo principalmente del tipo de ingesta. Es probable que
no pueda establecerse con certeza cual es la concentración real de bilis en el intestino durante
la digestión de los alimentos (7).
Se han empleado, en numerosas experiencias, concentraciones de entre 0.5 y 2% de
bilis en la formulación de medios de cultivo selectivos para aislar bacterias bilis tolerantes a
partir de cultivos mixtos.
Para la totalidad de los aislamientos, concentraciones de 0.15% y 0.30% de bilis
prácticamente no produjeron efecto alguno sobre el desarrollo de los mismos. Sin embargo,
0.60% y 1.0% de bilis inhibieron el desarrollo encontrándose halos cuyos diámetros midieron
entre 0.4 cm y 0.8 cm (individuos 1 y 4), 0.3 cm y 0.5 cm (individuo 2), 0.3 cm y 0.9 cm
(individuos 5 y 6). Sólo dos aislamientos del grupo de Lactobacillus gasseri (individuo 3)
fueron afectados por la bilis (1.0%), con diámetros de halos de inhibición de 0.3 cm.
190
Discusión
Resultados similares a los obtenidos en el presente trabajo encontraron Prasad y col.
(28) quienes, para 0 y 0.4 % de bilis, no hallaron inhibición para Lactobacillus rhamnosus
resultados éstos que podrían correlacionarse a los obtenidos en presencia de 0.15 y 0.3% de
bilis para las cepas de Lactobacillus rhamnosus de nuestro trabajo. Para 0.8 % de bilis, estos
investigadores encontraron una inhibición del crecimiento manifestada en una caída en los
recuentos celulares de 1 orden log., resultados éstos comparables a los obtenidos para nuestros
aislamientos en presencia de 0.6 y 1 % de bilis. En este caso, si bien se comparan
metodologías distintas, podría suponerse que a partir de 0.6 % de bilis, ésta comienza a
ejercer su efecto inhibitorio sobre el desarrollo de los lactobacilos.
También, estos mismos autores comparando el origen de las cepas y su capacidad de
sobrevivir a valores bajos de pH y a elevadas concentraciones de bilis, encontraron que una
gran proporción de cepas de origen humano resultaron ser más tolerantes al pH (de 1 a 3
durante 3 h) como así también a las concentraciones de bilis (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1%)
ensayadas, comparándolas con aquellas aisladas de productos lácteos. Contrariamente a lo
observado para los aislamientos intestinales, encontraron que dentro del género Lactobacillus
había diferencias entre cepas, ya que Lactobacillus rhamnosus poseía mayor tolerancia a
ambos parámetros en comparación a Lactobacillus acidophilus.
Los resultados obtenidos para Lactobacillus gasseri del individuo 3 fueron
parcialmente similares a los reportados por Lankaputhra y Shah (31). Éstos, evaluando el
comportamiento de varias cepas de Lactobacillus acidophilus en presencia de 0.01, 1.0 y 1.5
% de bilis, encontraron resultados variables, ya que 2 cepas resultaron ser tolerantes a dichas
concentraciones mientras que otras cayeron entre 3 y 4 ordenes log. en los recuentos celulares
en presencia de 1% de bilis. Por lo tanto, los resultados obtenidos en el presente trabajo se
191
Discusión
asemejan sólo a los de aquellos bacilos tolerantes encontrados por éstos investigadores.
Por otro lado, Marteau y col. (30) evaluando la sobrevida de Lactobacillus acidophilus
a concentraciones mayores de bilis (2%) y previamente expuestos a otros factores de stress
del tracto gastrointestinal, observaron una gran pérdida de viabilidad celular ya que sólo el
30% de las células sobrevivieron a dichas condiciones. Debido a que en nuestro trabajo no se
evaluó el efecto producido por la bilis sobre microorganismos previamente expuestos a
factores de stress y observando que hasta 1.5% de bilis el grupo de Lactobacillus gasseri
demostró ser poco afectado en su desarrollo, no se podrían extrapolar los resultados obtenidos
por los investigadores antes mencionados para nuestras cepas de Lactobacillus gasseri para
2% de bilis. Esto haría suponer que aún para 2% de bilis, estos lactobacilos podrían mantener
una viabilidad considerable.
Kociubinski y col. (34) estudiaron la tolerancia de 29 aislamientos de lactobacilos
(distintas especies) de origen humano y de otros origenes, encontrando que en general para
todos ellos la inhibición en el crecimiento de los mismos era mayor a medida que aumentaba
la concentración de bilis. Para 0.1% de bilis, observaron que la totalidad de las cepas eran
resistentes, resultados éstos iguales a los obtenidos en nuestro estudio. También determinaron
la resistencia a 0.5 % de bilis, y en este caso, encontraron que la cepa Lactobacillus
rhamnosus GG resultó ser tolerante bajo estas condiciones. Comparando estos resultados a los
obtenidos para 0.6 % de bilis en el presente trabajo, encontramos un comportamiento opuesto
ya que la totalidad de las cepas de Lactobacillus rhamnosus intestinales fueron sensiblemente
afectadas en su viabilidad.
192
Discusión
La enzima hidrolasa de sales biliares cataliza la hidrólisis de los ácidos biliares en
aminoácidos y ácidos grasos libres. Esta deconjugación de los ácidos biliares jugaría un rol
importante en el control de los niveles plasmáticos de colesterol, ya que al estar deconjugados
no logran solubilizar ni permitir una eficaz absorción de los lípidos (8).
La totalidad de los aislamientos desarrollaron óptimamente en los medios adicionados
de taurocolato de sodio (MRS-TC), taurodeoxicolato de sodio (MRS-TDC) y glicolato de
sodio (MRS-GC). Sin embargo, para la mayoría de los mismos el desarrollo fue débil o nulo
en el medio adicionado de glicodeoxicolato de sodio (MRS-GDC). Con respecto a la
capacidad de deconjugar ácidos biliares, sólo las cuatro cepas de Lactobacillus gasseri
(individuo 3) lo hicieron para taurocolato de sodio y taurodeoxicolato de sodio.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo se asemejan a los hallazgos reportados
por Tanaka y col. (15) ya que éstos lograron detectar la presencia de la enzima hidrolasa de
ácidos biliares en 9 cepas de Lactobacillus gasseri (cepas BSH positivas), pero no en
Lactobacillus rhamnosus. Cabe aclarar, que en su estudio se determinó la presencia de la
enzima utilizando una mezcla de sales biliares la cual fue adicionada al medio de cultivo,
mientras que en nuestro trabajo se ensayó cada sal por separado.
Trabajos publicados por Bottazi (35) demostraron que el 100 % de cepas de
Lactobacillus acidophilus ensayadas deconjugaron el taurocolato de sodio, mientras que sólo
el 16.66 % deconjugaron el glicolato de sodio. En el mismo estudio, de 13 cepas de
193
Discusión
Lactobacillus casei ninguna deconjugó el taurocolato de sodio y 9 lo hicieron frente al
glicolato de sodio. Si comparamos los resultados obtenidos para Lactobacillus acidophilus y
Lactobacillus gasseri (de los autores antes mencionados y del presente trabajo,
respectivamente) y por otro lado para Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus casei (de los
autores antes mencionados y del presente trabajo, respectivamente) vemos que sólo existe una
semejanza para el taurocolato de sodio, no así para el glicolato de sodio.
También Usman y Hosono (36) encontraron resultados similares a los obtenidos en el
presente trabajo, ya que al estudiar 28 cepas de Lactobacillus gasseri y evaluar la capacidad
de deconjugación de taurocolato de sodio (0.2%), encontraron resultados positivos para todos
ellos. También revelaron que la velocidad de deconjugación del ácido biliar era diferente para
cada cepa.
Walker y Gilliland (37), evaluando simultáneamente la tolerancia a la bilis, la
capacidad de deconjugación de taurocolato de sodio y la asimilación de colesterol de 19 cepas
de Lactobacillus acidophilus (11 de origen humano), encontraron que todas eran capaces de
deconjugar el ácido biliar, actividad ésta que comenzaba a disminuir cuando se acidificaba el
medio. Resultados similares encontraron también Buck y Gilliland (38). De este modo, para el
taurocolato de sodio los resultados obtenidos en los trabajos realizados por los diferentes
autores antes mencionados, fueron similares a los obtenidos para nuestros aislamientos
intestinales.
Brashears y col. (39) han publicado, como lo han hecho varios investigadores, trabajos
para evaluar conjuntamente la capacidad de deconjugación de ácidos biliares y la remoción de
colesterol del medio (proceso asociativo). Encontraron que para Lactobacillus casei, el
mantener contante el valor de pH del medio o dejar que se produzca la acidificación normal
194
Discusión
durante el desarrollo bacteriano, no influía en la actividad de hidrolasa de ácidos biliares (para
la cual encontraron valores dependientes de cada cepa) en presencia de taurocolato de sodio.
En cambio, para Lactobacillus acidophilus se observó una diferencia notable en ambas
condiciones de desarrollo. También observaron que Lactobacillus casei posee mayor
capacidad de deconjugación para glicolato de sodio en comparación a taurocolato de sodio.
Esto, poco se correlaciona con los resultados obtenidos para los aislamientos de Lactobacillus
rhamnosus del presente trabajo ya que los mismos no manifestaron actividad alguna frente a
ninguno de los ácidos biliares ensayados.
Corzo y Gilliland (14) también observaron, pero en este caso en 3 cepas de
Lactobacillus acidophilus (2 de origen intestinal), una mayor preferencia de la enzima BHS
hacia el glicolato de sodio que hacia el taurocolato de sodio. Nuevamente, los resultados
obtenidos para nuestras cepas de Lactobacillus gasseri no se correlacionarían con estos
últimos datos.
Buck y Gilliland (38) encontraron resultados muy similares a los hallados por Walker
y Gilliland (37) sobre el efecto de los ácidos biliares y la bilis sobre el desarrollo de
Lactobacillus acidophilus. Los primeros investigadores, encontraron que aquellas cepas que
desarrollan más lentamente poseen una mayor actividad de deconjugación y por lo tanto son
más afectadas por los ácidos biliares deconjugados que se liberan de dicha actividad que por
los ácidos conjugados. Esto llevó, entonces, a denominar a esas cepas como bilis sensible.
Contrariamente a esto, en el presente trabajo la resistencia a la bilis del grupo de aislamientos
de Lactobacillus gasseri fue elevada, y sin embargo fueron los únicos en manifestar actividad
de deconjugación de ácidos biliares.
Iguales resultados a los encontrados para nuestros aislamientos intestinales, fueron
195
Discusión
publicados por Klaver y van der Meer (40) quienes estudiaron la capacidad de deconjugación
de ácidos biliares primarios y secundarios. Éstos, observaron que las cepas de Lactobacillus
acidophilus ensayadas poseían una marcada actividad de deconjugación y que para la única
cepa de Lactobacillus casei, dicha actividad enzimática fue nula.
Numerosos son los antecedentes bibliográficos sobre el importante aporte que realizan
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei etc. de la enzima
lactasa al organismo, cuando éstos son ingeridos en productos lácteos, fermentados o no. Esto
resulta más importante en aquellos individuos intolerantes a la lactosa, debido a que les
permite consumir productos conteniendo lactosa. El aporte directo de la enzima, por vía oral,
exige que para llegar activa a la mucosa intestinal debe resistir a las condiciones existentes en
las distintas porciones del tracto gastrointestinal (5).
Para la totalidad de nuestros aislamientos intestinales la actividad -galactosidasa fue
prácticamente nula (valores de actividad menores a 1 UM), a pesar de mostrar un desarrollo
óptimo en leche.
Estos resultados podrían explicarse a través del análisis sobre el metabolismo
hidrocarbonado de las BAL que realizan Jojiono, Tsutomu Goto y Shigeo Okonogi, publicado
por Wood y col. (5). Éstos plantean (al igual que otros autores) que las BAL pueden
incorporar lactosa del medio a través del sistema PEP-PTS o bien por una Permeasa. En el
primer caso, la lactosa es fosforilada y luego en el interior de la célula es hidrolizada por la
196
Discusión
enzima P--galactosidasa, mientras que en el segundo caso dicha hidrólisis es realizada por la
-galactosidasa. También estos autores plantean que ambas enzimas se encuentran
distribuídas entre las diferentes especies pero, dependiendo de éstas, existe un predominio de
una u otra enzima. También estos autores explican que en Lactobacillus casei (entre otras
bacterias estudiadas) la actividad de -galactosidasa es nula, y que toda la actividad de
hidrólisis de lactosa sería llevada a cabo por la P--galactosidasa.
Resultados muy diferentes observaron Shah y Jelen (41) trabajando con BAL y
Hughes y Hoover (42) trabajando con bifidobacterias y Lactobacillus acidophilus. Empleando
la misma metodología (método de Miller), ambos grupos de investigadores detectaron la
presencia de la enzima -galactosidasa en Lactobacillus acidophilus.
En su estudio sobre la influencia de diferentes parámetros, como resistencia a la bilis y
a la acidez del medio, captación de lactosa y actividad de -galactosidasa de un grupo de
Lactobacillus acidophilus sobre la digestión de la lactosa, Mustapha y col. (43) concluyeron
que ni la actividad de -galactosidasa total bacteriana ni el transporte del disacárido al interior
del lactobacilo son factores limitantes del proceso de digestión de lactosa. En cambio, la
resistencia a la acidez y a la bilis fueron factores fundamentales para permitir que estos
bacilos lleven a cabo la hidrólisis. Esto es debido a que, por un lado, su resistencia a los
valores bajos de pH encontrados en la secreción gástrica hace que se mantengan intactas las
membranas y paredes celulares protegiendo a la lactasa intracelular; por otro lado, estos
investigadores sugieren que la resistencia a la bilis determina un aumento en la permeabilidad
de las membranas a la lactosa, provocando un mayor ingreso de lactosa al interior celular y
por lo tanto, los lactobacilos “permeabilizados” pero no lisados serían necesarios para llevar a
cabo la hidrólisis de la lactosa en el intestino. Comparando estos resultados y fundamentos
197
Discusión
con los hallados en el presente trabajo, no encontramos puntos en común. Considerando las
cepas de Lactobacillus gasseri, vemos que resultaron ser bastante resistentes a las
concentraciones de bilis ensayadas; sin embargo su resistencia a la secreción gástrica fue muy
baja. Teniendo en cuenta ahora las cepas de Lactobacillus rhamnosus, F16 se destacó por tener
una importante resistencia a la bilis y a la secreción gástrica.
Para manifestar sus efectos benéficos, es fundamental que las BAL se mantengan
ligadas a la mucosa evitando ser removidas por la peristalsis intestinal. Su capacidad de
adherencia a las mucosas, entre otras propiedades, les confiere una ventaja competitiva frente
a los demás integrantes de la población microbiana y les asegura una mayor permanencia y
colonización del lugar (8).
Para los aislamientos de los individuos 1 y 2, se obtuvieron porcentajes de
hidrofobicidad inferiores al 28%, mientras que para el individuo 3 los resultados fueron muy
heterogéneos (entre 9% y 53%). Los porcentajes obtenidos para los restantes individuos
fueron bajos: entre 18% y 36% (individuo 4), entre 15% y 30% (individuo 5) y entre 16% y
28% (individuo 6). Se destacaron por mostrar mayores valores los aislamientos F37 (53.15%),
F37” (50.84%) ambos del individuo 3, F64 (49.51%) del individuo 4 y F70 (41.06%) del
individuo 5.
Los antecedentes bibliográficos sobre el tema son escasos. Pérez y col. (44) así como
Gómez Zavaglia y col. (45) hallaron porcentajes de hidrofobicidad muy dispares (entre 0.1 
198
Discusión
0.9 % y 95  0.9 %) para las distintas especies de Bifidobacterium ensayadas.
Por otro lado, Kiely y Olson (46) trabajando con 5 cepas de Lactobacillus casei,
encontraron valores de hidrofobicidad que no superaron el 30 %; resultados éstos similares a
los hallados en el presente trabajo.
Konings y col. (3) han publicado resultados obtenidos por otros autores, los cuales
podrían relacionarse parcialmente con los observados para los aislamientos intestinales del
presente estudio. Dichos autores, trabajando con líneas celulares Caco-2 y HT29 para evaluar
la capacidad de adhesión de diferentes cepas de Lactobacillus, y comparando dichas cepas
con una cepa referencia caracterizada como buena adherente (Lactobacillus rhamnosus GG),
encontraron una adherencia completa a ambas líneas celulares tanto para el lactobacilo de
referencia como para los demás.
5.3.4. Inhibición de bacterias patógenas.
Cuando los mecanismos de defensa del organismo son afectados por enfermedades,
tratamientos inmunosupresores, etc., microorganismos que habitualmente forman parte de la
población microbiana normal pueden manifestar su patogenicidad intrínseca y volverse
responsables de diversos procesos inflamatorios e infecciosos denominados “infecciones
oportunistas”(2). Probablemente el rol probiótico de las BAL como mejoradoras del sistema
de defensa del huésped frente a bacterias patógenas tenga un origen multifactorial. Por un
lado, la colonización de las mucosas del organismo por estas bacterias impide que otros
microorganismos ocupen el mismo sitio, además de competir por los nutrientes disponibles en
199
Discusión
el lugar. Por otro lado, el mejoramiento del sistema inmunológico humoral y celular que
producen estas bacterias probióticas, junto a la producción de bacteriocinas, contribuirían
también a prevenir infecciones por patógenos y mejorar el tratamiento de las mismas (8).
Gonzáles y col. (47), estudiando el poder inhibitorio de diferentes lactobacilos frente a
bacterias enteropatógenas, encontraron que Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei
tenían un menor poder inhibitorio frente a Salmonella que a Eschericchia coli.
Contrariamente a esto y en general para las cepas intestinales aisladas en este estudio, se
observó un menor poder frente a Escherichia coli que a Salmonella. Teniendo en cuenta sólo
una misma bacteria patógena, por ejemplo Escherichia coli, estos investigadores encontraron
que Lactobacillus casei poseía un menor poder inhibitorio en comparación con Lactobacillus
acidophilus. Sin embargo, para las cepas obtenidas por nosotros se observaron resultados
similares para ambas especies. Dichos autores también encontraron que cuando se utilizaron
distintas especies de Salmonella, Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus, éstas
ejercieron un poder inhibitorio muy semejante, resultados comparables a los hallados en el
presente trabajo.
Dubois y col. (48) evaluaron el poder inhibitorio de Lactobacillus acidophilus frente a
una gran variedad de bacterias patógenas, entre ellas Eschericchia coli y Salmonella. En
ambos casos encontraron resultados parecidos a los obtenidos en el presente trabajo.
Xanthopoulus y col. (49), en su estudio sobre caracterización de lactobacilos aislados
de heces de infantes y evaluación de la actividad antimicrobiana de los mismos, encontraron
que Lactobacillus paracasei subsp. paracasei y Lactobacillus acidophilus poseían un
importante poder inhibitorio frente a Escherichia coli, mientras que frente al mismo patógeno
se observó un poder inhibitorio leve por parte de los aislamientos intestinales del presente
trabajo.
200
Discusión
Con respecto a Staphylococcus aureus, se obtuvieron resultados muy dispares para
nuestros aislamientos intestinales y por el tipo de halos de inhibición obtenidos (débiles en su
mayoría) quedó manifiesto un parcial poder inhibitorio. Resultados similares encontraron
Dubois y col. (48), quienes observaron una cierta capacidad inhibitoria de Lactobacillus
acidophilus frente al patógeno mencionado, pero que desapareció a las 48 h de incubación.
Finalmente, frente a Listeria monocytógenes se obtuvieron halos de inhibición cuyos
diámetros fueron muy variables para la totalidad de nuestras cepas, aunque en todos los casos
el tipo de inhibición fue total.
Lortie y col. (50), caracterizando sustancias antimicrobianas producidas por 4 cepas de
Lactobacillus casei, encontraron que éstas inhibían completamente el desarrollo de Listeria
monocytógenes y Eschericchia coli, resultados que podrían correlacionarse a los hallados para
nuestros aislamientos de Lactobacillus rhamnosus, aunque no todos los halos de inhibición
del crecimiento fueron netos ni extensos.
Entre los numerosos requisitos que deben cumplir estos microorganismos para ser
utilizados como probióticos, se encuentra su capacidad de mantenerse viables en condiciones
ácidas. Productos lácteos, como yogures, leches fermentadas y quesos, se caracterizan por
tener valores de pH entre 4 y 5.5, y cuando a éstos se les adicionan bacterias probióticas, las
201
Discusión
mismas deben mantenerse viables bajo esas condiciones para así poder ejercer los efectos
benéficos sobre el consumidor. Son escasos los estudios y antecedentes bibliográficos
disponibles que aporten información sobre el efecto que producen valores bajos de pH sobre
la viabilidad de las bacterias probióticas (2).
Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten concluir que a valores de pH
comprendidos entre 4.5 y 5.5 la viabilidad de los aislamientos intestinales resultó poco
afectada. En general, sólo se observó una débil inhibición a pH 4.5.
Kailasapaty y Ribka (51), en su publicación sobre el potencial terapéutico de
Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium spp. y sus sobrevidas en yogur, menciona que
Lactobacillus acidophilus no desarrolla bien a valores de pH inferiores a 4. Si bien en nuestro
estudio se evidenció sólo una leve inhibición a pH 4.5, esto permitiría estimar que a valores
de pH inferiores al mismo (como el ensayado por los investigadores antes mencionados) la
viabilidad de nuestros aislamientos intestinales podría comprometerse. Estos mismos autores,
hacen mención de trabajos realizados por otros investigadores, quienes encontraron que
Lactobacillus acidophilus posee una elevada capacidad buffer citoplasmática que le permite
resistir cambios en el pH del medio (en el rango de 3.72 a 7.74).
Comparando la ácidotolerancia del grupo de aislamientos de Lactobacillus gasseri con
la del de Lactobacillus rhamnosus utilizados en el presente trabajo, no podría concluirse que
los primeros sean más ácidotolerantes que los últimos.
Chou y Weimer (32), en su trabajo sobre aislamiento y caracterización de cepas
ácidotolerantes de Lactobacillus acidophilus, encontraron cepas no sólo ácido sino también
bilis tolerantes a pH 4.5. Estos resultados se correlacionan con los hallados en nuestro trabajo
ya que para las cepas de Lactobacillus gasseri (excepto F37”), el crecimiento fue normal. Con
202
Discusión
respecto a Lactobacillus rhamnosus, son escasos los antecedentes bibliográficos que aporten
datos del efecto del pH sobre su crecimiento. Para nuestras cepas de esta especie, no se
observó un comportamiento típico por individuo ni una inhibición importante.
El uso tecnológico de las sales NaCl y KCl en la elaboración de producto lácteos
fermentados, puede afectar negativamente la viabilidad de las bacterias adicionadas en los
mismos. Probablemente, y al igual que ocurriría en presencia de azúcares, este agregado
modifica el valor de aw, fundamental para la sobrevida de los microorganismos en el producto
(2).
Se obtuvieron resultados satisfactorios al evaluar el desarrollo de nuestros aislamientos
en medios adicionados de dichas sales, tanto para 1%, 2% y 3% de cada una de ellas, ya que
poco afectaron el desarrollo de los mismos.
Son escasos los trabajos publicados sobre el efecto que producen las sales sobre el
crecimiento de bacterias lácticas y no lácticas. Gómez y col. (52, 53) evaluaron la sobrevida
de Lactobacillus acidophilus tanto en leche como quesos elaborados por diferentes
metodologías, y con una compleja relación de parámetros (temperatura y tiempo de
almacenamiento, distintas concentraciones de NaCl y el uso de cultivos puros o mixtos).
Lactobacillus acidophilus sólo se mantuvo prácticamente sin cambios en sus recuentos
celulares durante 9 semanas de almacenamiento y en presencia de 3% de NaCl.
En otro trabajo, Gómez y col. (54) encontraron durante la maduración de quesos
203
Discusión
semiduros Gouda que la tasa de muerte celular de Lactobacillus acidophilus (entre otros
microorganismos presentes) resultó mayor frente a menores valores de aw y mayores
concentraciones de sal (9 semanas de almacenamiento, entre 2% y 4% de NaCl).
Debido a que en el presente trabajo sólo se evaluó el efecto producido únicamente por
la presencia de las sales NaCl y KCl en el medio de cultivo, los trabajos antes mencionados
sólo aportan algunos datos a la presente discusión ya que las condiciones de trabajo son poco
comparables. De todos modos, los resultados obtenidos por estos investigadores se asemejan
a los observados para nuestros aislamientos intestinales. Este ensayo permitió caracterizar
tecnológicamente los aislamientos con respecto a su suceptibilidad frente a las sales utilizadas
y los resultados obtenidos deberían ser tenidos en cuenta para formulaciones en productos
lácteos fermentados que contengan a las mismas.
Reddy y Marth (55) estudiaron la recuperación de bacterias lácticas acidificantes
(distintas cepas de Lactococcus lactis) y no acidificantes a partir de distintos modelos de
quesos Cheddar y encontraron que de los mismos, podían aislarse cepas de Lactobacillus
casei luego de 12 y 24 semanas de maduración. Estos aislamientos se obtuvieron de quesos
conteniendo entre 1.32% y 1.72% de NaCl y entre 1.51% y 1.76% de KCl.
El diacetilo producido por BAL fermentadoras de citrato, posee un efecto
antimicrobiano mucho más potente frente a bacterias gram (-), levaduras y hongos que frente
a bacterias gram (+). Para ejercer dicho efecto, se requieren concentraciones mínimas de 400
204
Discusión
ppm, dependiendo del microorganismo en particular. El acetaldehído, por su parte, es el
responsable del aroma típico del yogur y también se le han reportado efectos antimicrobianos
(en concentraciones de 10 a 100 ppm) frente a bacterias patógenas relacionadas a los
alimentos (2).
En el presente trabajo se ensayaron concentraciones superiores a la antes mencionadas,
observándose un efecto más potente del acetaldehído en comparación con el diacetilo,
inhibición que aumentó con la concentración.
Es de destacar que el diacetilo, a pesar de ser menos nocivo hacia nuestros
aislamientos, en general, logró inhibir el desarrollo de numerosos aislamientos de los
individuos 1, 3 y 4 a una concentración de 1000 ppm.
Debe, sin embargo, quedar en claro que estas inhibiciones se verificaron a
concentraciones significativamente más altas que las encontradas en productos comerciales.
conservada a 5ºC.
El ácido láctico presente en los productos lácteos fermentados, también condiciona la
viabilidad de las bacterias probióticas cuando éstas son adicionadas a los mismos (2). Por
tanto su resistencia al mismo en condiciones de refrigeración, permite estimar la viabilidad de
estas bacterias durante el almacenamiento de dichos productos.
Los resultados obtenidos para nuestros aislamientos revelaron una buena sobrevida en
leche acidificada a 5°C en el rango de pH 4 a 5, salvo el aislamiento F53 (individuo 4) que fue
205
Discusión
severamente afectada su viabilidad celular en dichas condiciones.
Usman y Hosono (33), evaluando la viabilidad de Lactobacillus gasseri en leche (pH
6.3, 4ºC), observaron que los recuentos celulares caían en menos de 1 orden log. (para 2 del
total de cepas estudiadas). Estos resultados son semejantes a los obtenidos en el presente
trabajo. También lo son con respecto a los hallados por Nighswonger y col. (56) y Gilliland y
Speck (57), quienes evaluando paralelamente la influencia del almacenamiento a 7ºC (en
yogur) de 5 cepas de Lactobacillus acidophilus y 1 cepa de Lactobacillus rhamnosus,
encontraron que para ambas especies no fue afectada la viabilidad celular.
Con respecto a la acidificación de la leche inoculada con nuestras cepas de
lactobacilos intestinales, encontramos que ésta no se produjo, es decir que la actividad
fermentativa en refrigeración estuvo ausente. Estos resultados coinciden con los reportados
por Sanders y col. (58) en su trabajo sobre la “perfomance” de cultivos comerciales para su
aplicación en leches fluídas.
Shah y Ravula (59), inoculando Lactobacillus acidophilus MJLA1 a yogur y
evaluando su sobrevida en el mismo a 24h y 10, 20 y 30 días de almacenamiento en
refrigeración, observaron que al cabo de 30 días su recuento celular disminuyó en casi 2
ordenes log. Esta suceptibilidad encontrada para Lactobacillus acidophilus no es comparable
a la observada para los aislamientos de Lactobacillus gasseri del presente trabajo, ya que
éstos demostraron ser mucho más tolerantes bajo dichas condiciones.
Shah y col. (60) hallaron resultados similares a los obtenidos en el presente trabajo
para Lactobacillus gasseri, ya que observaron que a pH 4, 3 de 5 cepas de Lactobacillus
acidophilus inoculados a yogur mantuvieron prácticamente invariables sus recuentos durante
30 días de almacenamiento en refrigeración.
206
Discusión
Vinderola y col. (61), evaluando la sobrevida de bacterias probióticas (Lactobacillus
acidophilus y Bifidobacterium bifidum) en leche acidificada, encontraron que Lactobacillus
acidophilus disminuía aproximadamente 1 orden log. sus recuentos celulares a valores de pH
5.5 pero a 4.5 lo hacía en 3 ordenes log. Estos resultados poco pueden comparase a los
obtenidos para nuestras cepas de Lactobacillus gasseri, para los cuales a valores de pH 4 y 5 y
durante el mismo período de almacenamiento, sus recuentos sólo disminuyeron menos de 1
orden log.
de starters.
Numerosos estudios han demostrado que para ejercer sus efectos benéficos, las
bacterias probióticas deben resistir una serie de factores, entre ellos, el posible antagonismo
frente a las bacterias lácticas de starters empleadas en los distintos productos lácteos. Del
mismo modo, las bacterias probióticas tampoco deben afectar la viabilidad de los starters,
sobre todo cuando las mismas se adicionan simultáneamente al comenzar las fermentaciones.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo demostraron que ninguna de las
bacterias de starters ensayadas inhibe el desarrollo de los lactobacilos intestinales aislados.
Sin embargo, la situación inversa no fue igual. Frente a Lactococcus lactis y Streptococcus
thermophilus, nuestros aislamientos ejercieron una considerable inhibición en el desarrollo,
sobre todo frente al segundo.
Nighswonger y col. (56) evaluaron la sobrevida durante el almacenamiento de yogur
207
Discusión
de 5 cepas de Lactobacillus acidophilus y 1 de Lactobacillus casei. Los yogures habían sido
elaborados con 2 tipos de starters (CM-2 y YC-4). Estos investigadores encontraron que, para
Lactobacillus acidophilus, la sobrevida del mismo era tanto dependiente del starter usado
como de la cepa utilizada. Para una de las cepas evaluadas (La 5), encontraron una caída en
los recuentos celulares (a los 28 días de almacenamiento) de 1 y 1.5 ordenes log. frente a CM-
2 y YC-4, respectivamente, asignando como causa de inhibición la posible producción de
peróxido de hidrógeno por parte de éstos.
Vinderola y col. (17), evaluando la enumeración simultánea de bacterias probióticas y
bacterias de starters en productos lácteos fermentados, observaron que los recuentos celulares
de las mismas dependían de las características del producto (yogur tipo “diet” o entero, leches
fermentadas y quesos frescos) y que en algunos no existían antagonismos entre los
microorganismos enumerados. Para un yogur, por ejemplo, encontraron recuentos celulares de
9 ordenes log. para Streptococcus thermophilus, 7.8 ordenes log. para Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, 6.6 ordenes log. para Lactobacillus acidophilus pero muy bajo
para Lactobacillus casei. En otro yogur, en cambio, observaron que junto a recuentos
similares a los antes mencionados de Streptococcus thermophilus se hallaron recuentos de 8
ordenes log. únicamente para Lactobacillus casei. Por otro lado, para queso fresco hallaron
recuentos considerables (superiores a 8.3 ordenes log.) tanto para Streptococcus thermophilus
como para Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus. Estos resultados permitirían
estimar que la presencia de bacterias probióticas no afecta la viabilidad de las bacterias de
starters antes mencionadas, difiriendo de los encontrados en el presente trabajo para nuestros
aislamientos intestinales. Resultados también opuestos a los del presente trabajo encontraron
los mismos autores al observar que, tanto Lactobacillus acidophilus como Lactobacillus casei
208
Discusión
no afectaban la viabilidad de Lactococcus lactis, inhibición que sí manifestaron nuestros
aislamientos intestinales. Este tipo de comparaciones deja en evidencia que prácticamente
todos los aspectos estudiados se han mostrado cepa dependientes.
Para una mejor caracterización probiótica, se hace necesario discutir de manera
integrada los resultados obtenidos. A continuación se discute brevemente los aspectos más
importantes de los aislamientos obtenidos por individuo y comparando sus diferentes
aptitudes probióticas y características tecnológicas entre sus integrantes.
Las cepas de Lactobacillus rhamnosus aisladas de los individuos 1 y 2, si bien se
mostraron considerablemente resistentes a la solución gástrica simulada, resultaron
susceptibles a concentraciones de bilis superiores a 0.6%. Sus relativamente bajos valores de
hidrofobicidad podrían afectar la adherencia y permanencia en la mucosa intestinal. Desde el
punto de vista probiótico, no presentaron aptitudes destacables con excepción de su moderado
poder inhibitorio frente a Listeria monocytógenes y Salmonella. Considerando ahora los
factores tecnológicos, resistieron bien a algunos de ellos (pH, sales) y conservaron su
viabilidad en leche acidificada durante 4 semanas a 5°C. En presencia de bacterias de starters
como Lactococcus lactis y/o Streptococcus thermophilus, el SLC de los aislamientos
intestinales inhibió el desarrollo de las mismas, y por tanto, resultarían incompatibles en
formulaciones de productos lácteos que las contengan. Sin embargo, frente a Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus no manifestaron efecto alguno.
Cabe destacar la particularidad de las cepas de Lactobacillus gasseri (individuo 3), ya
209
Discusión
que mostraron un perfil probiótico, bioquímico y características morfológicas muy diferente
al resto de los aislamientos. Resultaron ser más susceptibles a la acidez gástrica que los
anteriores pero prácticamente no fueron afectados por la bilis. Este grupo resultó tener, en
comparación a los demás, las mejores propiedades probióticas ya que deconjugaron y
precipitaron ácidos biliares (no observado en las otras cepas) y su porcentaje de
hidrofobicidad resultó considerable, lo cual les otorgaría mayores posibilidades de adherencia
y permanencia en la mucosa intestinal. También se destacaron por tener un espectro de
inhibición frente a bacterias patógenas más amplio (Listeria monocytógenes, Salmonella y
Staphylococcus aureus). Del punto de vista tecnológico, factores tales como pH y sales no
afectaron su crecimiento y conservaron su viabilidad en leche acidificada durante 4 semanas a
5°C. Al igual que para los demás, este grupo de aislamientos afectó el desarrollo de bacterias
lácticas de starters (Lactococcus lactis y Streptococcus thermophilus).
Otro grupo de lactobacilos, los Lactobacillus rhamnosus aislados del individuo 4,
resultaron considerablemente susceptibles a la acidez gástrica y a la bilis. Esto, junto a valores
bajos de hidrofobicidad, harían escasas las posibilidades de llegar viables en niveles altos a la
mucosa intestinal. Sin embargo, a su favor poseen un espectro de inhibición de bacterias
patógenas muy similar al grupo de Lactobacillus gasseri. Del punto de vista tecnológico,
factores tales como pH y sales no afectaron su desarrollo en el medio y (con excepción del
aislamiento F53), conservando su viabilidad en leche acidificada durante 4 semanas a 5°C.
El grupo de aislamientos que resultó más susceptible a la acidez gástrica fue el
proveniente del individuo 5. También fueron marcadamente afectados por la bilis, lo que hace
210
Discusión
presuponer dificultades para arribar con éxito a la mucosa intestinal. También para estos
aislamientos, factores tales como pH y sales no afectaron su desarrollo en el medio y
conservaron su viabilidad en leche acidificada durante 4 semanas a 5°C.
Finalmente, el grupo de Lactobacillus rhamnosus del individuo 6 mostró
características muy heterogéneas. Las bacterias lácticas de starters ensayadas no afectaron la
viabilidad de este grupo de aislamientos. En la situación inversa, éstos tampoco lo hicieron
frente a las cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, sólo lo hicieron levemente
frente a las de Lactococcus lactis y más fuertemente frente a las de Streptococcus
thermophilus. Frente a la solución gástrica simulada y a la bilis, resultaron considerablemente
sensibles y poco inhibidores del crecimiento de las 4 bacterias patógenas ensayadas. Del
punto de vista tecnológico, factores tales como pH y sales no afectaron su desarrollo en el
medio y conservaron su viabilidad en leche acidificada durante 4 semanas a 5°C.
211
Conclusiones
 Un número importante de aislamientos (54 cepas) se obtuvo a partir de 6 muestras de
materia fecal de bebés alimentados sólo con leche materna. Todos respondieron a las
características morfológicas de lactobacilos.
 De los 54 aislamientos, el 92.6% de los mismos se identificó como Lactobacillus casei, y
el resto como Lactobacillus del Grupo 1, a partir del perfil de fermentación de
carbohidratos (Manual Bergey). Posteriormente, con el estudio del desarrollo en medios
selectivos y con los perfiles RAPD-PCR, se obtuvo la identificación definitiva de los
aislamientos. Los adjudicados a Lactobacillus del Grupo1 pasaron a ser considerados
Lactobacillus gasseri, mientras que las cepas de Lactobacillus casei fueron adjudicadas a
Lactobacillus rhamnosus.
 Al tratar los aislamientos con solución gástrica simulada, los mismos se vieron afectados
en forma variable ya que se registraron disminuciones de entre 1 y 6.6 ordenes log. en los
recuentos celulares. Sin embargo, expuestos a la bilis (0.15% y 0.30%), desarrollaron
normalmente. Recién a partir de 0.6 % de bilis, se observaron mayores efectos inhibitorios
sobre los mismos. En particular, los 4 aislamientos de Lactobacillus gasseri (individuo
3), prácticamente no fueron afectados en su viabilidad por las cuatro concentraciones de
bilis ensayadas.
Resultó importante el efecto inhibidor que ejerció el glicodeoxicolato de sodio (GDC)
sobre la totalidad de los lactobacilos; sin embargo el taurocolato de sodio (TC),
taurodeoxicolato de sodio (TDC) y glicolato de sodio (GC) no afectaron severamente el
desarrollo de los mismos. Con respecto a la capacidad de deconjugar y precipitar esas
213
Conclusiones
sales biliares, sólo las 4 cepas de Lactobacillus gasseri lo evidenciaron, pero únicamente
frente a taurocolato de sodio (TC) y taurodeoxicolato de sodio (TDC).
La hidrofobicidad resultó un parámetro también cepa dependiente y sus valores no
superaron el 53%.
Una importante aptitud probiótica que demostraron tener la casi totalidad de los
aislamientos fue su poder inhibitorio frente a las 4 bacterias patógenas ensayadas:
Salmonella OMS-Ca, Staphylococcus aureus 76, Escherichia coli V517 y Listeria
monocytógenes ATCC15313.
 Del punto de vista de su aplicación tecnológica y, teniendo en cuenta los factores físico
químicos a los cuales fueron sometidos los aislamientos, parte de los mismos fueron
levemente afectados en su desarrollo frente a valores de pH de 4.5, mientras que a valores
superiores no se observó efecto alguno. En cuanto a la presencia de ácido láctico en el
medio, la totalidad de los aislamientos conservó una buena sobrevida cuando fueron
inoculados en leche acidificada con este ácido y almacenados a 5°C. La presencia de NaCl
y KCl (1%, 2% y 3%) no afectó el desarrollo de los aislamientos como así tampoco lo
hizo el agregado al medio de acetaldehído (1000 ppm). Sin embargo este último a 2500
ppm y el diacetilo a 1000 ppm y 2500 ppm inhibieron (en mayor o menor medida) el
crecimiento de los aislamientos intestinales, aunque debe tenerse en cuenta que estas
concentraciones son muy superiores a las encontradas normalmente en productos lácteos
fermentados.
Tampoco fueron afectados en su desarrollo, por el agregado de SLC de bacterias lácticas
de starters. Contrariamente a esto, cuando se evaluó el efecto producido por el agregado
214
Conclusiones
de SLC de los aislamientos sobre el crecimiento de bacterias lácticas de starters, se
encontró efecto inhibitorio hacia Lactococcus lactis y Streptococcus thermophilus pero no
frente a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
 Según los resultados obtenidos al aplicar criterios bioquímicos, probióticos, tecnológicos
y genéticos para la diferenciación de cepas, resultó evidente que el análisis de un único
criterio, entre los mencionados, no debería aplicarse para tal fin. Un examen integral de
todos los caracteres resultó más exacto para identificar cepas distintas obtenidas de un
mismo individuo.
 De acuerdo a lo observado en la caracterización de los aislamientos obtenidos, puede
concluirse que resultaría erróneo asignar a los lactobacilos intestinales un rol “probiótico”
o “no probiótico” ya que ninguna cepa (tal como fue demostrado en otros trabajos para
probióticos comerciales) da un perfil probiótico completo. Cada capacidad probiótica
investigada resultó cepa dependiente, por lo que, a los fines prácticos, debe pensarse más
bien en utilizar combinaciones de cepas para mejorar el potencial probiótico de los
productos y asegurar los efectos benéficos hacia la salud del huésped.
215
Bibliografía
1. Tannock, G.W. (1995) Microecology of the gastrointestinal tract in relation to lactic acid
bacteria. International Dairy Journal, 5, 1059-1070.
2. Naidu, A.S.; Bidlack, W.R. and Clemens R.A. (1999). Probiotic spectra of lactic acid
bacteria (LAB). Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 38, 13-126.
3. Konings, W.N.; Kuipers O.P. and Huis in ‘t Veld J.H.J. (1999). Lactic acid bacteria:
genetics, metabolism and applications. Proceedings of the Sixth Symposium on lactic
acid bacteria: genetics, metabolism and applications. 199-394.
4. Wood, B. J.B. ed. 1992. The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. Elsevier Applied
Science London, England.
5. Nakasawa, Y. and Hosono, A.; ed. 1992. Functions of Fermented Milk. Challenges for the
Health Sciences. Elsevier Applied Science. London, England.
6. Kociubinski, G. Bacterias acidolácticas y bifidobacterias: aptitudes probióticas. Tesis
presentada para obtener el título de doctor. Facultad de Ciencias Exactas, UNLP
(1999).
7. West, J.B. (1996) Bases Fisiólogicas de la Práctica Médica. Cap. 6, 731-850.
8. Salminen, S.; Deighton, M.A.; Benno, Y. and Gorbach, S.L. (1998) Lactic acid bacteria in
health and disease. En: Lactic Acid Bacteria. Microbiology and functional aspects,
Salminen, S. y von Wright, A. (eds.). Marcel Dekker, Inc., New York, U.S.A., 211-
253.
9. Kandler, O. and Weiss, N. (1986) Regular, nonsporing gram-positive rods. Bergeys’s
Manual (14) 1208-1234, 1418-1434.
10. Puhan, Z. (1999) Effect of probiotic fermented dairy products in human nutrition.
L’Industria del Latte, 35, 3-11.
217
Bibliografía
11. Lee, Y.; Nomoto, K.; Salminen S. and Gorbach S.L. (1999). Handbook of probiotics. (1)
1-22.
12. Dellaglio, F.; Lombardi, A. y Torriani S. (1998). Tassonomia e nuove prospettive nella
identificazione dei microrganismi non starter di interesse caseario. L’Industria del
Latte (1998), XXXIV, (3-4), 57-76.
13. Charteris, W.P.; Kelly, P.M.; Morelli, L. and Collins, J.K. (1998) Development and
application of an in vivo methodology to determine the transit tolerance of potencially
probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human
gastrointestinal tract. Journal of Applied Microbiology 84, 759-768.
14. Corzo, G. and Gilliland, S.E. (1999) Bile salt hydrolase activity of three strains of
Lactobacillus acidophilus. Journal of Dairy Science, 82, 472-480.
15. Tanaka, H.; Doesburg, K.; Iwasaki T. and Mierau I. (1999). Screening of lactic acid
bacteria for bile salt hydrolase activity. Journal of Dairy Science, 82, 2530-2535.
16. Corzo, G. and Guilliland, S.E. (1999) Measurement of bile salt hydrolase activity from
Lactobacillus acidophilus based on disappearance of conjugated bile salts. Journal of
Dairy Science, 82, 466-471.
17. Vinderola, C.G. and Reinheimer, J.A. (2000) Enumeration of Lactobacillus casei in the
presence of Lact. acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in fermented
dairy products. International Dairy Journal, 10, 271-275.
18. Harrigan, W.F. y Mc Cance, M.E. (1976) Laboratory methods in food and dairy
microbiology. Academic Press, London.
19. INPPAZ, OPS/OMS. (1993). Microbiología de alimentos. Control de calidad de medios
de cultivo. Método Ecométrico.
218
Bibliografía
20. Romersburg, H.C. (1984). Cluster Analysis for Research. Belmont, CA: Lifetime Learning
Publications.
21. Tailliez, P.; Quénée, P. y Chopin, A. (1996) Estimation de la diversité parmi les souches
de la collection CNRZ: application de la RAPD à un groupe de lactobacilles. Lait 76,
147-158.
22. Reinheimer, J.A.; Candioti, M.C.; Zalazar, C.A. y Demkow, M.R. (1988). Inibizione dei
batteri coliformi con colture commerciali di Streptococcus thermophilus e
Lactobacillus bulgaricus. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 39 (5), 349-366.
23. Taranto, M. P.; Gonzalez de Llano, D.; Rodriguez, A.; Pesce de Ruiz Holgado, A. and
Font de Valdez, G. (1996). Bile Tolerance and cholesterol reduction by Enterococcus
faecium, a candidate microorganism for the use as a dietary adjunt in milk products.
Milchwissenschaft 51, 383-385.
24. Miller, J.H. (ed.) (1972). Assay of -galactosidase. In: Experiments in Molecular genetics,
352-355. Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.
25. Biavati, B.; Sozzi, T.; Mattarelli, P. and Trovatelli, L.D. (1992) Survival of bifidobacteria
from human habitat in acidified milk. Microbiologica, 15, 197-200.
26. Reniero, R.; Morelli L.; de Haen C. and Bottazzi V. (1991) Detection of permanent
Lactobacillus casei subsp. casei strains in weaned infants’ gut. Letters in Applied
Microbiology 13, 3-6.
27. Xanthopoulos, V.; Ztaliou, I.; Gaier, W.; Tzanetakis, N. and Litopoulou-Tzanetaki, E.
(1999) Differentiation of Lactobacillus isolates from infant faeces by SDS-PAGE and
rRNA-targeted oligonucleotide probes. Journal of Applied Microbiology 87, 743-749.
219
Bibliografía
28. Prasad, J.; Gill, H.; Smart, J. and Gopal, P.K. (1999) Selection and characterisation of
Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics. International Dairy
Journal 8, 993-1002.
29. Quiberoni, A.; Tailliez, P.; Quénée, P.; Suarez, V. and Reinheimer, J. A. (1998) Genetic
(RAPD-PCR) and technological diversities among wild Lactobacillus helveticus
strains. Journal of Applied Microbiology, 85, 591-596.
30. Marteau, P.; Minekus, M.; Havennar, R. and Huis in’t Veld, J.H.J. (1997) Survival of
lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation
and the effects of bile. Journal of Dairy Science, 80, 1031-1037.
31. Lankaputhra, W.E.V. and Shah, N.P. (1995) Survival of Lactobacillus acidophilus and
Bifidobacterium spp. in the presence of acid and bile salts. Cultured Dairy Products
Journal 30, 2-7.
32. Chou, L. and Weimer, B. (1999) Isolation and characterization of acid- and bile-tolerant
isolates from strains of Lactobacillus acidophilus. Journal of Dairy Science, 82, 23-
31.
33. Usman and Hosono, A. (1999) Viability of Lactobacillus gasseri and its cholesterol-
binding and antimutagenic activities during subsequent refrigerated storage in
nonfermented milk. Journal of Dairy Science, 82, 2536-2542.
34. Kociubinski, G.; Pérez, P. and De Antoni, G. (1999) Screening of bile resistance and bile
precipitation in lactic acid bacteria and bifidobacteria. Journal of Food Protection, 62,
8, 905-912.
35. Bottazzi, V.; Zacconi, C. e Sarra, P.G. (ed.) (1985). Probiotica con Batteri Lattici.
Futurgraf, Milano, Italia, p. 37 - 86.
220
Bibliografía
36. Usman and Hosono, A. (1999) Bile tolerance, taurocholate deconjugation, and binding of
cholesterol by Lactobacillus gasseri strains. Journal of Dairy Science, 82, 243-248.
37. Walker, D.K. and Gilliland, S.E. (1993) Relationships among bile tolerance, bile salt
deconjugation and assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. Journal of
Dairy Science, 76, 956-961.
38. Buck, L.M. and Gilliland, S.E. (1994) Comparisons of freshly isolated strains of
Lactobacillus acidophilus of human intestinal origin for ability to assimilate
cholesterol during growth. Journal of Dairy Science, 77, 10, 2925-2933.
39. Brashears, M.M.; Gilliland, S.E. and Buck, L.M. (1998) Bile salt deconjugation and
cholesterol removal from media by Lactobacillus casei. Journal of Dairy Science, 81,
2103-2110.
40. Klaver, F.A.M. and Van der Meer, R. (1993) The assumed assimilation of cholesterol by
lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugating activity.
Applied and Environmental Microbiology, 59,4, 1120-1124.
41. Shah, N. and Jelen, P. (1990) Survival of lactic acid bacteria and their lactases under
acidic conditions. Journal of Food Science, 55, 2, 506-509.
42. Hughes, D.B. and Hoover, D.G. (1995) Viability and enzymatic activity of bifidobacteria
in milk. Journal of Dairy Science, 78, 268-276.
43. Mustapha, A.; Jiang, T. and Savaiano, D.A. (1997) Improvement of lactose digestion by
humans following ingestion of unfermented acidophilus milk: influence of bile
sensitivity, lactose transport, and acid tolerance of Lactobacillus acidophilus. Journal
of Dairy Science, 80, 1537-1545.
221
Bibliografía
44. Pérez, P.F.; Minnaard, Y.; Disalvo, E.A. and De Antoni, G.L. (1998) Surface Properties of
Bifidobacterial Strains of Human Origin. Applied and Environmental Microbiology,
21-26.
45. Gómez Zavaglia, A.; Kosiubinsky, G.; Pérez P.F. and De Antoni, G.L. (1998) Isolation
and Characterization of Bifidobacterium Strains for Probiotics Formulation. Journal of
Food Protection, 61, 7, 865-873.
46. Kiely, L.J. and Olson, N.F. (2000) The physicochemical surface characteristics of
Lactobacillus casei. Food Microbiology, 17, 277-291.
47. Gonzáles, S.N.; Apella, M.C.; Romero, N.C.; Nader de Macías, M.E. and Oliver, G.
(1993) Inhibition of enteropathogens by lactobacilli strains used in fermented milk.
Journal of Food Protection, 56, 9, 773-776.
48. Dubois, G.; Smoragiewicz, W.; Charbonneau, R. et Gagnon, M. (1982) Inhibition de
quelques bactéries pathogénes et potentiellement pathogénes par Streptococcus lactis,
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus helveticus.
Lait, 62, 681-687.
49. Xanthopoulos, V.; Litopoulou-Tzanetaki, E. and Tzanetakis, N (2000) Characterization of
Lactobacillus isolates from infant faeces as dietary adjuncts. Foood Microbiology, 17,
205-215.
50. Lortie, L.; Simard, R.E. and Lavoie, M.C. (1992) Characterization of the antimicrobial
substances produced by four Lactobacillus casei strains. Microbiologie-Aliments-
Nutrition, 10, 389-400.
51. Kailasapathy, K. and Rybka, S. (1997) L. acidophilus and Bifidobacterium spp.- their
therapeutic potential and survival in yogurt. The Australian Journal of Dairy
Technology 52, 28-35.

222
Bibliografía
52. Gomez, A.M.P.; Teixeira, M.G.M. and Malcata, F.X. (1998) Viability of Bifidobacterium
lactis and Lactobacillus acidophilus in milk: sodium chloride concentration and
storage temperature. Journal of Food Processing and Preservation, 22, 221-240.
53. Gomes, A.M.P.; Malcata, F.X.; Klaver, F.A,M. and Grande, H.J. (1995) Incorporation and
survival of Bifidobacterium sp. Strain Bo and Lactobacillus acidophilus strain Ki in a
cheese product. The Netherland Milk Dairy Journal 49: 71-95.
54. Gomes, A.M.P.; Vieira, M.M. and Malcata, F, X. (1998) Survival of probiotic microbial
strains in a cheese matrix during ripening: simulation of rates of salt diffusion and
microorganism survival. Journal of Food Engineering, 36, 281-301.
55. Reddy, K.A. and Marth, E.H. (1995) Lactic acid bacteria in Cheddar cheese made with
sodium chloride, potassium chloride or mixtures of the two salts. Journal of Food
Protection, 58, 62-69.
56. Nighswonger, B.D.; Brashears, M.M. and Gilliland, S.E. (1996) Viability of Lactobacillus
acidophilus and Lactobacillus casei in fermented milk products during refrigerated
storage. Journal of Dairy Science, 79, 212-219.
57. Gilliland, S.E. y Speck, M.L. (1997) Instability of Lactobacillus acidophilus in yogurt.
Journal of Dairy Science, 60, 1394-1399.
58. Sanders, M.E.; Walker, D.C.; Walker, K.M.; Aoyama, K. and Klaenhammer, T.R. (1996)
Performance of commercial cultures in fluid milk applications. Journal of Dairy
Science, 79, 943-955.
59. Shah, N.P. and Ravula, R.R. (2000) Influence of water activity on fermentation, organic
acids production and viability of yogurt and probiotic bacteria. The Australian Journal
of Dairy Technology, 55, 3, 127-131.
223
Bibliografía
60. Shah, N.P.; Lankaputhra, W.E.V.; Britz, M.L. y Kyle, W.S.A. (1995) Survival of
Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum in commercial yoghurt during
refrigerated storage. International Dairy Journal, 5, 515-521.
61. Vinderola, C.G.; Bailo, N.B and Reinheimer, J.A. (2000) Survival of probiotic microflora
in Argentinian yoghurts during refrigerated storage. Food Research International, 33,
97-102.
224
Anexo
8.1 Medios de Cultivo.
8.1.1 Medios de cultivo no selectivos
Medio Stuart
Tioglicolato de sodio 0.9 g
Glicerofosfato de sodio 10.0 g
Cloruro de calcio 0.1 g
Azul de metileno 0.002 g
Agar 3.0 g
Agua destilada 1000 ml
pH 7.4  0.2
Se disuelven 7.5 g de medio de cultivo en 1000 ml de agua destilada. Esterilizar
durante 15 min. a 121ºC.
Agua de Peptona 0.1% (p/v)
Se disuelve 1.0 g de peptona de caseína en 1000 ml de agua destilada. Fraccionar en
tubos de a 10 ml. Esterilizar durante 15 min. a 121ºC.
226
Anexo
Agar Plate Count
Extracto de levadura 2.5 g
Tripteína 5g
Glucosa 1g
Agar 15 g
pH 7.0  0.2
Se suspendieron 23.5 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada, se
calienta hasta total disolución, se fracciona en caso que fuera necesario. Esterilizar durante 15
min. a 121ºC.
Agar MRS
Polipeptona 10 g
Extracto de carne 10 g
Extracto de levadura 5g
Glucosa 20 g
Tween 80 1,08 g
K2HPO4 2g
Acetato de sodio 5g
Citrato de amonio 2g
227
Anexo
MgSO4 0,2 g
MnSO4 0,05 g
Agar 15 g
pH 6.4  0.2
Se disuelven los componentes del medio en agua destilada y se calienta si es
necesario. Esterilizar durante 15 min. a 121ºC.
Caldo MRS
Polipeptona 10 g
Glucosa 20 g
Fosfato dipotásico 2g
Acetato de sodio 5g
Sulfato de magnesio 0.2 g
Sulfato de manganeso 0.05 g
Tween 80 1.08 g
pH 6.4  0.2
228
Anexo
Caldo MRS adicionado de glicerol
Se preparan 1000 ml de Caldo MRS y se le adiciona 150 ml de glicerol. Esterilizar
durante 15 min. a 121ºC.
Caldo Elliker
Triptona 20.0 g
Gelatina 2.5 g
Lactosa 5.0 g
Sucrosa 5.0 g
Glucosa 5.0 g
Acetato de sodio 1.5 g
Cloruro de sodio 4.0 g
Ácido ascórbico 0.5 g
pH 6.8  0.2
229
Anexo
Agar Elliker
Se prepara un caldo Elliker al cual se le adiciona 15.0 g de agar por cada 1000 ml de
caldo. Esterilizar durante 15 min. a 121ºC.
Caldo Triptona Soja (TS)
Peptona de caseína 17.0 g
Peptona de soja 3.0 g
D(+)-Glucosa 2.5 g
NaCl 5.0 g
Fosfato dipotásico 2.5 g
pH 7.3  0.2
230
Anexo
Caldo BHI
Infusión de cerebro 20.0 g
Infusión de corazón 25.0 g
Peptona 10.0 g
D(+)-Glucosa 2.0 g
NaCl 5.0 g
Fosfato dipotásico 2.5 g
pH 7.4  0.2
Agar BHI
Se prepara un caldo BHI al cual se le adiciona 15.0 g de agar por cada 1000 ml de
caldo. Esterilizar durante 15 min. a 121ºC.
Agar Nutritivo
Peptona de carne 5.0 g
Extracto de carne 3.0 g
231
Anexo
Agar 12.0 g
pH (25°C) 7.0  0.2
Leche descremada reconstituida (LDR)
Se disuelven 100 g de leche en polvo descremada en 1000 ml de agua destilada
precalentada a 40ºC, se fracciona en caso que fuera necesario. Esterilizar durante 30 min. a
115ºC.
Medio semisólido Gibson
D(+) -Glucosa 50 g
MnSO4 4H2O 0.4%, pH 6.5 10 ml
(o Jugo de tomate) 100 ml
Leche descremada reconstituida (10%) 800 ml
Agar Nutritivo 200 ml
pH (25°C) 6.5  0.2
232
Anexo
Se mezcla el jugo de tomate (o la solución de MnSO4 4H2O) con la leche descremada
reconstituida y calentando, se agrega el extracto de levadura y la D(+)Glucosa. Se adiciona el
agar nutritivo y se ajusta el valor de pH en 6.5. fraccionar en tubos de 10 ml. Esterilizar
durante 30 min. a vapor fluente, 3 días sucesivos. Después de cada esterilización se enfría
rápidamente en baño de agua fría.
API 50 CHL
Polipeptona 10 g
Tween 80 1 ml
Acetato de sodio.3H2O 5g
Citrato diamónico 2g
Sulfato de magnesio.7H2O 0.20 g
Sulfato de manganeso.4H2O 0.05 g
Púrpura de bromocresol 0.17 g
pH (25°C) 6.9  0.1
Se disuelven los componente en el agua destilada. Esterilizar durante 15 min. a 121ºC.
233
Anexo
8.1.2 Medios de cultivo selectivos
Agar MRS-Bilis
Agar MRS fundido y atemperado a 50 ºC, al cual se adicionan 1,5 ml cada 100 ml de
medio agarizado de una solución de bilis al 10%. La solución de bilis se esteriliza en
autoclave a 121ºC por 20 minutos.
Agar MRS-LP
Agar MRS al cual se adiciona una solución de Cloruro de Litio y Propionato de Sodio.
Las concentraciones finales de las sales en el medio de cultivo deben ser:
Cloruro de Litio 2g/l
Propionato de Sodio 3g/l
Las sales se pueden agregar al medio deshidratado antes de la esterilización (15 min. a
121ºC).
234
Anexo
8.1.3 Medios de cultivo modificados
Agar MRS-TC, MRS-TDC, MRS-GC y MRS-GDC
Agar MRS, al cual se adicionaron las sales biliares de manera tal de alcanzar en el
medio una concentración final de 0.5 g% (p/v). Esterilizar durante 15 min. a 121ºC.
Caldo MRS base - Lactosa
Peptona 10 g
Acetato de sodio 5g
Sulfato de magnesio.7H2O 0.2 g
Sulfato de manganeso.4H2O 0.05 g
Tween 80 1.08 g
pH 6.4  0.2
235
Anexo
Se pesaron 20 g de lactosa, se disolvieron en agua destilada y se llevaron a 100 ml.
Esterilizar por filtración. Esta solución se agrega al caldo de manera tal que la concentración
final del azúcar sea 0.1% (p/v).
8.2 Reactivos
Buffer Fosfato de Potasio pH 6.5
Se prepararon soluciones de fosfato monoácido de potasio 1M y fosfato diácido de
potasio 1M, mezclando 38.1 ml de la primera con 61.9 ml de la segunda. De esta manera
queda constituido el buffer fosfato de potasio de pH 6.5. Esterilizar durante 15 min. a 121ºC.
Mezcla Tolueno : Acetona
Se realizó una mezcla de 1 parte de tolueno en 9 partes de acetona. Se conservó la
mezcla en refrigeración.
Solución de ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiranósido)
Se disolvieron 40 mg de ONPG en 10 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración y
conservar a –20ºC.
236
Anexo
8.3 Tablas
237
Anexo
238
Anexo
Tabla 23- Patrón simplificado de fermentación de carbohidratos para el género Lactobacillus. Manual
de Bergey (9).
Especie Celobiosa Gluconato Manitol Manosa Melezitosa Ribosa
Lactobacillus del + - - + - -
grupo 1
Lactobacillus - - + - - -
salivarius
Lactobacillus del + + + + + +
grupo casei
En color rojo se indican los carbohidratos típicamente fermentados por cada grupo.
239
Anexo
240
Anexo
241

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Villarreal Fernanda - 2002 -

Universidad Nacional del Litoral

Tesis presentada como parte de los requisitos de la

Programa de Lactología Industrial (PROLAIN)

Bqca. Fernanda Villarreal

Director: Dr. Jorge Alberto Reinheimer

 Al Dr. Jorge Alberto Reinheimer, mi Director de tesis, por

 A Gabriel, por su amistad, compañerismo y por brindarme

 A Andrea, por su amistad permanente y los lindos

 A Viviana, Nanci, Ana, Mario y todos mis compañeros del

El consumidor contemporáneo cada vez se encuentra más expuesto a los nuevos

“alimentos funcionales”. Entre ellos, los ya conocidos Probióticos ofrecen no sólo

“mejoradores de la salud del huésped”. Esto se basa en la interacción con la microflora

Probiótico puede definirse como “monocultivo o cultivo mixto de microorganismos

beneficioso en el huésped a través del mejoramiento de las propiedades de la microflora

indígena”. También se incluyen en esta definición a componentes bacterianos que pueden

contribuir a tales efectos.

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y Bifidobacterium spp.

deberá ser activo, no generar respuestas inmunológicas adversas, ni respuestas tóxicas,

alérgicas, mutagénicas o carcinógenas, ser genéticamente estables y mantenerse viables

durante el procesamiento y almacenamiento del producto que los vehiculiza.

La capacidad de sobrevivir al proceso enzimático de la digestión, la acidez gástrica y

fundamentales para su uso.

En el mundo existe una gran variedad de productos lácteos fermentados y no

fermentados, formulados con bacterias probióticas (Lactobacillus y Bifidobacterium): leches

considerable variedad de postres.

humano, para luego caracterizarlas desde el punto de vista probiótico y tecnológico.

y por técnicas de aislamiento y purificación que emplean medios de cultivo selectivos y no

selectivos, se obtuvieron 54 aislamientos que respondían a la morfología celular de interés.

Posteriormente se identificaron bioquímicamente (fermentación de carbohidratos), resultando

50 de ellos pertenecientes a la especie Lactobacillus casei y 4 a Lactobacillus acidophilus. Sin

de identificación: Lactobacillus casei se asignó como Lactobacillus rhamnosus y

Lactobacillus acidophilus como Lactobacillus gasseri.

En relación a la resistencia de los aislamientos frente a las barreras biológicas del

tracto gastrointestinal humano, se estudió la tolerancia de los mismos al exponerlos a una

solución gástrica simulada (Método de Desarrollo en Medio Líquido), resultando su

de la concentración de 0.6% de bilis, se observaron halos de inhibición del crecimiento

Lactobacillus gasseri, que demostraron la mayor resistencia.

1. Deconjugación de ácidos biliares, para lo cual se formularon medios de

cultivos agarizados que contenían cuatro ácidos biliares, individualmente (taurocolato de

sodio, taurodeoxicolato de sodio, glicolato de sodio, glicodeoxicolato de sodio). Como

de deconjugación fueron las cepas de Lactobacillus gasseri.

2. Actividad de -galactosidasa. El mismo se realizó con el método de Miller. En

este estudio, no se detectó actividad de esta enzima en las cepas aisladas.

3. En el estudio de Hidrofobicidad, basado en el equilibrio de distribución de los

aislamientos porcentajes de hidrofobicidad moderados.

4. Para estudiar el poder inhibitorio que los aislamientos poseían frente a

bacterias patógenas, se empleó el Ensayo de Difusión en Agar (EDA) observándose,

Para caracterizar tecnológicamente los aislamientos, se procedió a realizar los

1. Resistencia al pH, para lo cual se sembraron los aislamientos en caldo

efecto inhibitorio para algunos aislamientos a pH 4.5.

2. Viabilidad de los aislamientos en leche acidificada, a 5ºC. Se realizaron

láctico en la leche y la refrigeración no afectaron la viabilidad celular.

3. Resistencia a compuestos de aroma. Al igual que en el estudio de resistencia al

ensayo, se encontró que frente a ambos compuestos (diacetilo y acetaldehído) no se

observaron efectos inhibitorios sobre el crecimiento.

4. Resistencia a sales. En este ensayo, se empleó el mismo método antes

5. Interacción entre los aislamientos intestinales y bacterias lácticas de starters. Se

empleó el método de Ensayo de Difusión en Agar (EDA). Como resultado, se encontró