1. Describa los principios generales de extracción de ADN.

El ADN se encuentra en el núcleo celular, muy replegado y unido a proteínas formando la

cromatina. Para extraerlo es necesario homogeneizar el tejido, romper las células para separar
el núcleo, romper el núcleo y liberar el ADN, separar las proteínas y precipitarlo para extraerlo
de la solución. El ADN aparecerá como un agregado de fibras blanquecinas que se adhiere.

Purificación de ADN:

1. Fragmentación del tejido (Homogenización del tejido): La homogeneización, mecánica

o química, consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción con
las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético, es decir no es más que la
disociación de las células para que pierdan contacto entre ellas y así volverse más
vulnerables a la lisis celular.
2. Lisis celular: Rotura de las membranas celulares y nucleares para liberar el ADN. Entre los
procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecánica (trituración, lisis
hipotónica, etc.); tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con
tioles) y digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).
3. Clarificación: Separación de los ácidos nucleicos de los restos celulares. La clarificación se
puede realizar por centrifugación, filtración o por método mixto de enzimas + centrifugación.
4. Purificación: Separación del ADN de proteínas solubles, de otros ácidos nucleicos no
deseados, de lípidos, de carbohidratos, de sales y otros compuestos orgánicos. Los métodos
empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser
combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes: Extracción/precipitación (Ej. Salting
out y la desproteinización con fenol, Cromatografía (de intercambio iónico, de adsorción
selectiva, de permeación sobre gel), Centrifugación y Separación por afinidad.
5. Análisis: puede ser cualitativo determinando la calidad del ADN (electroforesis) o
cuantitativo para determinar la concentración de ADN (espectrofotometría UV).
2. Diga usted para qué utilizamos detergente en el procedimiento.

Las membranas de las células están formadas por dos capas de lípidos con proteínas
transmembrana a través de estas. El detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de
las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear. Los lípidos de la membrana se
descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la membrana junta.
Cuando el detergente se pone en contacto con los lípidos éstos se separan de la membrana
rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso hace que se
combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos.

3. Diga usted para qué utilizamos alcohol en el procedimiento.

Como se verá a continuación, los alcoholes se utilizan en prácticamente todos los métodos de
purificación de ácidos nucleicos. Si la concentración de alcohol (habitualmente etanol o
isopropanol) es suficientemente elevada, tanto DNA como RNA se hacen insolubles y pueden
precipitarse mediante centrifugación. Esta precipitación requiere la presencia de sales. Los
alcoholes retiran el agua que hidrata los ácidos nucleicos y, al ser menos polares que ella –
dicho con más precisión, son disolventes con una menor constante dieléctrica– favorecen la
unión de los cationes a los grupos fosfato, convirtiendo a los ácidos nucleicos en moléculas
 neutras que pueden agregarse y precipitar. La precipitación alcohólica es a menudo la etapa
final, en la que se consigue completar la purificación y, además, concentrar el material.

El DNA es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy baja temperatura hace que
se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado justo entre la capa con
etanol líquido y la capa con el extracto. El DNA es el único componente de la solución que no
es soluble en el etanol, y se hace visible porque las diferentes cadenas se van aglutinando entre
sí al precipitar debido a la acción de fuerzas físicas. El alcohol es menos denso que el agua del
extracto y por eso flota sobre la capa del extracto.

4. Diga usted qué tipo de enzimas contienen los suavizadores de carne y el jugo de piña
y para qué los utilizamos en este experimento.

Al lisar las células se libera una gran cantidad de proteínas, algunas de estas proteínas tienen
como función degradar al ADN de patógenos como las bacterias y los virus. Si no se detienen
a estas proteínas (nucleasas) nuestro ADN será degradado. Para evitarlo se agrega el
ablandador de carne que contiene papaína. La papaína es una enzima que se extrae del fruto
llamado papaya. Las propiedades proteolíticas de la papaína provocan la ruptura de múltiples
enlaces en las proteínas animales. La papaína bruta, contiene un poco de agua, glúcidos,
ácidos orgánicos y una mezcla de enzimas, donde destacan las denominadas proteasas que
actúan rompiendo los enlaces peptídicos en cualquier lugar de la cadena peptídica en la que se
hallen situados.

El jugo de piña contiene la enzima bromelina, la cual es una enzima digestiva proteolítica que
contiene azufre; la cual digiere proteínas y remueve contaminantes a partir de las preparaciones
de ácidos nucleicos. Se emplean para proteger el ADN de la acción de enzimas nucleasas.

5. Diga usted cuántos usos se le puede dar al ADN una vez extraído.
- Fabricación de fármacos con genética - Ingeniería genética
recombinante - Secuenciación del ADN
- Terapia génica - Diagnóstico molecular de ADN
- Medicina forense - Organismos genéticamente modificados
- Análisis de la escena de un crimen - Estudios de variación genética
- Investigación de trastornos genéticos - Pruebas de paternidad
- Detección de cepas de virus y bacterias
6. Diga usted que relevancia tiene el ADN en el diagnóstico clínico.

El ADN tiene una gran relevancia al diagnosticar o determinar una enfermedad, dado que a
través de este se pueden diagnosticar enfermedades genéticas, las cuales requieren un
examen de ADN para ser diagnosticadas, además se implementa esta prueba en los fetos para
así, diagnosticar malformaciones o enfermedades a las que estará predispuesto, además se
necesita del ADN para observar la evolución de dichas enfermedades, en conclusión el examen
de ADN es un gran complemento para un diagnóstico y tratamiento integral.

7. Diga usted cuáles son las funciones biológicas del ADN.

Las funciones más destacadas y relevantes que se pueden señalar son:

- Codificación de proteínas (transcripción y traducción)

- Almacena información genética (genes y genoma humano)
- Autoduplicación (replicación de ADN) para asegurar así la transmisión de la información
a las células hijas durante la división celular.
- Control de la actividad de la célula
- Permite la capacidad de cambiar su información (mutación) para así realizar cambios
evolutivos y permitir la adaptación humana a diversos entornos.
8. Diga usted cuáles son las diferencias en cuanto a la extracción de ADN y ARN.

ADN ARN
 El ADN es muy estable y sólo se requiere  ARN total o Sub-celular (citosólico y
mantener las muestras congeladas antes nuclear)
de su extracción.  Primero es necesario agregarle una
 Inicialmente es necesario llevar a cabo solución que estabilice al ARN lo antes
una lisis para liberar al ADN del interior posible.
celular.  Se minimiza la actividad de ARNasa
 Algunos paquetes comerciales de alto liberadas de las células lisadas.
rendimiento son: PURIGEN, QUIAGEN,  Extracción con fenol ácido (pH 4.5).
MILIPORE, GENTRA y MoBio.  Paquetes comerciales de compañías
como QIAGEN, Ambion y RNA-works
Por etapas de la extracción se puede señalar:

Etapa ADN ARN

Lisis celular Tiene sus sustancias específicas como:
Tiene sus sustancias
- CTAB específicas como:
- SDS - SARKOSYL
- Tris-HCL - TRITÓN X
- EDTA, - ISOCIANATO DE
- -MERCAPTOETANOL GUANIDINA
- FENOL.
Purificación Al igual que la lisis celular tienen Al igual que la lisis celular
sustancias específicas como: tienen sustancias específicas
- Proteinasas como:
- Sustancias orgánicas - Cloroformo
- Sales
Precipitación Tienen sus sustancias específicas: Tienen sus sustancias
- Alcoholes específicas:
- Alcoholes + sal - Alcoholes
Lavado El lavado se hace con: El lavado se hace con:
- ETANOL 70% - ETANOL 70%
Rehidratación En la rehidratación se utiliza: En la rehidratación se utiliza:
- TE ó H2O - H2O tratada con
DEPC
Almacenamiento Se almacena en temperaturas de: - 20º Se almacena en
temperaturas de: - 70º

9. Diga usted qué principio de extracción se usa para ADN plasmídico.

Las técnicas de Minipreps o mini preparaciones de plásmidos, permiten la recuperación de

plásmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las células con una
base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas,
ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario, la
configuración superenrrollada del plásmido se mantiene estable.

Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina, pero todos se rigen por los siguientes
pasos básicos.
  Remover las células del medio de cultivo en caldo mediante centrifugación.
 Descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la pared
celular del huésped.
 Resuspender las células en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa.
 Lisar las células con NaOH y SDS.
 Unión de las hebras de DNA y remoción de contaminación mediante el acetato de
potasio.
 Precipitación del DNA de plasmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal
(Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio).
 Enjuague del material genético con EtOH al 70%.
 Resuspender el material genético.
10. Explique usted por qué la concentración de ADN se mide a 260 nm.

Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de
onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. La absorbancia máxima de las soluciones de
ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas, a 280 nm.

11. Indique usted qué tipo de contaminantes podemos encontrar en un extracto de ADN.

El objetivo de extraer ADN es obtener preparaciones enriquecidas en esta molécula. Sin

embargo, el ADN está asociado con proteínas (histonas) e inmerso en un medio que contiene
estructuras de composición química diversa. Además, los reactivos empleados en los procesos
iniciales de purificación se convierten en agentes contaminantes. Las metodologías para retirar
los contaminantes de una preparación de ADN incluyen:

- La centrifugación a altas velocidades

- La electroforesis
- La separación a través de columnas e incluso la utilización de imanes
(biomagnética) para obtener preparaciones de alta pureza.

Un contaminante generalmente presente en preparaciones de ADN es el ARN (ácido

ribonucleico). Esta molécula se degrada por incubación con la enzima ARNasa.
12. Explique usted por qué la medición de una muestra de ADN a 260/280 nos da
información sobre la pureza de la muestra.

La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando

con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un
«cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para
calcular la pureza de los ácidos nucleicos.

La absorbancia máxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las

soluciones de proteínas, a 280 nm. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben
parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen proteínas hacen lo propio a 260 nm, el cociente
de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimación del
grado de pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el
ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorción a 230 nm significa que la muestra
está contaminada con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras
sustancias.
Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1
corresponde aproximadamente a 50 μg/ml de ADN bicatenario, 37 μg/ml de ADN
monocatenario, 40 μg/ml de ARN o 30 μg/ml de oligonucleótidos. Si la muestra también contiene
proteínas, el cociente A260/A280 será considerablemente inferior a dichos valores y no podrá
determinarse con exactitud la cantidad de ácidos nucleicos.

En resumen:

La lectura a 260 nm indica la presencia de ácidos nucleicos (longitud de onda promedio a la

cual absorben las bases nitrogenadas) y la lectura a 280 nm mide la presencia de proteínas
contaminantes (longitud de onda promedio a la cual absorben los aminoácidos aromáticos), por
lo que el cociente 260/280 debe ser igual o mayor de 1.6 para ADN y 1.8 para ARN para
considerarlos aceptablemente puros.

13. Diga para qué fines se puede utilizar el ADN genómico humano.
 Ingeniería genética y criminalística:
 Biotecnología
 Bioinformática
 Nanotecnología del ADN
 Medicina forense
14. Cuando realizamos una extracción de ADN, aparte de concentración y pureza, ¿qué
otros parámetros de calidad de la extracción de ADN se deben investigar?

Los parámetros de la calidad de la extracción de ácidos nucleicos incluyen:

- La concentración
- La pureza
- La integridad
- El alto rendimiento de la muestra
- La exactitud
- Fiabilidad para reproducir los datos.
15. Diga usted para que utilizamos la sal en este procedimiento.

El NaCl en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que
precipiten y se separen más fácilmente del ADN. La acción de la sal es cubrir las terminales
fosfatos negativos, permitiendo así que los extremos se unan y el ADN precipite en la solución
de alcohol, debido a que el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos.

16. Para qué se hace uso de la licuadora en este procedimiento.

La licuadora ayuda en la rotura de membranas celulares y cubiertas nucleares, permitiendo la

separación del ADN. Rompe las células y expone las paredes celulares y membranas a la
acción del detergente.