SDS Electroforesis en Gel de Poliacrilamida de Proteínas

SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas
John M. Walker
1. Introducción
SDS-PAGE es el método más utilizado para analizar cualitativamente mezclas de proteínas. Es

particularmente útil para controlar la purificación de proteínas y porque El método se basa en la
separación de proteínas según el tamaño, el método también puede ser se usa para determinar la
masa molecular relativa de las proteínas (ver Nota 14).
1.1. Formación de geles de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida reticulados se forman a partir de la polimerización de acrilamida.

monómero en presencia de pequeñas cantidades de N, N'-metilen-bis-acrilamida (normalmente
denominado "bis-acrilamida") (Fig. 1).
Tenga en cuenta que la bis-acrilamida es esencialmente dos moléculas de acrilamida unidas por
un grupo metileno y se usa como reticulación agente.
El monómero de acrilamida se polimeriza de la cabeza a la cola en largas cadenas, y

ocasionalmente se construye una molécula de bis-acrilamida en la cadena en crecimiento,
introduciendo así un segundo sitio para la extensión de la cadena.
Procediendo de esta manera, una matriz reticulada de estructura bastante bien definida se forma
(Fig. 1).
La polimerización de la acrilamida es un ejemplo de catálisis por radicales libres, y se inicia
mediante la adición de amonio persulfato y la base N, N, N ', N'tetramethylenediamine (TEMED).
TEMED cataliza la descomposición del ion persulfato para dar un radical libre (es decir, una
molécula con un electrón no apareado):
Si este radical libre se representa como R "(donde el punto representa un electrón no apareado) y
M como una molécula de monómero de acrilamida, entonces la polimerización se puede
representar de la siguiente manera:
De esta manera, se forman largas cadenas de acrilamida, que se reticulan mediante la

introducción de la molécula ocasional de bis-acrilamida en la cadena en crecimiento.
Oxígeno "limpia" los radicales libres y, por lo tanto, la mezcla de gel se desgasifica normalmente
(las soluciones se colocan brevemente al vacío para eliminar el oxígeno disuelto libremente) antes
de adición del catalizador.
1.2. El uso de geles apilables
Tanto para SDS como para geles tampón, las muestras se pueden aplicar directamente a la parte
superior del gel en qué separación de proteínas se va a producir (el gel de separación). Sin
embargo, en estos casos, el La agudeza de las bandas de proteínas producidas en el gel está
limitada por el tamaño (volumen) del muestra aplicada al gel.
Básicamente, las bandas separadas serán tan amplias (o más amplias, debido a la difusión) como la
banda de muestra aplicada al gel.
Para algunos trabajos, esto puede ser aceptable, pero la mayoría de los trabajadores requieren
una mejor resolución que esta. Esto se puede lograr polimerizando un gel de apilamiento corto en
la parte superior del gel de separación. El propósito de esto el gel de apilamiento es concentrar la
muestra de proteína en una banda afilada antes de que ingrese al gel de separación principal,
dando así bandas de proteína más nítidas en el gel de separación. Esta modificación permite que
se apliquen volúmenes de muestra relativamente grandes al gel sin ningún tipo de pérdida de
resolución
El gel de apilamiento tiene un tamaño de poro muy grande (4% de acrilamida) que permite que las
proteínas se muevan libremente y se concentren, o se acumulen bajo el efecto de campo eléctrico.
La concentración de la muestra se produce por isotacoforesis de la muestra en El gel de

apilamiento. El efecto de nitidez de la banda (isotacoforesis) se basa en el hecho de que Los iones
de glicinato cargados negativamente (en el tampón del depósito) tienen una movilidad
electroforética más baja que los complejos proteína-SDS, que a su vez tienen una movilidad más
baja. que los iones C1- si están en una región de mayor intensidad de campo. La fuerza del campo
es inversamente proporcional a la conductividad, que es proporcional a la concentración. Té El
resultado es que las tres especies de interés ajustan sus concentraciones para que [C1 -]>
[proteína-SDS]> [glicinato]. Solo hay una pequeña cantidad de proteína - SDS complejo, entonces
se concentran en una banda muy apretada entre los límites de glicinato y iones C1-. Una vez que el
glicinato alcanza el gel de separación, se ioniza más completamente en el Mayor pH ambiente y
aumenta su movilidad. (El pH del gel de apilamiento es 6.8 y la del gel de separación es 8.8.) Por lo
tanto, la interfaz entre el glicinato y el
SDS-PAGE 57 Los iones C1 dejan los complejos de proteína-SDS, que se dejan electroforesis en sus
propias tarifas Una descripción más detallada de la teoría de isotachophoresis y electroforesis
generalmente se da en la ref. (1)
1.3. SDS-PAGE
Las muestras que se ejecutarán en SDS-PAGE se hierven primero durante 5 minutos en un tampón
de muestra que contiene 13-mercaptoetanol y SDS. El mercaptoetanol reduce los puentes
disulfuro presentes que mantienen unida la estructura terciaria de proteínas. SDS (CH3- [CH2] 10 -
CH2OSO ~ Na § es un detergente aniónico y se une fuertemente a la proteína y la desnaturaliza.
Por lo tanto, cada proteína en la mezcla está completamente desnaturalizada por este tratamiento
y se abre en una estructura en forma de barra con una serie de moléculas SDS cargadas
negativamente a lo largo de la cadena de polipéptidos. En promedio, una molécula SDS se une por
cada dos residuos de aminoácidos La carga nativa original en la molécula es por lo tanto
completamente inundado por las moléculas SDS. El buffer de muestra también contiene un
seguimiento ionizable colorante usualmente azul de bromofenol que permite monitorear el
recorrido electroforético, y sacarosa o glicerol que da densidad a la solución de muestra,
permitiendo así que la muestra para asentarse fácilmente a través del tampón de electroforesis en
el fondo cuando se inyecta en el cargando bien Cuando el gel de separación principal
(normalmente unos 10 cm de largo) ha sido se vierte entre las placas de vidrio y se deja fraguar, un
gel de apilamiento más corto (aproximadamente 2 cm) se vierte sobre el gel de separación, y es en
este gel donde se forman los pocillos y las proteínas cargadas. Una vez que se cargan todas las
muestras, se pasa una corriente a través del gel. Una vez que las muestras de proteínas pasaron
por el gel de apilamiento y entraron el gel de separación, los complejos de proteína-SDS cargados
negativamente continúan moviéndose hacia el ánodo, y debido a que tienen la misma carga por
unidad de longitud, viajan en el gel de separación debajo del campo eléctrico aplicado con la
misma movilidad. Sin embargo, a medida que pasan a través del gel de separación, las proteínas se
separan, debido a la propiedades de tamizado molecular del gel. En pocas palabras, cuanto más
pequeña es la proteína, más fácilmente puede pasar a través de los poros del gel, mientras que las
proteínas grandes son sucesivamente retardado por la resistencia a la fricción debido al efecto de
tamizado del gel. Ser un pequeño molécula, el colorante azul de bromofenol es totalmente no
retardado y por lo tanto indica el electroforesis frontal. Cuando el tinte alcanza el fondo del gel, la
corriente cambia fuera y el gel se retira de entre las placas de vidrio, se agita en una mancha
adecuada solución (por lo general, azul brillante de Coomassie) durante algunas horas y luego se
lavó en una mancha Solución para la noche. La solución de eliminación de manchas elimina el tinte
de fondo no unido del gel, dejando proteínas teñidas visibles como bandas azules sobre un fondo
claro. Un gel típico tomaría 1-1.5 h para prepararse y establecerse, 3 h para correr a 30 mA, y
tener un tiempo de tinción de 2-3 h con una mancha nocturna. Los geles de losa vertical se
ejecutan invariablemente ya que esto permite hasta 20 muestras diferentes para cargar en un solo
gel

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