MICROBIOLOGÍA GENERAL

Unidad II
Tarea 1

Miriam Abigail Galindo Luna

1. Estudiar las partes del microscopio de luz y describa sus funciones

Ocular: es la lente que aumenta la imagen formada por el objetivo, el ocular en algunos
microscopios es doble y en los de más reciente modelo se han adaptado para que puedan
configurarse a nuestra bioptría, separación de los ojos, altura del rostro etc.

Brazo del microscopio: Es de aquí donde tomamos a nuestro microscopio, aunque no solo
de aquí en una clase de la doctora Carolina aprendimos que se debe tomar con una mano
del brazo y con la otra debemos sujetarlo por la base del microscopio.

Tubo del cuerpo: es el encargado de transmitir la imagen del objetivo al ocular.

Revolver: es una goma negra que permite la rotación de los lentes oculares.
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Lentes del objetivo: principales lentes que aumentan la muestra (hay de diferentes
aumentos)

Platina: mantienen la posición de la preparación microscópica.

Medidor movimiento de platina: es el que nos ayuda a saber en qué coordenadas está
ubicada la parte de nuestra muestra que estamos observando.

Pinzas: son aquellas que nos permiten sujetar y fijar a nuestra muestra.

Condensador: enfoca la luz a través de la muestra.

Diafragma: controla la cantidad de luz que entra por el condensador.

Iluminador: es la fuente de luz del microscopio.

Selector de la iluminación: es aquel que nos permite regular la cantidad de luz que
ocupamos.

Tornillo de enfoque rápido: o tornillo macrométrico, es el que nos ayuda a subir o bajar
nuestra platina rápidamente.

Tornillo de enfoque fino: también conocido como tornillo micrométrico, es el que nos
ayuda a ajustar la platina con movimientos más lentos y delicados.

Base: es donde está sostenido el microscopio.

2. Defina resolución, apertura numérica, distancia focal, fluorocromo

Resolución: distancia mínima que existe entre dos puntos que todavía se pueden
identificar como puntos separados cuando se observan con un microscopio.

Apertura numérica: es la mitad del ángulo del cono de luz que entra en el objetivo del
microscopio a partir de la muestra.

Distancia focal: distancia entre el punto medio de la lente y el punto focal en el que
convergen los rayos a través de la lente.
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Fluorocromo: es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor

energía. Es la responsable de la emisión de la fluorescencia

3. Si un espécimen es visto empleando un objetivo 5X en un microscopio con un

ocular 15X, ¿cuántas veces será amplificada la imagen?
 En uno 5X la imagen se verá amplificada 50 veces
 En uno 15X se verá amplificada 150 veces

4. ¿Cómo la resolución depende de la longitud de onda, el índice de refracción y la

apertura numérica? ¿Cómo se relacionan la resolución y la amplificación de una
imagen?

La ecuación de abbe nos explica que forma la resolución, la longitud de onda, el

índice de refracción y la apertura numérica dependen simultáneamente unas de otras.

 La longitud de onda mínima que podemos usar en el microscopio es de 450 (luz

azul) y esto se hace porque a menor longitud de onda utilizada es mayor la
resolución.
 Dependiendo del índice de refracción que se encuentra entre la muestra y los
objetivos (ya sea del aceite o el aire) tendremos mayor resolución
 La apertura numérica nos va decir que a mayor apertura numérica mayor
resolución

La resolución y la amplificación se relacionan pues a mayor aumento del objetivo mayor y

mejor resolución tendremos.

5. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?

Su función es aumentar la resolución de un microscopio mediante la inmersión del lente objetivo y

el espécimen en un aceite transparente de alto índice de refracción.
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6. ¿Por qué los microscopios de luz no emplean oculares 30X para una mayor
amplificación de las imágenes? Porque realmente no importa que tanto aumente el
ocular

El límite de resolución de un microscopio es de 0.2 micras, por lo tanto al usar un lente de 30X
la muestra aumenta, pero su resolución no es buena. Por lo que no importa si usamos un
ocular más grande no es sinónimo de mejor resolución.

7. Define fijación, colorante, cromóforo, colorante básico, colorante ácido, tinción

simple, tinción diferencial, tinción negativa.

Fijación: proceso por el cual las estructuras externas e internas de las células y
microorganismos son preservados y fiados en una posición definida

Cromóforo: es la parte o conjuntos de átomos de una molécula responsable de su color. Se

puede definir también como una sustancia que posee muchos electrones capaces de
absorber energía o luz visible y excitarse para así emitir diversos colores.

Colorante: son sustancias de origen químico o biológico que tienen al menos un grupo
cromóforo que les proporciona la habilidad de teñir, estos pueden unirse a las células por
medio de enlaces iónicos, covalentes o hidrofóbicos.

Colorante básico: son aquellos que poseen cromóforos con cargas positivas.

Colorante acido: también llamaos colorantes aniónicos, son aquellos que poseen
cromóforos con cargas negativas.

Tinción simple: tiene como propósito simplemente colorear a la muestra destacar el

microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas,
facilitando así su observación.

Tinción diferencial: es la tinción que tiene como propósito diferencial de manera más
específica los microorganismos.
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Tinción negativa: es una técnica que permite contrastar las muestras mediante una
sustancia opaca a los fotones (microscopia óptica) o a los electrones (microscopia
electrónica). Este método usa colorantes neutros o ácidos

8. Describe dos tipos de fijación. ¿Cuál es empleado normalmente para procariotas?

¿Cuál para protozoarios?

La fijación por calor se utiliza de forma rutinaria para observar procariotas. Esta se
realiza haciendo una fina extensión de una gota de muestra liquida sobre un portaobjetos y
se deja secar al aire, después, la preparación se pasa rápidamente por la flama de un
mechero, el calor mata a la célula y la adhiere al portaobjetos. La fijación por calor
preserva la morfología global pero no las ultra estructuras.

La fijación química se utiliza para proteger las subestructuras celulares finas y la

morfología de los microrganismos más grandes (como los protozoarios). Los fijadores
químicos penetran en la célula y reaccionan con los componentes celulares, normalmente
se unen a proteínas y lípidos para inactivarlos, insolubilizarlos e inmovilizarlos. Las
mezclas comunes de fijadores contienen sustancias como etanol, ácido acético, cloruro de
mercurio, formaldehído y glutaraldehído.

9. ¿Por qué se espera que los colorantes básicos sean más efectivos bajo condiciones
alcalinas?

Ya que la carga exterior de la célula es positiva puesto que se encuentran protones en

el exterior de ella misma para poder realizar el intercambio de sustancias que requiere
el microorganismo para su funcionamiento, mientras que en el interior se encuentra
una carga negativa por -OH disociados así como grupos fosfato en el medio interno de
la célula; un colorante básico tiene una carga positiva y en efecto requiere de
condiciones básicas para poder funcionar ya que al disminuir la acidez, aumenta la
carga negativa momentáneamente al exterior de la célula por lo que aumenta la
atracción de la membrana por la apetencia de colorantes básicos así como el interior
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10. Describe el procedimiento de la tinción de Gram. ¿Qué paso podría ser omitido del
procedimiento sin que se pierda la capacidad de diferenciar entre bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas? ¿Por qué?
 La tinción de Gram es una técnica muy sencilla que se basa en el uso de un colorante que
permite observar las bacterias mejor bajo el microscopio.
 El proceso es muy sencillo, y los pasos a seguir serian:
 Recolección de las bacterias a estudio mediante un isopo (bastón estéril de algodón).
 Extender dicha muestra sobre un portaobjetos y dejarla secar.
 Fijar la muestra mediante un alcohol (metanol).
 Aplicar el tinte de violeta de genciana sobre el portaobjetos y esperar un minuto.
 Enjuagar la muestra con agua y aplicar un fijador del violeta de genciana (Lugol).
 El Lugol y el violeta de genciana forman un complejo insoluble en agua capaz de penetrar
en la pared de las células bacterianas.
 Lavar de nuevo el portaobjetos con una mezcla de alcohol y acetona durante unos
segundos.
 Opcionalmente se puede añadir una tinción de safranina o fucsina para distinguir las
Gram negativas que aparecerán bajo el microscopio (en lugar de incoloras) con un tono
rosado o rojo. Lavar con agua.
 La muestra ya está lista para ser visualizada bajo el microscopio y así poder distinguir las
Gram negativas de un color rosa-rojizo y las positivas de un color violeta.
 El paso que se puede omitir es el de agregar la tinción de la safranina para lograr
visualizar la Gram negativas ya que estas pueden ser incoloras y solo lograr ver las
positivas del color violeta.

11. ¿Cómo pueden visualizarse las cápsulas, endosporas y flagelos?

*Las endosporas poseen cubiertas gruesas e impermeables que no absorben la mayoría de los
colorantes, sin embargo, la tinción de esporas de Wirtz-Conklin es efectiva.

* Este se lleva a cabo con verde de malaquita.

Posteriormente se lleva a calentamiento a emisión de vapores durante 3 a 6 minutos para que el

colorante penetre a través de las paredes de las endosporas.
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La muestra se enjuaga con agua para quitar el exceso del colorante verde de todas las partes de la
célula a excepción de las endosporas.

Se da una tinción de contraste con el rosa safranina, finalizando el proceso obteniendo como
resultado final la visualización de esta de un color verde y el resto de la célula rosa.

Para la visualización de flagelos se lleva a cabo la tinción de leifson:

• Se fija químicamente la suspensión bacteriana mediante formol, y se hace la extensión en

un portaobjetos.

• Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.

• Se cubre la preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina. El ácido
engruesa los flagelos ya que estos son demasiado pequeños para ser visualizados bajo el
microscopio y la rosanilina los tiñe de rosa.

• Quitamos el exceso con agua y se deja secar al aire.

Para las capsulas se lleva a cabo la tinción negativa donde:

• Se hace una preparación en fresco del espécimen.

• Se añade tinta china, las partículas de carbón de la tinta no pueden penetrar la capsula, de
manera que solo ennegrece el fondo.

• Al microscopio, se observan las capsulas como zonas claras.

12. ¿Por qué el microscopio electrónico tiene mayor resolución que el microscopio de
luz?
El Límite o Poder de Resolución aproximado del ojo humano es de 0,2 milímetros, el de un
buen microscopio se sitúa en 0,2 micras y el de un microscopio electrónico en unos 0,2
nanómetros, por lo tanto, los microscopios electrónicos permiten alcanzar amplificaciones
mayores antes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de
los electrones es bastante menor que la de los fotones. Mamás
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13. Describe en términos generales cómo funciona la MET. ¿Por qué debe usar alto
vacío y secciones muy finas?
El microscopio electrónico de transmisión
(TEM) es un instrumento científico con un peso
aproximado de una tonelada y con una columna
de alrededor de 1.5 metros de altura donde se
utiliza alto voltaje para producir y enfocar un
haz de electrones acelerados en alto vacío que al
impactar en una de las caras de una muestra de
tejido ultra delgada forman una imagen al
emerger por la cara contraria. Con este
instrumento que alcanza aumentos de 1000 000x
hoy en día es posible ver desde los cromosomas
y las moléculas de ADN (ácido
desoxiribonucleico) hasta átomos con un poder
de resolución de 0.2 nm.

14. Los materiales son embebidos en parafina,

previo a su seccionamiento, para la microscopía de luz. ¿Por qué este procedimiento
no es útil para preparar un espécimen para la MET?
La principal diferencia radica en que el microscopio óptico utiliza luz visible,
mientras que el electrónico emplea electrones.
Por otro lado, la lente del microscopio óptico es de vidrio. En cambio, del
microscopio electrónico es electromagnética.
El tamaño de los microscopios electrónicos es mucho más grande que los ópticos.
B
Las imágenes del microscopio electrónico no tienen color, mientras que las del
óptico si son a color

15. ¿Bajo qué circunstancias sería deseable que se preparen especímenes para MET
usando tinción negativa? ¿y por congelación?
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Se usa la tinción negativa para muestras pequeñas como complejos macromoleculares. Se

usan agentes de tinción como molibdato de amonio, fosfotungstato sódico y sales de uranio
como acetato y formiato, se usan estos porque interactúan mínimamente con la muestra y
son estables con la interacción de electrones, etc.
En el método de congelación usamos la criofractura que nos permite estudiar las
membranas biológicas en un plano tangencial en vez de cortarlas transversalmente como
comúnmente lo hacemos. Es usada cuando queremos observar las partículas
intermembranosas, poros nucleares, relaciones entre organelos o uniones intercelulares.

16. ¿Cómo opera la microscopía electrónica de barrido y en que difiere de la de

transmisión? ¿Para qué aspectos en el estudio de la morfología es útil? 16. •
Microscopio electrónico de transmisión (MET)
Un microscopio electrónico de transmisión es un microscopio que utiliza un haz de
electrones para visualizar un objeto. La potencia amplificadora de un microscopio
óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Con un microscopio
de este tipo se pueden visualizar estructuras mucho más pequeñas debido a que los
electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz.
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
Este tipo de microscopio utiliza un haz móvil de electrones que recorre el objeto.
La imagen se crea por lo que se han desprendido, y no a partir de electrones
transmitidos, lo cual hace que se cree mayor resolución en la imagen. Además se
permite una visión tridimensional del objeto observado.