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Comparación de métodos analíticos para detectar SARS-CoV-2 en aguas residuales

Alba Pérez-Cataluña a , 1 , Enric Cuevas-Ferrando a , 1 , Walter Randazzo a , B , Irene Falcó a ,

Ana Allende C , Gloria Sánchez a , ⁎
a Departamento de Tecnologías de Conservación y Seguridad Alimentaria, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, IATA-CSIC, Av. Agustín Escardino 7, Paterna, 46980, Valencia, España
B Departamento de Microbiología y Ecología, Universidad de Valencia, Av. Dr. Moliner, 50, Burjassot, 46100, Valencia, España
C Grupo de Investigación en Calidad y Seguridad de Frutas y Hortalizas, Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, CEBAS-CSIC, Campus Universitario de Espinardo, 25, 30100 Murcia, España

DESTACAR GRÁFICAMENTE ABSTRACTO

• El SARS-CoV-2 irradiado con rayos gamma fue

utilizado para evaluar el rendimiento del método.
• Se compararon diferentes métodos para
la vigilancia de SARS-CoV-2 WBE.
• Los métodos probados no mostraron signi fi grandes
diferencias para la recuperación del SARS-CoV-2 de las
aguas residuales.
• Extracción automatizada de ácidos nucleicos
mostró un LoD más bajo 95% que el método
basado en columnas.
• Se observó una sensibilidad diferente de los
ensayos de RT-qPCR.

información del artículo abstracto

Historia del artículo: La epidemiología basada en aguas residuales (WBE) ha surgido como una estrategia confiable para evaluar la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019
Recibido el 16 de octubre de 2020 (COVID-19). Publicaciones recientes sugieren que la detección del SARS-CoV-2 en aguas residuales es técnicamente factible; sin embargo, hay muchos protocolos
Recibido en forma revisada el 9 de noviembre de 2020
diferentes disponibles y la mayoría de los métodos aplicados no se han validado adecuadamente. Para ello, se evaluaron inicialmente diferentes procedimientos para
Aceptado el 10 de noviembre de 2020
concentrar y extraer SARS-CoV-2 inactivado y sustitutos. Las aguas residuales urbanas sembradas con SARS-CoV-2 irradiado con rayos gamma, el virus de la diarrea
Disponible online el 8 de diciembre de 2020
epidémica porcina (PEDV) y el mengovirus (MgV) se utilizaron para probar la concentración ef fi eficacia de un método de precipitación por adsorción a base de aluminio

y un protocolo de precipitación de polietilenglicol (PEG). Además, en este estudio se compararon dos métodos de extracción de ARN diferentes: un kit comercial de
Montaje: Damia Barcelo
centrifugación en columna de centrifugación manual y un protocolo automatizado basado en perlas de sílice magnéticas. En general, los métodos de concentración

Palabras clave: evaluados no afectaron la recuperación del SARS-CoV-2 ni del MgV irradiado con rayos gamma, mientras que los métodos de extracción mostraron un impacto

SARS-CoV-2 significativo. fi No hay diferencias para PEDV. Se obtuvieron tasas de recuperación medias de 42,9 ± 9,5%, 27,5 ± 14,3% y 9,0 ± 2,2% para el SARS-CoV- irradiado con rayos
Virus de la diarrea epidémica porcina gamma.
Precipitación de polietilenglicol
Adsorción-precipitación a base de aluminio 2, PEDV y MgV, respectivamente. Límites de detección (LoD 95%) por fi cinco dianas genómicas de SARS-CoV-2 (N1, N2, gen E, IP2 e IP4)
Epidemiología basada en aguas residuales
oscilaron entre 1,56 log equivalentes de genoma (ge) / ml (N1) y 2,22 log ge / ml (IP4) cuando el sistema automatizado
RT-qPCR
temwas usado; mientras que se observaron valores que oscilaron entre 2.08 (N1) y 2.34 (E) log ge / mL cuando se utilizó el método de extracción
basado en columnas. También se evaluaron diferentes objetivos en muestras de aguas residuales contaminadas naturalmente con
91,2%, 85,3%, 70,6%, 79,4% y 73,5% de positividad, para N1, N2, E, IP2 e IP4, respectivamente. Nuestro estudio de comparación de
referencia sugiere que el método de precipitación de aluminio junto con la extracción nucleica automatizada representa un método de
sensibilidad aceptable para proporcionar resultados de interés para la vigilancia de SARS-CoV-2 WBE.
© 2020 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

Abreviaturas: COVID-19, enfermedad por coronavirus 2019; CE, Comisión Europea; MgV, mengovirus; PEDV, virus de la diarrea epidémica porcina; PEG, polietilenglicol; SARS-CoV-2, síndrome
respiratorio agudo severo coronavirus 2; WBE, epidemiología basada en aguas residuales; OMS, Organización Mundial de la Salud.
⁎ Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: gloriasanchez@iata.csic.es (G. Sánchez).
1 Estos autores contribuyeron igualmente al trabajo.

https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.143870
0048-9697 / © 2020 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
A. Pérez-Cataluña, E. Cuevas-Ferrando, W. Randazzo et al. Ciencia del medio ambiente total 758 (2021) 143870

1. Introducción Loef fl er-Insitut, Greifswald, Alemania) y MgV vMC0 se propagaron en monocapas

de células Vero y HeLa, respectivamente ( Puente et al., 2020 ). Doscientos mililitros
El uso de aguas residuales como herramienta para el seguimiento de muestras de aguas residuales sembradas ( n = 4) se concentraron mediante
epidemiológico, conocido como epidemiología basada en aguas residuales (WBE), adsorción-precipitación a base de aluminio ( Randazzo et al., 2019, 2020a, 2020b ). A fi
tiene una larga historia de uso en salud pública, particularmente para virus Luego se formó el concentrado final por centrifugación a 1900 × gramo durante 30
entéricos humanos ( Asghar et al., 2014 ; Cuevas-Ferrando et al., 2020 ; Hellmér et min y el sedimento resultante se resuspendió en 1 ml de PBS, pH 7,4.
al., 2014 ; Miura et al., 2016 ; Prevost et al., 2015 ; Santiso-Bellón et al., 2020 ). En Alternativamente, se concentraron 200 ml de muestras de aguas residuales
medio de la pandemia de COVID-19 en curso, WBE se está implementando a nivel sembradas (n = 4) mediante precipitación con polietilenglicol (PEG) 8000 al 20%
mundial para la detección del vertido de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales, (PanReac, España) y se resuspendieron en 1 ml de PBS, pH 7,4. queso Brie fl A cada
alcantarillas y lodos ( Ahmed y col., 2020a ; Bivins et al., 2020 ; Guerrero-Latorre et muestra se le añadieron 25 ml de tampón Tris Glycine-Beef Extract (TGEB) pH 9,5 y
al., 2020 ; Haramoto et al., 2020 ; Kumar et al., 2020 ; La Rosa et al., 2020 ; Lodder y se incubaron en agitación a 300 rpm durante 2 ha 4 ° C. Después de la incubación,
de Roda Husman, 2020 ; Medema et al., 2020 ; Prado et al., 2020 ; Randazzo et al., las muestras se centrifugaron a 2500 × gramo durante 10 min a 4 ° C. El
2020a, 2020b ; Rimoldi et al., 2020 ; sobrenadante se ajustó a pH 7,0. - 7.2. Se agregaron PEG y NaCl a un fi concentración
Sherchan et al., 2020 ; Wang et al., 2020 ; Wu et al., 2020 ). Todos estos estudios se final de 20% y 0,3 M, respectivamente, y se mezclaron suavemente. La muestra se
han implementado en contextos de investigación; sin embargo, diferentes países incubó en agitación durante la noche a 4 ° C y luego se centrifugó a 3500 × gramo durante
están implementando actualmente la vigilancia de las aguas residuales en sus 30 min a 4 ° C. El sedimento se resuspendió en 1 mL de PBS y las muestras
programas de monitoreo de COVID-19 nacionales o regionales para la alerta concentradas se almacenaron a - 80 ° C para análisis adicionales.
temprana de la propagación comunitaria del SARS-CoV-2 y los brotes de
enfermedades ( OMS, 2020 ). Además, WBE tiene el potencial de aplicarse en Para ambos métodos de concentración, los controles de recuperación se
entornos de alto riesgo, como hogares de ancianos y hospitales, o en entornos de prepararon añadiendo cada virus a la concentración detallada anteriormente en 1
bajos recursos ( OMS, 2020 ). Como declaró recientemente la OMS, la investigación ml de PBS. Para cada muestra, se calculó el porcentaje de recuperación dividiendo
de WBE debe verse como un objetivo importante de salud pública para avanzar en el título viral de la muestra concentrada por el título del control de recuperación.
el conocimiento sobre COVID-19, sin embargo, aún deben abordarse muchos
problemas técnicos ( Ahmed y col., 2020b ; Polo et al., 2020 ; 2.2. Extracción, detección y cuantificación de virus fi catión
Rusiñol et al., 2020 ; OMS, 2020 ). En un intento por coordinar el conocimiento actual y las lagunas
de datos, la Comisión Europea (CE) creó un Estudio paraguas paneuropeo para comprender 2.2.1. Extracción de ácido nucleico
mejor las limitaciones y desafíos de este enfoque, incluido el desarrollo de una hoja de ruta para La extracción viral de concentrados de aguas residuales se llevó a cabo comparando
un despliegue sistémico de complementos nacionales y regionales en curso. vigilancia en un un kit comercial basado en columna manual y un instrumento automatizado que se
enfoque único ( CE, 2020 ). Uno de los problemas destacados por estos estudios colaborativos es la basaba en perlas magnéticas para purificar el ácido nucleico. fi catión.
necesidad de procedimientos estandarizados, que van desde el muestreo hasta el análisis de La extracción manual de ácido nucleico se realizó a partir de 150 μ L de
datos. En este sentido, los métodos de concentración viral y extracción de ácidos nucleicos son muestra concentrada utilizando el kit Nucleospin RNA virus (denominado MN)
dos pasos críticos para el análisis de virus en aguas residuales y los controles de calidad deben (Macherey-Nagel GmbH & Co., Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante
ser precisos. fi ned. Hasta donde sabemos, tres estudios han comparado diferentes métodos de junto con un paso de pretratamiento inicial con Plant RNA Isolation Aid (Ambion,
concentración utilizando sustitutos del SARS-CoV-2 ( Ahmed y col., 2020c ; Jafferali et al., 2020 ; Rusiñol EE. UU.) ( Cuevas-Ferrando et al., 2020 ; Randazzo et al., 2020a, 2020b ).
et al., 2020 ). Sin embargo, los resultados analíticos de los procedimientos de concentración, Paralelamente, se utilizó Maxwell® RSC Instrument (Promega, España) para el
extracción y detección de SARS-CoV-2 probados en paralelo aún no están caracterizados para aislamiento automático de ácidos nucleicos utilizando el kit de autenticación y
muestras de aguas residuales. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar diferentes OMG Maxwell RSC Pure Food (Promega) (denominado Max). Algunos modi fi Los
métodos de concentración, procedimientos de extracción de ácido nucleico y ensayos cationes del protocolo del proveedor original se establecieron en base a los
cuantitativos de RT-qPCR para ef fi Detectar adecuadamente el SARSCoV-2 en las aguas residuales resultados preliminares de laboratorio durante un paso de optimización del
utilizando el SARS-CoV-2 irradiado con rayos gamma, el virus de la diarrea epidémica porcina método (datos no mostrados). Finalmente, 400 μ L de bromuro de
(PEDV) como modelo de coronavirus y el mengovirus como contraparte sin envoltura. Es cetiltrimetilamonio (CTAB) y 40 μ L de solución de proteinasa K (ambas provistas
importante destacar que los límites de detección se establecieron utilizando partículas de con el kit) se agregaron a 300 μ L de muestras de agua concentrada, la mezcla se
SARS-CoV-2 irradiadas con rayos gamma y fi Cinco ensayos de RT-qPCR diferentes dirigidos a incubó a 60 ° C durante 10 min y se centrifugó durante 10 min a
diversos fragmentos genéticos. Nosotros fi Validar finalmente los ensayos de RT-qPCR 16.000 × gramo. Luego, el sobrenadante se transfirió al cartucho de carga junto
seleccionados en muestras de aguas residuales recogidas durante la pandemia de COVID-19 en con 300 μ L de tampón de lisis. El cartucho se cargó en el Maxwell® RSC
diferentes regiones de España. Instrument y la extracción se realizó seleccionando el " Ácido nucleico total viral
Maxwell RSC " programa en ejecución en el software del instrumento. Tanto para
extracciones manuales como automatizadas, el ARN se fi finalmente eluido en 100 μ
L agua libre de nucleasas. En ambos métodos de extracción se incluyeron
controles negativos constituidos por agua libre de nucleasas en lugar de muestra
2. Materiales y métodos concentrada.

2.1. Métodos de concentración 2.2.2. Detección viral y cuanti fi catión

La detección viral de SARS-CoV-2, PEDV y MgV se realizó mediante RT-qPCR
Se compararon los métodos de precipitación por adsorción a base de aluminio utilizando One Step PrimeScript ™ Kit de RT-PCR (Perfect Real Time) (Takara Bio, EE.
y de precipitación de polietilenglicol (PEG) para evaluar su rendimiento analítico y, UU.). La detección del SARS-CoV-2 se realizó con el objetivo de la región N1 del gen
por tanto, su idoneidad para concentrar el SARSCoV-2 de las aguas residuales. Con de la nucleocápside ( CDC, 2020 ) mientras que el gen de membrana (M) speci fi c se
este fin, 200 ml de muestras de aguas residuales ( n = 8) que previamente dio utilizaron cebadores para la detección de PEDV como se describe en
negativo para SARS-CoV-2 ( Randazzo et al., 2020a ) fueron inoculados con 10 5 equivalentes
Puente et al., 2020 . Para el mengovirus, la detección se llevó a cabo utilizando
del genoma (ge) irradiados con rayos gamma (5 × 10 6 RAD) SARS-CoV-2 (Bei cebadores y sonda descritos en ISO 15216-1: 2017 . Las mezclas de reacción, las
Resources; NR-52287), 10 6
condiciones de los ciclos térmicos y las secuencias para los cebadores y las sondas
se muestran en las Tablas S1, S2 y S3, respectivamente. Todos los ensayos de
Unidades de PCR (PCRU) PEDV cepa CV777, un virus envuelto miembro de la Coronaviridae
familia y sustituto del SARS-CoV-2; y, 10 6 PCRU mengovirus (MgV) vMC0 (CECT RT-qPCR se realizaron por duplicado en un instrumento LightCycler 480 (Roche
100000), un miembro no envuelto de la Picornaviridae designado en el ISO Diagnostics, Alemania). Siempre se incluyeron controles positivos (ARN genómico)
15216-1: 2017 método estándar como control de proceso. La cepa CV777 y negativos (agua libre de nucleasas). Curvas estándar para PEDV, MgV y
citopatógena de PEDV (Friedrich- SARS-CoV-2 quanti fi Los cationes se realizaron utilizando el

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ARN genómico de cada virus con diluciones seriadas de 10 veces por triplicado. 3. Resultados y discusión
Las diferencias entre los métodos se analizaron estadísticamente utilizando la
prueba de Saphiro para la distribución normal y T-student para la comparación de 3.1. Comparación de métodos de concentración y extracción
medias ( p < 0,05). En fl La influencia de los métodos de concentración y extracción
se analizó mediante ANOVA multifactorial para cada virus (p <0,05). Figura 1 muestra las tasas de recuperación viral de ocho muestras de aguas
residuales que resultaron negativas para SARS-CoV-2 enriquecidas con SARSCoV-2, PEDV
2.3. Límite de detección de SARS-CoV-2 en aguas residuales y MgV irradiados con rayos gamma, sometidas a dos concentraciones diferentes y dos
métodos de extracción de ácido nucleico ( Figura 1 ). Para determinar la presencia de
Los límites de detección al 95% y 50% con fi intervalos de dencia inhibidores potenciales, también se analizó una dilución de 10 veces de cada muestra
(LoD 95% y LoD 50%, respectivamente) se obtuvieron detectando diez veces el mediante RT-qPCR para los tres virus diana. Los resultados de RT-qPCR mostraron que no fi
SARS-CoV-2 (Bei Resources, NR-52287) irradiado con rayos gamma se produjeron inhibiciones de canto (datos no mostrados).
diluido en serie de 1,7 × 10 3 a 1.7 ge / mL y sembradas en 200 mL de muestras de Las recuperaciones medias de SARS-CoV-2 variaron de 30,2 ± 17,7% (Al-Max) a
aguas residuales que dieron negativo para SARS-CoV-2. Las muestras también se 52,8 ± 18,2% (PEG-MN). En el caso del MgV, las recuperaciones medias fueron menores y
enriquecieron con PEDV (10 7 gc / mL) como control de proceso. Las partículas mostraron menos variabilidad que las obtenidas para el SARS-CoV-2, oscilando entre 6,8 ± 4,8%
virales se concentraron mediante el método de adsorción-precipitación a base de (Al-Max) y 11,1 ± 4,9% (PEG-MN). A pesar de las diferencias observadas, las recuperaciones
aluminio y se extrajo el ARN usando ambos protocolos de extracción de ARN como medias de SARS-CoV-2 y MgV no fueron significativas fi significativamente diferente entre los
se describió anteriormente. Los experimentos se realizaron por triplicado métodos de concentración y extracción probados. A la luz de esos resultados, las recuperaciones
concentrando tres muestras independientes para cada inóculo. de SARS-CoV-2 y MgV no serían significativas. fi afectado por cualquier combinación de métodos
nivel de cion. LoD 95% y LoD 50% fueron calculados de acuerdo a Wilrich y Wilrich de concentración y extracción probados en este estudio ( Figura 1 ).
(2009) .
Para determinar los límites de detección del SARS-CoV-2, fi Se utilizaron cinco El PEDV mostró una recuperación media global de 27,5 ± 14,3%, con valores que oscilaron
dianas diferentes: las regiones N1 y N2 del gen de la nucleocápside, el gen de la entre el 2,6% (PEG-Max) y el 73% (PEG-MN). Los resultados obtenidos con la concentración de PEG
envoltura (E) y las regiones IP2 e IP4 del gen de la ARN polimerasa dependiente de mostraron alta variabilidad (coef fi ciente de variación (CV) de 82,99%) en comparación con el
ARN (RdRp). El ampli fi La catión de la región N1 se llevó a cabo como se describió método del aluminio (CV de 44,16%). Signi fi diferencias de canto p < 0.05) se observaron para
anteriormente. La detección de la región N2 fue completa Al-MN con Al-Max ( pag-
fi llenado con cebadores y sondas disponibles en el kit de ensayos de panel de valor = 0.012) y PEG-Max (valor p = 0.043) ( Figura 1 ). Estos resultados destacan la
diagnóstico 2019-nCoV RUO de los CDC de EE. UU. ( CDC, 2020 ). La detección del idoneidad de los métodos probados para el análisis de virus envueltos en aguas
gen E se realizó utilizando cebadores y sondas descritos por residuales.
Corman y col. (2020) (Tabla S1 y S2). Para amplificar y cuantificar el objetivo IP2, Ahmed y col. (2020c) recientemente se informó de recuperaciones medias
One Step PrimeScript ™ Se utilizó el kit III RT-PCR (Takara Bio). similares que van del 26,7 al 65,7% utilizando el virus de la hepatitis murina como
sustituto del SARS-CoV-2 concentrado de aguas residuales por ultracentrifugación,
fi filtración y fl métodos de occulación. Curiosamente, los autores informan una
2.4. Comparación de RT-qPCR en muestras de aguas residuales contaminadas naturalmente recuperación media de 44,0 ± 27,7% para PEG fl occulación que es similar a la
recuperación 43,5 ± 22,8% obtenida para PEDV utilizando PEG y MN en este
Un total de 34 en fl uentes muestras de aguas residuales recogidas en estudio. En el estudio de González y col. (2020) , los porcentajes de recuperación de
diferentes regiones de España fueron analizadas para la detección y cuanti fi catión coronavirus bovino fueron del 5,5% y del 4,8% al utilizar InnovaPrep y
de SARS-CoV-2. Las muestras se concentraron usando el método de electronegativo fi Métodos de filtración para la concentración viral. Estos valores
precipitación-adsorción a base de aluminio como se describió anteriormente. La de recuperación estuvieron más en concordancia con los obtenidos en nuestro
detección de SARS-CoV-2 se realizó mediante el análisis de fi cinco dianas del estudio para el MgV no envuelto. Por lo que sabemos, este es el
genoma del SARS-CoV-2 antes mencionadas (Tablas S1, S2 y S3). Cada reacción se fi primer estudio que utilizó SARS-CoV-2 irradiado con rayos gamma para la evaluación y
realizó por duplicado. Se usaron ARN genómico de SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986D) y comparación de métodos. Sin embargo, teniendo en cuenta que estos protocolos están
agua libre de nucleasas como controles positivos y negativos, respectivamente. destinados a ser utilizados para el monitoreo temprano del SARS-CoV-2, en el que la
Quanti viral fi Los cationes se calcularon usando dos curvas estándar diferentes disponibilidad inmediata de los resultados es crucial para establecer una respuesta de
para los genes N1, N2 y E. Las curvas estándar se construyeron mediante el uso de salud pública oportuna, la elección de un método analítico adecuado debe basarse en en
plásmidos N1, N2 (2019-nCoV_N_Positive Control de CDC, número de catálogo IDT el banco de trabajo el tiempo necesario para cada procedimiento, junto con su
10006625) y el gen E (control positivo 2019-nCoV_E de Charité / Berlín, número de sensibilidad. Dado que el protocolo PEG incluye un paso de incubación durante la noche,
catálogo IDT 10006896) y un ARN genómico completo de SARSCoV-2 (ATCC a diferencia del método de adsorción-precipitación a base de aluminio (tiempo total
VR-1986D). inferior a 2 h), seleccionamos el protocolo de aluminio para comparaciones adicionales.

Figura 1. Recuperación de virus (%) en muestras de aguas residuales utilizando los métodos de precipitación de adsorción-precipitación (Al) y polietilenglicol (PEG) a base de aluminio y dos ensayos de
extracción de ARN (MNandMax) La detección de SARS-CoV-2 se realizó utilizando un objetivo N1. Abreviaturas: MN, kit NucleoSpinRNAvirus (Macherey-Nagel GmbH & Co.); Max, Maxwell RSC (Promega).
* p <0,05 en comparación con el protocolo Al-MN.

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tabla 1 N2, siendo de 2.08 log ge / mL con MN para ambos genes, y 1.56 para N1 y 1.74
Relación de detección y límite de detección (LoD 95% y LoD 50%) de partículas virales de SARSCoV-2 irradiadas
log ge / mL para N2 con Max. En línea, Cuevas-Ferrando et al. (2020) , aplicando el
con rayos gamma en aguas residuales utilizando el protocolo de precipitación de aluminio. Viral
método de concentración de aluminio combinado con
El ARN se extrajo utilizando dos protocolos de extracción de ácido nucleico diferentes y se
detectó dirigiéndose a los fragmentos genómicos N1, N2, E, IP2 e IP4. Abreviaturas: MN, kit de la extracción de MN, informó LoD 95% de 2,46 log gc / mL para HEV en aguas
virus de ARN NucleoSpin (Macherey-Nagel GmbH & Co.); Max, Maxwell RSC (Promega). residuales.

Método Objetivo Niveles de inoculado LoD 95% ( ge / mL) a LoD 50% ( ge / mL) a
irradiado con rayos gamma
3.3. Sesgo de los ensayos RT-qPCR para la detección de SARS-CoV-2 en muestras de aguas
SARS-CoV-2 (ge / mL) residuales

1700 170 17 1,7

Las muestras de aguas residuales naturalmente contaminadas se analizaron
Minnesota N1 6/6 6/6 2/6 0/6 2,08 1,44
por focalización fi Cinco fragmentos genómicos de SARS-CoV-2 diferentes (N1, N2,
N2 6/6 6/6 2/6 0/6 2,08 1,44
mi 6/6 6/6 0/6 0/6 2,34 1,71 E, IP2 e IP4) para evaluar la sensibilidad de cada ensayo de RT-qPCR. Como se
IP2 6/6 6/6 1/6 0/6 2.22 1,58 muestra en Figura 2 , se encontraron varias diferencias en la detección de
IP4 6/6 6/6 1/6 0/6 2.22 1,58 SARS-CoV2 dependiendo del objetivo utilizado. El porcentaje de muestras positivas
Max N1 6/6 6/6 5/6 0/6 1,56 0,92
para cada objetivo resultó como 91,2%, 85,3%, 70,6%, 79,4% y 73,5%, para N1, N2,
N2 6/6 6/6 4/6 0/6 1,74 1,10
mi 6/6 6/6 3/6 0/6 1,91 1,28 E, IP2 e IP4, respectivamente. Estos resultados evidenciaron la variabilidad que se
IP2 6/6 6/6 4/6 0/6 1,74 1,10 puede obtener en muestras positivas en función del juego de cebadores utilizado.
IP4 6/6 6/6 1/6 0/6 2.22 1,58 Además, la reproducibilidad de la detección de SARS-CoV-2 varió dentro de cada
a Calculado según Wilrich y Wilrich (2009) . objetivo genómico. Por ejemplo, para 10 de las 24 muestras que dieron positivo
para el gen E, ninguna fl Se detectó fluorescencia en cualquiera de sus réplicas
técnicas. En este sentido, N1 fue la diana con mayor porcentaje de réplicas
3.2. Límite de detección de SARS-CoV-2 en aguas residuales positivas (77%) en línea con los resultados reportados previamente ( Muenchhoff
et al., 2020 ). La menor sensibilidad para detectar el SARS-CoV-2 irradiado con
Límites de detección de fi Se evaluaron cinco dianas del genoma del rayos gamma dirigiéndose al gen E podría deberse a la presencia de mutaciones
SARS-CoV-2 en las aguas residuales mediante el análisis de muestras enriquecidas en el sitio de unión del cebador que dificultarían la amplificación. fi catión y, por
diluidas en serie. Para la detección de objetivo IP2, no ampli fi El catión se obtuvo al tanto, su detección ( Artesi et al., 2020 ). Para viral quanti fi catión de N1, N2 y gen E,
utilizar One Step PrimeScript ™ Kit RT-PCR (Perfect Real Time) (RR064) debido a la se construyeron curvas estándar usando ARN genómico completo de SARS-CoV-2
presencia de inhibidores. Por lo tanto, el PrimeScript de un paso ™ Se utilizó el kit (ATCC VR-1986D) y plásmidos sintéticos desarrollados para los genes N y E (Supp.
III RT-PCR (RR600) ya que se afirma que es altamente resistente a una amplia Fig. S1).
variedad de sustancias inhibidoras. Límite de detección Fig. 3 muestra la diferencia en el logaritmo de gc / L obtenido con cada curva
valores de ción (LoD 95% y LoD 50%) obtenidos para cada gen objetivo procesado con estándar para cada gen. Los valores medios de estas diferencias fueron
los dos protocolos de extracción analizados en este estudio se muestran en 1,27 ± 0,01, 0,27 ± 0,03 y 1,61 ± 0,01 log (gc / L) para N1, N2 y E, respectivamente.
tabla 1 . LoD 95% los valores para el protocolo MN variaron de 2,08 a 2,34 log ge / Esta sobreestimación fue producida por la cuantificación del plásmido.
mL; mientras que el protocolo Max mostró valores entre 1,56 y 2,22 log ge / fi catión como se describió anteriormente ( Lin et al., 2011 ). Quanti fi Se observó un
mL. Estos resultados sugieren que el instrumento Maxwell RSC junto con Maxwell sesgo de cationes en función del material de referencia utilizado, lo cual es muy
RSC Pure Food GMO y el kit de autenticación son ligeramente más sensibles que el importante al comparar cuanti fi datos de cationes de diferentes estudios. Por lo
protocolo MN. Sin embargo, dada la gran demanda de kits comerciales de tanto, se debe recomendar el uso de ARN genómico de SARS-CoV-2 como material
extracción de ARN y la escasez de provisiones, vale la pena evaluar más a fondo estándar. Además, dado el fi objetivo final de WBE, que es la estimación del número
diferentes alternativas adecuadas. de personas infectadas en una comunidad determinada, este sesgo debe
La validación de los dos métodos de extracción se realizó en muestras de aguas residuales evaluarse con precisión antes de la introducción de la cuanti fi valores de cationes
contaminadas de forma natural con SARS-CoV-2 utilizando el objetivo N1. Como ocurrió con las muestras en modelos epidemiológicos predictivos.
enriquecidas, se obtuvieron resultados ligeramente mejores cuando se utilizó un sistema automatizado

(Tabla complementaria S4). Con respecto a 4. Conclusiones

el LoD 95% valores, el gen E con MN (2,34 log ge / mL) y el gen IP4 con Max (2,22 log
ge / mL) mostraron los valores de detección más altos. Randazzo La introducción del SARS-CoV-2 y su propagación al estado de pandemia ha puesto a
et al. (2020a) estableció el LoD teórico 95% como 1,45 y 1,91 log gc / mL para N1 y todos los países en alerta y WBE se ha implementado fácilmente como una herramienta
N2, respectivamente. Al aumentar el SARS irradiado con rayos gamma, de alerta temprana para los brotes. En la mayoría de los países, la vigilancia de aguas
CoV-2 ahora podemos establecer un LoD riguroso 95% valores para N1 y residuales para monitorear COVID-19 comenzó muy apresuradamente, incluso antes

Figura 2. Distribución de los valores de umbral del ciclo para los objetivos genómicos N1, N2, E, IP2 e IP4 del SARS-CoV-2 detectados en muestras de aguas residuales (n = 34 muestras).

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FEDER, UE (AGL2017-82909) y MICINN / AEI (PID2019-105509RJI00). EC-F es

beneficiaria de un contrato predoctoral del MICINN, Convocatoria
2018. WR es titular del contrato postdoctoral APOSTD / 2018/150 de la Generalitat
Valenciana.

Apéndice A. Datos complementarios

Se pueden encontrar datos complementarios a este artículo en línea en https: // doi.

org / 10.1016 / j.scitotenv.2020.143870 .

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34) calculado de acuerdo con curvas estándar generadas mediante el uso de ARN genómico (ATCC VR- KA, Haramoto, E., Kitajima, M., Simpson, SL, Tandukar, S., Thomas, K., Mueller, JF, 2020b.
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el scienti fi La comunidad c podría tener datos sólidos sobre las metodologías óptimas. De
Ahmed, W., Bertsch, PM, Bivins, A., Bibby, K., Farkas, K., Gathercole, A., Haramoto, E.,
hecho, los procedimientos utilizados para la detección viral han sido poco estudiados y Gyawali, P., Korajkic, A., McMinn, BR, Mueller, JF, Simpson, SL, Smith, WJM, Symonds, EM,
aún se necesita estandarizar. Este estudio comparó dos métodos de concentración y dos Thomas, KV, Verhagen, R., Kitajima, M., 2020c. Comparación de métodos de concentración
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Los resultados obtenidos en este estudio revelan la variabilidad obtenida en función del https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.139960 .
sustituto utilizado como control de proceso para validar los análisis, el método de Artesi, M., Bontems, S., Göbbels, P., Franckh, M., Maes, P., Boreux, R., Meex, C., Melin, P.,
extracción y el objetivo molecular utilizado para la detección del SARS-CoV-2. Estas son Hayette, M.-P., Bours, V., Durkin, K., 2020. Una mutación recurrente en la posición 26.340 del
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decisiones críticas que afectarán la sensibilidad de los análisis. Por otro lado, a pesar de
ensayo de diagnóstico de diana. J. Clin. Microbiol. https://doi.org/10.1128/jcm.01598-20 .
la diferencia en el tiempo de procesamiento de la muestra, tanto los métodos de Asghar, H., Diop, OM, Weldegebriel, G., Malik, F., Shetty, S., El Bassioni, L., Akande, AO, Al
concentración de aluminio como los de PEG pueden usarse indiscriminadamente, ya que Maamoun, E., Zaidi, S., Adeniji, AJ, Burns, CC, Deshpande, J., Oberste, MS, Lowther,
no mostraron una significación significativa. fi No puedo diferencias. Sin embargo, el SA, 2014. Vigilancia ambiental de poliovirus en la iniciativa mundial de erradicación de la
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tiempo reducido necesario para la concentración de las muestras utilizando el método de
Bivins, A., North, D., Ahmad, A., Ahmed, W., Alm, E., Been, F., Bhattacharya, P., Bijlsma, L.,
adsorción-precipitación a base de aluminio, lo convierte en el método preferido para este Boehm, AB, Brown, J., Buttiglieri, G., Calabro, V., Carducci, A., Castiglioni, S., Cetecioglu Gurol,
paso. Por el contrario, se ha observado una sensibilidad diferente del ensayo RT-qPCR, lo Z., Chakraborty, S., Costa, F., Curcio, S., De Los Reyes, FL, Delgado Vela, J., Farkas, K.,
Fernandez-Casi, X., Gerba, C., Gerrity, D., Girones, R., Gonzalez, R., Haramoto, E., Harris , A.,
que sugiere que la selección de la diana molecular para la detección es crucial. El fi Los
Holden, PA, Islam, MT, Jones, DL, Kasprzyk-Hordern, B., Kitajima, M., Kotlarz, N., Kumar, M.,
hallazgos de este estudio amplían el conocimiento sobre los procedimientos analíticos y Kuroda, K., La Rosa, G., Malpei , F., Mautus, M., McLellan, SL, Medema, G., Meschke, JS,
sus efectos. fi Las ciencias para la detección del SARS-CoV-2 en aguas residuales Mueller, J., Newton, RJ, Nilsson, D., Noble,
RT, Van Nuijs, A., Peccia, J., Perkins, TA, Pickering, AJ, Rose, J., Sánchez, G., Smith,
constituyen un paso adelante para la implementación global de COVID-19 WBE.
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