UNIVERSIDAD NACIONAL DE

INGENIERÍA FACULTAD DE INGENIERÍA

AMBIENTAL
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE HIGIENE Y
SEGURIDAD INDUSTRIAL

“NUMERACION DE LOS COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES FECALES

POR EL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) EN MUESTRAS
AMBIENTALES SOLIDAS.”

SEPTIMO LABORATORIO DEL CURSO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL – BO122

MALPARTIDA SOTO JUAN CARLOS 20215015G

SAL Y ROSAS SANTOS BRYAN DAVID 20192705B

DOCENTE: MSc. Blgo. Alvaro Martin Martinez Vila

Lima, Perú
07 de noviembre de 2021

1
 ÍNDICE

Contenido
I. RESUMEN..........................................................................................................................................1
II. INTRODUCCIÓN...............................................................................................................................1
III. OBJETIVOS........................................................................................................................................3
3.1 OBJETIVO GENERAL......................................................................................................3
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS.............................................................................................3
IV. MARCO TEÓRICO............................................................................................................................4
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.............................................................................................7
1. Materiales........................................................................................................................ 7
2. Equipos........................................................................................................................... 2
3. Procedimiento.................................................................................................................3
VI. RESULTADOS...................................................................................................................................5
VII. DISCUSION DE RESULTADOS................................................................................................8
VIII. CONCLUSIONES........................................................................................................................9
IX. RECOMENDACIONES...................................................................................................................10
X. CUESTIONARIO..............................................................................................................................11
XI. FUENTES DE INFORMACIÓN......................................................................................................12
XII. APENDICE..................................................................................................................................14
1. DIAGRAMA DE FLUJOS...............................................................................................14
2. DATOS ORIGINALES Y OBSERVACIONES................................................................18
XIII. ANEXOS......................................................................................................................................20
I. RESUMEN

Luego de haber hecho la práctica de métodos de coloración, reconocimiento y

diferenciación de los microorganismos y la caracterización de las colonias
pasamos a la numeración de coliformes totales y fecales; realizado a travez del
método del Número Más Probable (NMP) y Violet Red Bilis Agar (VRBA), que es
también conocido como Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV), este es un
medio sólido utilizado especialmente para la enumeración de coliformes. Los
terminos coliforme y coliforme fecal carecen de significado taxonómico. Solo
tienen sentido metodológico y solo cuando se definen las condiciones en que se
hace su detección (propiedades del medio de cultivo, temperatura y tiempo de
incubación), habrá que recordar por la clase previa al laboratorio que el
procedimiento es progresivo para detectar tres grupos de microorganismos: a-
coliformes; b- coliformes fecales; c- E. coli. El aspecto de las colonias sirve para
diferenciar distintas especies microbianas. Daremos uso de técnicas especiales
que son las técnicas de aislamiento y de cultivo para poder reconocer a los
microorganismos, siempre trabajando en condiciones de esterilidad,
trabajaremos en base a una dilución primaria por 10gr del alimento y 90 ml de la
solución salina y posteriormente a soluciones decimales tomadas en base a la
primaria, haciendo las pruebas respectivas para demostrar la presencia de los
tres grupos de microorganismos ya mencionados. Habrá que tener en cuenta
también el método de las diluciones sucesivas para que, de esa manera
nosotros podremos aislarlo en forma pura o mixta, porque ellos se encuentran
formando una flora mixta de diferentes especies de microorganismos, pero al
aislarlo obtendremos un cultivo puro o misma especie. Aprenderemos a usar un
medio de cultivo en concreto, el cuál es el Agar Rojo Neutro Cristal Violeta
(RNCV), un medio de cultivo de microorganismos, tanto selectivo, como
diferencial, que se usa para la identificación y enumeración de coliformes. Está
formado por cierto número de componentes que favorecen el crecimiento
bacteriano, y por otros componentes que dotan a este medio de sus
características diferenciales y selectivas. Finalmente obtendremos los resultados
los cuales serán añadidos al informe.
II. INTRODUCCIÓN
Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos
presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes
se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los
procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer
microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el
recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimación
por el método del Número Más Probable (NMP). El método del número más
probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo
ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el
número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se
ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de
microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos
contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de
microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias
como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes
totales, capaces de fermentar la lactosa a 44o C en vez de 37 oC como lo hacen
los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en
heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya
que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de
los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de
contaminación fecal.

2
Éstos últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar
temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes
Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera
del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de
condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho
tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su
presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos
pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado
se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.

III. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Verificar la calidad sanitaria de muestras ambientales sólidas mediante la
búsqueda de microorganismos indicadores de contaminación como
coliformes
totales, coliformes fecales utilizando la metodología de número más
probable.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

•Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos

coliformes fecales.
• Primero determinar la presencia de coliformes (prueba presuntiva),
después se
• determina si los cultivos que contienen coliformes contienen además
coliformes
• fecales y finalmente se confirma la presencia de E. coli.
• Determinar los factores que favorecen la contaminación de los alimentos
de consumo humano.
• Aplicar el método del NMP para el conteo de los microorganismos.
• Realizar el método de recuento en placas para las Enterobacterias.
• Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la
búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli.
• Conocer desde ahora algunos procedimientos como indicadores como el
control de microorganismos
• Determinar los coliformes totales por método de NMP.

3
 • Realizar la prueba confirmatoria de la cantidad de los coliformes totales
con el caldo Brilla.
• Organizar e interpretar los resultados.

IV. MARCO TEÓRICO

La manipulación de los microorganismos requiere de técnicas especiales, no

sólo por su tamaño microscópico, sino porque es necesario evitar la
contaminación de
los cultivos por gérmenes indeseables e impedir el traslado de gérmenes
patógenos desde los cultivos al medio ambiente. Nuestro objetivo en este
laboratorio es evaluar la calidad sanitaria de muestras ambientales solidas
mediante la búsqueda de microorganismos indicadores de contaminación como
coliformes totales, coliformes fecales utilizando la metodología de número más
probable, para esto también será importante recordar cómo se aíslan las
diferentes especies en cultivo puro partiendo de una mezcla de varias especies.
Para una correcta manipulación de los microorganismos, para la evaluación de
coliformes, es necesario trabajar con instrumentos estériles sobre medios de
cultivo estériles y deben efectuarse siguiendo las reglas de asepsia, para impedir
que desarrollen al mismo tiempo las bacterias en estudio y microorganismos del
medio ambiente. Dichas prácticas deben realizarse al abrigo de las corrientes de
aire (las puertas y ventanas cerradas) con movimientos pausados, sin
brusquedad y a una distancia no mayor de 15 cm de la llama del mechero de
Bunsen. No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo
necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como
indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales
(que comprende la totalidad del grupo) y los coliformes fecales (aquellos de
origen intestinal).

• GRUPO COLIFORMES:
El grupo de los coliformes incluye bacterias en forma de bacilo, gram negativos,
con las siguientes propiedades bioquímicas: oxidasa negativo y capacidad de
fermentar lactosa, con producción de gas en 48 horas a una temperatura de 37
°C. El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros:
• Escherichia

4
• Klebsiella
• Enterobacter
• Citrobacter.

• COLIFORMES FECALES:
Los coliformes fecales se definen como el grupo de organismos coliformes que
pueden fermentar la lactosa a 44-45 oC. Incluyen bacterias del género
Escherichia y también especies de Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter.
Aunque frecuentemente su origen es fecal, organismos que dan positivo en este
método de prueba pueden provenir de aguas enriquecidas, efluentes industriales
y materia vegetal y suelo en descomposición, por lo que el término coliformes
fecales no es siempre acertado.
I.CONTEO DE COLIFORMES POE EL MÉTODO NMP:
En la determinación de microorganismos coliformes totales por el método del
Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a
35°C 1°C durante 48 h, utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa. La determinación del número más probable de microorganismos
coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba
presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la
lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5°C 0.1°C
por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se
realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por
agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar
eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas
básicas (IMViC) a las colonias típicas.
I.FASE PRESUNTIVA:
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de
sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se
encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa
como fuente de carbono.
II. FASE CONFIRMATIVA:
Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado
bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos

5
microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante.
III. AISLAMIENTO:
El Agar Violet Red Bilis Agar (VRBA) también conocido como Agar Rojo Neutro
Cristal Violeta (RNCV), se utiliza en la enumeración de coliformes. Contiene
peptona como fuente de carbono y nitrógeno. Extracto de levadura como fuente
de complejo vitamínico B, el cual estimula el crecimiento bacteriano. Las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de Gram positivos. Lactosa como
fuente de carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH. Los organismos
fermentadores de lactosa, como los coliformes crecen formando colonias rojas
con sin zona de precipitación, en cambio los no fermentadores de lactosa se
desarrollan formando colonias incoloras a transparentes con sin zona de
precipitación. Para la confirmación de coliformes se debe traspasar colonias
aisladas a Caldo Bilis Verde Brillante.
IV. DILUCIONES SUCESIVAS:
Es la reducción progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia
en disolución. Por lo general, el factor de dilución en cada paso es constante, lo
que da como resultado una progresión geométrica de la concentración, en forma
logarítmica. Las diluciones en serie se utilizan para crear disoluciones muy
diluidas con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se
pretenda estudiar curvas de concentración con una escala logarítmica.
MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES:
• Selectivos. Presentan algún componente que impide el desarrollo de
microorganismos no deseados. Esto hace que el microorganismo que se desea
cultivar lo haga con mayor facilidad. Por ejemplo, el agar MacConkey contiene
cristal violeta, que inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas y hongos,
facilitando el desarrollo de bacterias gramnegativas.
• Diferenciales. Contienen sustancias que ponen de manifiesto alguna
característica de la especie o grupo de microorganismos. Por ejemplo, el agar
MacConkey contiene lactosa y rojo neutro (como indicador); las bacterias
fermentadoras de lactosa (lactosas positivas) aparecen de color rosa intenso,
mientras que las no fermentadoras de lactosa son incoloras. Los medios de
cultivo selectivos y diferenciales presentarán esas utilidades.
Entre ellos tenemos:
- VIOLET RED BILIS AGAR: El grupo de bacterias coliformes incluye bacilos

6
aerobios y anaerobios facultativos, gramnegativos, no formadores de esporas.
Los coliformes fermentan lactosa y forman ácido y gas a 35 ° C en 48 horas. Los
miembros de Enterobacteriaceae comprenden la mayoría del grupo, pero otros
miembros que fermentan lactosa también pueden incluirse organismos. Los
procedimientos para detectar, enumerar y presuntamente identificar coliformes
se utilizan en las pruebas de alimentos. y productos lácteos. Un método para
realizar la prueba presuntiva para coliformes usa Violet Red Agar biliar, (VRBA).
Si aparecen colonias de coliformes típicas, se realizan más pruebas para
confirmar su identificación como coliformes. Las colonias de coliformes reducen
el pH del medio, causando posteriormente que sus colonias se vean rojas
(colorante rojo neutro) y precipiten las sales biliares.
- ESCHERICHIA COLI:
Es una bacteria miembro de la familia de las enterobacterias y forma parte de la
microbiota del tracto gastrointestinal de animales homeotermos, como por
ejemplo el ser humano.3 Es un bacilo gramnegativo, no exigente, oxidasa
negativa, catalasa positiva, anaerobio facultativo, cuya temperatura de
crecimiento preferente es a 37 °C (mesófilo), fimbriado y comúnmente es móvil
por flagelos perítricos

V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Materiales
Asa de siembra

Mechero de Bunsen

Algodón

Alcohol

7
 Pipeta
Plumón marcador

Propipeta

Caldo Lauril

Agua peptonada

Caldo EC con Durham

VRBA

Caldo con Durham invertido

Placas Petri

2. Equipos

Incubadora

8
Baño maría

Balanza

Licuadora

9
 3. Procedimiento

Determinación del NMP de coliformes en muestras sólidas o alimentos.

Dilución primaria.
1. Pesamos 10g del alimento o muestra sólida en condiciones asépticas.
2. Transferimos a un vaso de licuadora previamente lavado y desinfectado
con alcohol.
3. Agregamos 90ml de solución salina estéril y licuamos por un minuto
4. Si el alimento no necesita licuarse, pesar 10 g de producto o 110ml
directamente en un frasco de dilución con 90 ml de solución salina estéril y
agitar vigorosamente para homogenizar la muestra.

Diluciones decimales
1. Se tomará ml de la dilución y se transferirá a un tubo que contiene 9 ml de
agua peptonada al 0.1%
2. Esta operación se repetirá para preparar tantas diluciones decimales como
sea necesario.

Prueba presuntiva para coliformes

1. Inocular una serie de tres tubos conteniendo 10 ml de caldo lauril sulfato y
campana de Durham con 1 ml de dilución
2. Proceder de igual manera con las diluciones 10 -2 y 10-3. En total deben ser
9 tubos por muestra.
3. Incubar los tubos a 37°C por 48 horas.

Prueba confirmativa de coliformes totales

1. De los tubos positivos transferir asépticamente una asada de los cultivos a
tubos con 10 ml de caldo brilla con campanas de Durham, repetir la
operación tres veces.
2. Incubar por 37°C por 48 horas
3. La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo de bilis verde
brillante significa un test confirmativo positivo para coliformes, ausencia de
gas constituye un test negativo para coliformes.

Prueba confirmativa para coliformes fecales

1. De los tubos positivos transferir asépticamente una asada de los cultivos a
tubos con 10 ml de caldo EC con campanas de Durham, repetir la operación
3 veces.
2. Incubar por 44.5°C por 24 horas

10
3. La presencia de gas en los tubos de fermentación en caldo EC significa
test confirmativo positivo para coliformes fecales, ausencia de gas
constituyente un test negativo para coliformes fecales.

Cálculo y expresión de resultados

1. La combinación de tubos positivos y/o negativos en los test confirmativos
de caldo bilis verde brillante es referida a la tabla N°1 (NMP por gramo de
muestra e intervalos de confianza del 95% utilizando 3 tubos con 0.1 – 0.001-
0.0001g de muestra) y se expresa como: NMP de coliformes/g o ml de
muestra
2. Si en vez de las porciones de muestra 0.1- 0.01- 0.001 se utiliza 0.01-
0.001- 0.0001. se lee el resultado de la tabla y se multiplica por 10
3. Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera
el resultado de 3 series, eligiendo la dilución más alta que da resultados
positivos en los 3 tubos ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando
el resultado de estas 3 series, leer en la tabla de NMP y multiplicar por 10,
100, 1000, etc. Según las porciones de muestra consideradas.

Recuento de coliformes en medio sólido

Dilución primaria
1. Pesar 10 g del alimento en condiciones asépticas.
2. Transferir a un vaso de licuadora previamente lavado y desinfectado con
alcohol
3. Agregar 90 ml de solución salina estéril y licuar por un minuto
4. Si el alimento no necesita licuarse pesar 10 g de producto o 10ml
directamente en un frasco de dilución con 90 ml de solución salina estéril y
agitar vigorosamente para homogenizar la muestra.
Diluciones decimales:
1. Se tomará 1ml de la dilución y se transferirá a un tubo que contiene 9.0 ml
de agua peptonada al 0.1%
2. Esta operación se repetirá para preparar tantas diluciones como sea
necesario (10-3,10-4,10-5)
Siembra por incorporación
1. Sembrar las diluciones por duplicado de la muestra, usando la técnica de
vaciado en placa con agar VRBA
2. Inocular las placas Petri vacía estéril, con 1 ml de cada solución
3. Verter en cada placa 10ml de agar VRBA temperado a 45°C
4. Mover las placas con movimientos rotatorios, para mezclar la muestra y el
medio de cultivo.
5. Cuando el agar esta solidificado agregar aproximadamente 5ml de agar
VRBA temperado sobre la superficie del agar, formando una capa superficial
para prevenir el crecimiento invasivo.

11
6. Dejar solidificar el agar, incubar las placas invertidas a 35°-37°C durante
18 a 24 horas.
7. Al termino del periodo de incubación, seleccionar la dilución cuyas placas
contengan entre 25 y 250 colonias, contar las colonias sospechosas tanto
típicas como atípicas y registrar el resultado multiplicando el número de
colonias por la dilución correspondiente.

Prueba confirmatoria para grupo coliformes

1. Seleccionar por lo menos 10 colonias sospechosas e inocular en caldo
lactosa verde brillante bilis 2% conteniendo tubo de fermentación
2. Incubar los tubos de caldo brilla a 35°C. Examinar los tubos por producción
de gas a las 24 y 48 horas.
3. Al término del periodo de incubación observar la formación de gas en los
tubos de fermentación. Registrar como positivo aquellos tubos que presentes
gas, la ausencia de gas es considerado un test negativo.

VI. RESULTADOS

VRBA CONCENTRACIÓN RESULTADOS

120 10-1 Colonias
Cromosas
(ámbar)

560 10-2 Colonias

cromosomas
(ámbar
contaminada de
color verde)

600 10-3 Fucsia rosado

claro, lines

12
 464 10-4 Fucsia inteso,
colonias grandes
contaminadas
con hongo

No se puede 10-5 Verde oscuro-

contar petróleo
(contaminado)

CALDO LST
CONCENTRACIÓN RESULTADOS
10-1 3 positivos
-2
10 3 positivos
10-3 3 positivos
10-4 3 positivos
10-5 3 positivos
NMP: >2400/100mL
CALDO EC
CONCENTRACIÓN RESULTADOS
10-1 3 positivos

10-2 3 positivos

13
 10-3 3 positivos

10-4 3 positivos

10-5 3 positivos

NMP: >2400/100Ml

CALDO BRILLA
CONCENTRACIÓN RESULTADOS
10-1 3 positivos
10-2 3 positivos
10-3 3 positivos
10-4 3 positivos
10-5 3 positivos
NMP: >2400/100Ml
AGAR PANO INCLINADO
CONCENTRACIÓN RESULTADOS
10-2 No se observa
coloración en el Agar

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 10-3 Se observa coloración
verdosa

10-4 Se observa coloración

rojiza

10-5 Se observa coloración

azul

NMP: >2400/100mL
CALDO LACTOSO
CONCENTRACIÓN RESULTADOS
10-3 3 positivos

10-4 3 positivos

10-5 3 positivos

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VII. DISCUSION DE RESULTADOS

Los coliformes fecales y E. coli se emplean como “microrganismos

indicadores”. Su presencia en alimentos puede deberse a elaboración en
malas condiciones, contaminación del alimento ya preparado, o crecimiento
en el alimento. Coliformes fecales y E. coli pueden indicar contaminación
fecal, aunque pueden vivir en ambientes no intestinales, incluyendo
instalaciones industriales.
De los resultados de laboratorio se confirma la extremada presencia de
coliformes fecales y totales, lo cual nos lleva a suponer las condiciones en
que se obtuvo la carne al realizar la compra para llevarlo al laboratorio como
muestra.
Con los resultados obtenidos sobre la cantidad de coliformes fecales y
totales, estos indicadores nos señalan la calidad sanitaria de la carne que se
llevó al laboratorio de la facultad de ingeniería ambiental como muestra y su
posterior análisis. un mal manejo y consumo de alimentos con esta cantidad
de coliformes podría causar enfermedades gastrointestinales entre otras.
Se presento dificultades en parte del experimento ya que se produjo la
contaminación de algunos tubos al realizar la siembra en el agar de plano
inclinado, así como de la precisión de los materiales utilizados. Fuera de
estos acontecimientos los resultados fueron óptimos en la numeración de
coliformes fecales y totales en muestras solidas.
Los resultados fueron tomados de practica de laboratorio del 14 de
junio del 2019 por los estudiantes del curso de microbiología ambiental
de la FIA, llevado a cabo en ciclo presencial 19-1 con el docente a cargo
Ms. Blgo. Álvaro Martín Martínez Vila

VIII. CONCLUSIONES

 El procedimiento para hallar los coliformes fecales y totales fue el método

del número más probable (NMP), es un método muy eficaz, el cual se basa
en la cantidad de tubos positivos a la fermentación de la lactosa contenida
con las muestras en los caldos de cultivo. Para este fin es indispensable el
uso de la campana de Durham.
 Los coliformes se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa
evidenciada con la producción de ácido y gas. De esta manera comprobamos
su existencia mediante la observación de gas en los tubos con campana de
Durham. Si en caso no se pudiera evidenciar la formación de gas, se analiza
el contenido de los tubos por su acidez con algún indicador de pH como el

16
rojo neutro, cuyo viraje en acidez ocurre a un pH de 4,6 a 5.
 Se concluye que todas las muestras de carne molida analizadas en el
presente laboratorio contienen coliformes totales y coliformes fecales como la
Escherichia Coli, así como también posibles patógenos cuya sola presencia
en dichos alimentos condiciona la peligrosidad para la salud de las personas.
 La alta concentración de coliformes totales se pudo constatar en la prueba
confirmativa en medio sólido de Agar ENDO y estriado por agotamiento, con
un brillo rojizo metálico característico.
 Los niveles altos de bacterias coliformes en las muestras analizadas
indican la manipulación y/o elaboración deficiente en los alimentos. Por esa
razón es uno de los principales indicadores de calidad microbiana en los
alimentos.
 El término «bacteria coliforme» no describe un grupo taxonómico que
transcienda a las eubacterias; en realidad se utiliza para agrupar varios
géneros de la familia de las enterobacterias. Entre sus características
bioquímicas comunes se encuentran la reacción positiva a la lactosa y
reacción negativa a la oxidasa. (r-biopharm, s.f.)

IX. RECOMENDACIONES

 Se recomienda usar apropiadamente los equipos de protección personal

(EPP) tales como: los guantes, el mandil, las mascarillas, etc. con la
finalidad de evitar exponerse a las muestras contaminadas por coliformes
totales y fecales como por ejemplo la Escherichia Coli, Citrobacter,
Enterobacter y Klebsiella; microorganismos analizados en el presente
laboratorio y que puedan resultar patógenas causando molestias como
dolor abdominal, vómito o diarrea.
 Trabajar en condiciones de asepsia, usando el mechero Bunsen, con el
propósito de no contaminar las muestras con otros microrganismos
presenten en el ambiente y que puedan provocar errores en los
resultados obtenidos.
 Se recomienda trabajar con tablas estadísticas adecuadamente
actualizadas que nos informen los NMP y sus respectivos intervalos de
confianza, con el propósito de obtener los resultados más fieles de los
procedimientos.
 Recomendaciones sobre salubridad de alimentos:
 Según los resultados obtenidos, se recomienda tomar las medidas
adecuadas para prevenir posibles enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA) causadas por los coliformes totales y fecales como la
gastroenteritis, salmonelosis, etc.

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 Utilizar y/o consumir solo alimentos de buena calidad, sin signos de
deterioro, como golpes, manchas, mohos o restos de parásitos ya que
estos pueden ser indicativos de patógenos alimentarios.
 Lavar bien los alimentos con abundante agua, eliminando todo resto de
suciedad o tierra ya que se ha demostrado que existen coliformes en
estos medios que pueden resultar dañinos para la salud.

 Debido a que los coliformes analizados se desarrollan a temperaturas

entre 37°C (aerobios mesófilos, coliformes totales) y 44°C (coliformes
fecales), se recomienda congelar los alimentos (carnes y pescados) para
una mejor conservación.

X. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el fundamento del caldo EC?

El medio EC se fundamenta en proporcionar los elementos nutricionales

necesarios para el desarrollo óptimo de coliformes totales y fecales, donde está
incluida la bacteria Escherichia coli. Estos elementos nutricionales son
proporcionados por la tripteína, siendo una excelente fuente de péptidos y
aminoácidos. Además, también contiene lactosa, un carbohidrato fermentable
que brinda energía y permite evidenciar si la bacteria produce gas. Por otra
parte, el medio contiene sales biliares que brindan el carácter selectivo, ya que
inhibe el crecimiento de microorganismos Gram positivos que puedan estar
presentes en la muestra.
Así mismo, el fosfato dipotásico y el fosfato monopotásico actúan como un
sistema equilibrador del pH. Este sistema es necesario, debido a que la lactosa
contenida en el caldo tiende a acidificar el medio cuando es fermentada por los
microorganismos, pero esto es compensado por las sales fosfatos.
Por tanto, estos elementos son esenciales, debido a que la acidez sin control
puede afectar el buen desarrollo de los microorganismos buscados.
Por su parte, el cloruro de sodio estabiliza el medio osmóticamente, en tanto que
el agua es el disolvente de los solutos presentes y brinda la consistencia líquida
al medio.

2. ¿Cuál es el fundamento del caldo brilla verde brillante?

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La prueba confirmativa se realiza con caldo BRILA, el cual inhibe el crecimiento
de flora acompañante por su contenido de bilis y verde brillante, La fermentación
de la lactosa con formación de gas, es un indicativo de la presencia de
Escherichia coli, pero coliformes no fecales también crecen en este medio, las
cuales pueden presentar formación de gas en algunas ocasiones.

3. ¿Cuál es el fundamento del agar VRBA?

En la atmósfera de horticultura, la peptona y el prontuario de catalizador aportan

los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y la
lentilla violado inhiben el cambio del manto vegetal grampositivas, la caucho es
el harina fermentable, y le arrebol neutro es el guía de pH. El agar es el espía
solidificante.
Los coliformes son bacterias que fermentan la leche, acidifican el entorno y
producen una rotación del arquetipo de pH al color rojo agitado. porque esto, se
observan como colonias de color purpura, de 1 a 2 mm de diámetro,
generalmente rodeadas, de una división rojiza de irritación precipitada.

XI. FUENTES DE INFORMACIÓN

 Olga, María (2007). Determinación de Coliformes totales y E. Colide aguas

mediante la técnica de sustrato definido, colilert por el método de Numero Más
Probable
 Ingraham, Catherine A. (1997). Introducción a la Microbilogía.
 MAP (2009). MANUAL DE MÉTODOS DE ENSAYO PARA MARISCOS Y
AGUAS SANIPES
 Análisis de coliformes fecales

http://www.microlabindustrial.com/parametros/patogenos/182/coliformes-
fecales#:~:text=Los%20coliformes%20fecales%20se%20definen,de
%20Klebsiella%2C%20Enterobacter%20y%20Citrobacter

 Coliforme

https://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme#:~:text=El%20grupo%20de%20los

19
 %20coliformes%20incluye%20bacterias%20en%20forma%20de,Escherichia

 Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y

Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (número más
probable o NMP)

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf
 Violet Red Bile Agar (VRBA)

https://www.neogen.com/es/solutions/microbiology/violet-red-bile-agar/

20
21
 XII. APENDICE

1. DIAGRAMA DE FLUJOS
DETERMINACION DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O
ALIMENTOS.
Transferencia a
un vaso de
Pesar 10 g licuadora
de alimento desinfecta con
Dilución en alcohol
primaria condiciones
asépticas

Agregar 90 ml
Agregar en un de sol. Salina
(0.9% p/v) y
frasco con 90 ml licuar. Dilución
de sol salina ya 10-1
agitar.

Tomar 1ml de la
dilución y
transferir a un
tubo con 9ml de
agua peptonada

Proceder de
igual manera con
las diluciones 10- Inocular una serie de
2
y tres tubos conteniendo
10-3 10 ml de caldo lauril
sulfato y campana
De Durham, con 1 ml
de dilución 10-1
 Incubar a 37°C por hora Transferir
asépticamente una
asada de los cultivos a
tubos con 10 ml de
caldo Brilla con
campanas de Durham.

Ausencia de gas: Repetir la operación

Negativo 3 veces

Incubar a 37°C
por hora

Presencia de gas:
Positivo

Transferir
asépticamente una
asada de los cultivos a
tubos con 10 ml de
caldo

Ausencia de
Incubar por 44.5°C por gas: Negativo
24
horas
Presencia de gas:
Positivo
 RECUENTO DE COLIFORMES EN MEDIO SÓLIDO

Pesar 10 g de
Transferencia a
Dilución alimento en
un vaso de
primaria condiciones
licuadora
asépticas
desinfecta con
alcohol

Agregar en un
Agregar 90 ml
frasco con 90 ml
de sol. Salina
de sol salina ya
(0.9% p/v) y
agitar.
licuar. Dilución
10-1

Tomar 1ml de la
dilución y
transferir a un
tubo con 9ml de
agua peptonada

Sembrar por
duplicado
mediante vaciado
de placa (Agar
VRBA)

Inocular la placa con Verter 10ml de agar

1 ml de disolución VRBA en cada placa.
 Mover y rotar
Dejar solidificar

Incubar las placas

Prueba invertidas a 35°c.
confimatoria Durante 18 a 24
para grupos horas
fecales

Seleccionar por lo menos

10 colonias sospechosas e
inocular en caldo Lactosa
verde Brillante Bilis 2%
(Brilla) conteniendo tubo
de fermentación.

Examinar los
tubos por
producción de Ausencia de gas:
gas Negativo

Presencia de gas:
Positivo
 2. DATOS ORIGINALES Y OBSERVACIONES

Observación de los diferentes tipos de medios que se pueden usar para

Numeración de los coliformes totales y coliformes fecales

Agar Violet Red Bilis Agar (VRBA)

es un medio de cultivo de
microorganismos, tanto selectivo, como
diferencial, que se usa para la
identificación y enumeración de
coliformes.

AGAR EMB

El medio contiene azul de metileno que

permite identificar la E.coli por el brillo
metálico de su colonia. A la vez permite
la diferenciación de microorganismos
lactosa positivo y lactosa negativos.

Agar Sal y Manitol (MSA)

Es un medio selectivo preparado según

las recomendaciones de Chapman
para el aislamiento de presuntos
estafilococos patógenos. La mayoría
de las otras bacterias están inhibidas
por la alta concentración de cloruro
sódico.
Chromocult Agar

es un medio de cultivo cromógeno

diferencial para el análisis
microbiológico de muestras de agua.
En un plazo de 24 horas este medio
permite la detección, la diferenciación y
la enumeración simultáneas de E. coli y
bacterias coliformes del agua potable.
XIII. ANEXOS