UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

ESCUELA PROFESIONA DE INGENIERIA AMBIENTAL

“Año de la universalización de la salud’’

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

TEMA:
AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO Y
DISOLVENTES DE FOSFATOS EN LA PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LA
LECHUGA ( Lactuca sativa L.)

AUTORES: ” Haydee B. Peña e Isbelia Reyes”

Curso:
Biotecnología

Integrantes :
 Noemi Esther Escobar Ferro
 Jhoselin Shantal Alarcon Mamani
 Maria Fernanda Anayhuaman
 Rosalinda Apaza Apaza
 Ruth Mayra Apaza Foraquita
Docente :
Dr. Herbert H. Soto Gonzales

Escuela Profesional:
Ingenieria Ambiental

Ciclo: VII
Fecha: 19/11/2021

ILO -PERU
 AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE BACTERIAS FIJADORAS DE
NITRÓGENO Y DISOLVENTES DE FOSFATOS EN LA PROMOCIÓN DEL
CRECIMIENTO DE LA LECHUGA (Lactuca sativa L.)

Resumen Introduccion Materiales y Metodos Resultados

Aislamiento de microorganismos de potencial

crecimiento vegetal provenientes de la rizósfera de
plantas de lechuga.
En los últimos años ha habido un interés
Se propuso obtener bacterias
creciente en los microorganismos  textura franca
promisorias como promotoras del
benéficos del suelo, ya que éstos pueden Caracteristicas físico-
crecimiento, provenientes de la  pH 6,5
promover el crecimiento de las plantas y en quimicas :
rizósfera y de las semillas de la
algunos casos también evitar la infección
lechuga . Se detectó la colonización  conductividad eléctrica 0,1Mmhos·cm-1
del tejido vegetal por patógenos. Por su
rizosférica de por lo menos siete cepas
parte, los microorganismos de la rizosfera  materia orgánica 3,1%
de Rhizobium, identificadas mediante
estimulan la exudación de la raíz a través
una prueba de nodulación con
de la liberación de variadas sustancias  P 9ppm
Phaseolus vulgaris y de crecimiento en
producto de su metabolismo.
los medios GPA, ELMABAT, y NaCl  Ca, K y Mg 2093, 184 y 85ppm
Recientemente, la denominación se ha
2, 3 y 5%. Dichos rizobios disolvieron
extendido a microorganismos PGP para
hidroxiapatita y en algunos casos
incluir hongos y cualquier organismo afín.
mostraron crecimiento en ³2%
Sin embargo, en la última década un interés
NaCl. Aunque todas las cepas
creciente ha sido dirigido hacia los Transpore : Las muestras fueron transportadas en una cava con hielo seco.
bacterianas produjeron AIA en
microorganismos endófitos, los cuales al
ausencia y presencia de triptófano, éste
estar menos afectados por el estrés Se preparo una suspensión con dicho suelo (0,5-1,0g de suelo seco) al sumergir las raíces en 10ml de
no es el único parámetro implicado en
ambiental y más aclimatados con su una solución estéril de NaCl 0,89% y al centrifugar a 200rpm durante 30min.
la promoción del crecimiento de las
hospedero podrían representar una mayor
plántulas de lechuga. La suspensión obtenida constituyó la dilución 1/10, a partir de la cual se realizaron diluciones hasta
ventaja ecológica.
1×10-6.

Conteo de Hongos : Se realizó por medio de PDA (papa-dextrosa-agar) con sulfato de estreptomicina
(100µg·ml-1) y cloranfenicol (30µg·ml-1).

Conteo de Bacterias totales : se empleó caldo nutritivo a 1/10 de la concentración estándar. Se usó el
medio mínimo con hidroxiapatita (MM-HA; Ca10(PO4)6(OH)2) para el conteo de hongos y bacterias
fosfodisolventes, preparado (para un litro de agua) con 0,1g NaCl; 0,4g NH4Cl; 0,78g KNO3; 0,50g
MgSO47H2O; 0,1g CaCl22H2O; 0,5mg FeSO47H20; 1,56mg MnSO4H2O; 1,40mg ZnSO47H20; 10g
glucosa; y 2,7g HA (0,05% P) todo tamizado a 100 mallas; y 20g de agar (Reyes et al., 1999)Totales

Aislamiento de hongos fosfodisolventes: se agregó 30mg de sulfato de estreptomicina y 100mg de cloranfenicol. El

medio ELMARC (extracto de levadura-manitol-agar-rojo congo) fue utilizado para el aislamiento de posibles rizobios
(Ferrara, 1993) y el mismo medio ELMARC, sustituyendo la fuente de fósforo soluble por HA, permitió el aislamiento
selectivo de potenciales cepas de Rhizobium con poder fosfodisolvente.
 Determinación de bacterias
Evaluó la capacidad de nodulación de las cepas Rhizobiumi: simbióticas fijadoras de N2
 se utilizó Phaseolus vulgaris como planta indicadora
 se esterilizó la superficie de las semillas de P.
vulgaris con etanol 85% por 2min, NaHClO al 5,25% por
15min, seguidos de 3 y 10 enjuagues, respectivamente,
con agua desmineralizada estéril
Aislamiento de bacterias
endófitas de semillas de lechuga
se prepararon suspensiones bacterianas con los aislamientos
rizosféricos promisorios que crecieron en el medio ELMARC
formando las características colonias rosadas del  aislamiento de bacterias endófitas: s fueron lavadas en agua estéril durante 15min y posteriormente en
genero Rhizobium solución salina estéril por 30min con movimiento constante a 140rpm.
 las semillas de lechuga se esteriliza, utilizado para las semillas de P. vulgaris.
Las semillas de P. vulgaris fueron inoculadas
 a suspensión obtenida fue sembrada en los medios MM (testigo), ELMARC, Manitol (Holt y Krieg, 1994) y Nfb-
Las siembras fueron realizadas por quintuplicado para cada uno glucosa sólido y semisólido (Döbereiner et al., 1999), para determinar la presencia de microorganismos no
de los aislamientos seleccionados utilizando macetas de 250ml Selección de las cepas
provistas de drenaje y con doble fondo rellenas con una mezcla 
bacterianas y determinación de .
1:1:1 de arena:turba:vermiculita, esterilizada por tindalización
AIA
Se evaluaron nueve aislamientos y se incluyó un testigo sin
inocular.
El potencial efecto promotor de crecimiento de los aislamientos provenientes de la rizósfera y del interior de las semillas
plantas fueron mantenidas en una cámara de crecimiento de lechuga fue seleccionado en base a la fijación de N2, la disolución de fosfatos y la tolerancia a altas concentraciones
regándolas, de forma interdiaria, con agua y solución Hoagland a de NaCl. Los aislamientos fueron posteriormente evaluados para la producción de ácido indolacético (AIA) en presencia
¼ para los macronutrientes y fórmula completa para los y ausencia de triptófano, según Glickmann y Dessaux (1995)
micronutrientes. A los 45 días se efectuó el reaislamiento de los
rizobios a partir de los nódulos correspondientes a cada
tratamiento, y los aislamientos seleccionados se caracterizaron Inoculación de bacterias en
mediante las siguientes pruebas bioquímicas establecidas para semillas de L. sativa
las bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno (Ferrara, 1993;
Holt et al., 2000): ELMARC con NaCl 1, 3 o 5%; glucosa-peptona-
agar-púrpura de bromocresol (GPA) y extracto de levadura- las semillas de lechuga fueron inoculadas y sembradas en bandejas de horticultura provistas de un sustrato comercial
manitol-agar-azul de bromotimol (ELMABAT). También se evaluó esterilizado por tindalización, y luego se llevaron a una cámara de crecimiento donde se les suministró irrigación con
la disolución de fosfatos en los medios ELMARC-HA y MM-HA. solución de Hoagland. A los 35 días después de la siembra se secó el material en una estufa con circulación de aire forzado,
a 72ºC durante 48h, y se cuantificó la materia seca total.

Análisis de los datos

todos los tratamientos se realizaron por triplicado. El análisis de varianza (ANOVA), así como la comparación de medias
entre los tratamientos se realizó por el método de la mínima diferencia significativa (LSD).
 Resultados

Aislamiento y caracterización
Las cepas evaluadas en la prueba de nodulación con P. Cuantificación de bacterias Efecto de la
de microorganismos
vulgaris indujeron la formación de nódulos a partir de endófitas en semillas de lechuga biofertilización en el
provenientes de la rizósfera
los cuales se reaislaron nueve cepas bacterianas. crecimiento de
plántulas de lechuga

Las bacterias
Al cuantificar las poblaciones cultivables de endófitas que Al medir el
microorganismos de la rizósfera de plantas de pruebas bioquímicas tolerancia a concentraciones crecieron en el efecto de la
lechuga procedentes de la unidad académica "La de NaCl ³2% medio ELMARC inoculación de
Primavera" se encontró que las bacterias fueron más no fueron las bacterias
numerosas que los hongos. identificadas. 33, 45 y M en
toleraron hasta 5% HCl, Las cepas
rasgo que sumado al forma aislada y
crecimiento en el medio GPA en consorcio
Este crecimiento reveló un
y la producción de ácido o - 31 sobre el
totales como
toleraron disolventes
hasta de HAque
5% HCl, rasgo (Tabla I). al crecimiento en el
sumado comportamiento microaerófilo
álcali en el medio ELMABAT - 33 crecimiento de
medio GPA y la producción de ácido o álcali en el medio ELMABAT acompañado de un viraje del color
- CII la lechuga en
permitió separar tres grupos, el de Rhizobium (cepas 17, 22, 31, 33, del medio con azul de bromotimol.
condiciones de
39 y 45), el de Bradyrhizobium (cepa CI) y un tercer grupo no permitió separar tres grupos, . semillero hasta
definido con las pruebas realizadas (cepas 44 y CII). el de Rhizobium El cambio de coloración mostró un los 30 días.
descenso del pH de 6,5 a 4,0 por la
fuerte producción de ácido.
- 17 - 33
- 22 - 39 se encontró un incremento
- 31 - 45 significativo (p<0,05) del peso seco de
Producción del AIA por las plántulas al utilizar como inóculos la
los bioinoculantes de la cepa 33 y el consorcio 3345 (Figura 1),
en relación al testigo no inoculado.
 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Se detectó una abundante comunidad

Donde microbiana cultivable disolvente de
fosfatos de calcio proveniente del suelo
rizosférico de plantas de lechuga en
condiciones de campo (Tabla I), comparada las bacterias pueden ser
con la reportada por Reyes et al. atraídas por procesos de
las poblaciones cultivables
disolventes de HA señaladas quimiotaxis
fueron de 29% para los hongos
y 13% para las bacterias. el bajo contenido de fósforo disponible
en el suelo del MOPREVATS (9ppm)
(1996) hallaron a Reis et al. (2004),
y Rhizobium,es predominante destacaron la mayor
en la lechuga como en maiz abundancia de micro
las cepas bacterianas la alta exigencia de fósforo por
organizamos benéficos en el
parte de la lechuga
suelo

los géneros Rhizobium

El uso de pruebas bioquímicas y Las poblaciones bacterianas endófitas
de medios de cultivo presentes en las semillas de lechuga.
Azospirillum

Gutiérrez Zamora y Martínez-Rome

(2001) aislaron R. etli como endófito
se encontró que algunas bacterias
de granos de maíz
presentaron potencial como
biofertilizantes en plántulas de
Cavalcante y Döbereiner, 1988), y
lechuga.
Burkholderia en maíz

el crecimiento de las plántulas la producción de hormonas de (Perin et al., 2006) y en esporas de la

en un 25,8% crecimiento in vitro no se determina la micorriza arbuscular
acción biofertilizante de una bacteria.

Bianciotto et al., 2000). En arroz y en

(Gomes et al., 2003). Los rizobios
caña de azúcar
aislados en este trabajo presentaron
altos valores de producción
la asimilación de N2 por la planta
(Njoloma et al. 2006)
la inoculación
combinada de las AIA, a provocando un
incremento de 32,3% del peso los tejidos de la raíz y del tallo
cepas 33
seco de las plántulas (Njoloma et al., 2006).

Similarmente, en los consorcios la acción

45, la cual produjo un
benéfica de cada inoculante actuaría en forma
incremento de 18,4% del individual de la cepa 33, mostró la
sinérgica entre ellos mismos y en su interacción
peso seco . buena calidad del consorcio
con la planta.

Rodelas et al. (1999) reportan que la

inoculación de Rhizobium/Azotobacter y
Rhizobium/Azospirillum indujo una mayor
acumulación de nutrientes en el tejido foliar
de Vicia faba.