Determinación de E. Coli / Coliformes Metodo Petrifilm

DETERMINACIÓN DE E. COLI / COLIFORMES Página: No.
METODO PETRIFILM 1 de 11
DETERMINACIÓN DE E.COLI/COLIFORMES
METODO PETRIFILM
TABLA DE CONTENIDO
ELABORADO POR REVISADO POR APROBADO POR
1. OBJETIVO..........................................................................................................3
2. ALCANCE...........................................................................................................3
3. RESPONSABILIDAD..........................................................................................3
4. DEFINICIONES..................................................................................................3
5. RECURSOS.......................................................................................................3
6. PROCEDIMIENTO.............................................................................................4
6.1. GENERALIDADES:......................................................................................4
6.3. INCUBACIÓN...............................................................................................5
6.4. INTERPRETACIÓN......................................................................................5
6.5. ANÁLISIS DE MATERIAS PRIMAS.............................................................9
6.6. ANÁLISIS DE AMBIENTES.........................................................................9
6.7. ANÁLISIS DE SUPERFICIES......................................................................9
6.8. REGISTRO DE ANÁLISIS............................................................................9
7. OBSERVACIONES............................................................................................9
RECOMENDACIONES DE ALMACENAMIENTO.................................................9
8. SEGURIDAD INDUSTRIAL..............................................................................10
9. FORMATOS RELACIONADOS.......................................................................10
10. CONTROL DE CAMBIOS..............................................................................11
1. OBJETIVO
Establecer un procedimiento operativo estándar para la determinación

microbiológica de E. coli y coliformes aplicado a materias primas, producto
terminado, superficies, ambientes y personal, utilizando el método de Petrifilm
2. ALCANCE
Este procedimiento aplica para materias primas, producto terminado,

superficies, ambientes y personal.
3. RESPONSABILIDAD
Es responsabilidad del Analista capacitado, entrenado y autorizado por el

Director Técnico a través del formato “Autorización del Personal del
Laboratorio, realizar la determinación microbiológica de Mesófilos Aerobios
en las diferentes matrices de las muestras ha llegadas al laboratorio.
4. DEFINICIONES
 Coliformes: bacterias anaerobias facultativas, Gramm negativas, no

esporulantes, con forma de bacilos, que fermentan la lactosa con formación
de gas en 48 horas a 35 °C. Estas bacterias constituyen aproximadamente
el 10% de los microorganismos intestinales de los seres humanos y otros
animales y se utilizan ampliamente como microorganismos indicadores.
 Colonia: Grupo o conjunto de microorganismos que se multiplican sobre

una superficie sólida como la de un medio de cultivo con agar; la colonia se
observa a menudo directamente, pero también puede verse con la ayuda
de un microscopio.
 Inoculación: Introducción de una sustancia en un organismo
5. RECURSOS
 Placas Petrifilm específicas para E. COLI / COLIFORMES.

 Dispersor
 Vial de caldo letheen 9ml.
 Jeringa de 1ml y/o 5 ml.
 Cabina de flujo laminar calificada.
 Marcador permanente
6. PROCEDIMIENTO
6.1. GENERALIDADES:
Las Placas Petrifilm™ para el Recuento de E.coli/Coliformes (Placa Petrifilm EC)

contienen nutrientes de Bilis Rojo Violeta (VRB), un agente gelificante soluble en
agua fría, un indicador de actividad de la glucuronidasa y un indicador que facilita
la enumeración de las colonias. La mayoría de las E. coli (cerca del 97%) produce
beta-glucuronidasa, la que a su vez produce una precipitación azul asociada con
la colonia. La película superior atrapa el gas producido por E. coli y coliformes
fermentadores de lactosa. Cerca del 95% de las E. coli producen gas,
representado por colonias entre azules y rojo-azules asociadas con el gas
atrapado en la Placa Petrifilm EC (dentro del diámetro aproximado de una colonia.
 Tomar 1mL de la muestra con una jeringa estéril y adicionar al vial de caldo
letheen, agitar fuertemente.
 Coloque la Placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada. Levante la
película superior.
 Luego tomar 1mL de la mezcla con jeringa estéril y colóquela en el centro
de la película cuadriculada inferior.
 Libere la película superior dejando que caiga sobre la dilución. No la deslice
hacia abajo.
 Con el lado rugoso hacia abajo, coloque el dispersor o esparcidor sobre la

película superior, cubriendo totalmente la muestra.
 Presione suavemente el dispersor para distribuir la muestra sobre el área
circular. No gire ni deslice el dispersor. Recuerde distribuir la muestra antes
de inocular una siguiente placa.
 Levante el dispersor o esparcidor. Espere por lo menos 1 minuto a que se
solidifique el gel y proceda a la incubación.
6.3. INCUBACIÓN
Incube las placas a 35°C (± 2°C) por 48 hrs. (± 3 hrs.) (AOAC método oﬁcial
986.33) cara arriba en grupos de no más de 20 piezas. Puede ser necesario
humectar el ambiente de la incubadora con un pequeño recipiente con agua
estéril, para minimizar la perdida de humedad.
6.4. INTERPRETACIÓN
 Las Placas Petrifilm pueden ser contadas en un contador de colonias

estándar u otro tipo de lupa con luz.
 La AOAC Internacional y el Manual de Análisis Bacteriológico de la FDA de
los Estados Unidos definen los coliformes como colonias de bastoncillos
gram-negativos que producen ácido y gas de la lactosa durante la
fermentación metabólica de la lactosa. Las colonias coliformes que crecen
en la Placa Petrifilm EC, producen un ácido que causa el oscurecimiento
del gel por el indicador de pH. El gas atrapado alrededor de las colonias
rojas de coliformes confirma su presencia.
6.5. ANÁLISIS DE MATERIAS PRIMAS
Se debe seguir el mismo procedimiento descrito del numeral 6.2 hasta 6.4 para
materias primas liquidas, para materias primas sólidas en el momento del
muestreo se debe pesar únicamente 1g (gramo) y se adiciona a la bolsa estéril
directamente el caldo letheen. Se debe ajustar pH a las muestras de materia
prima.
Ajuste el pH de la muestra diluida entre 6.6 y 7.2. Para productos ácidos usar una
solución 1N de NaOH, para productos básicos usar una solución 1N de HCl.
6.6. ANÁLISIS DE AMBIENTES
 Se inoculan las placas con 1 mL caldo letheen únicamente y se sigue

procedimiento 6.3.
 Luego se colocan en refrigeración durante 2 horas.
 Se sacan del refrigerador y se temperan por 15 minutos.
 Las placas se colocan en cada una de las áreas a muestrear, levantando la
película cuidadosamente durante 15 minutos.
 Se incuban según el numeral 6.4.
 Resultados: # de colonias en 40 cm2 x 15 minutos de exposición.
6.7. ANÁLISIS DE SUPERFICIES
 Seguir procedimiento del numeral 6.3.

 Hacer impresión sobre la superficie a analizar, en el caso de áreas se debe
tomar en cinco puntos como mínimo.
 Incubar de acuerdo al numeral 6.4.
 Resultados: # de colonias en 60 cm2.
6.8. REGISTRO DE ANÁLISIS
Los análisis deben registrarse en el formato “Hoja de Trabajo Analítico –

Microbiología”,.
7. OBSERVACIONES
RECOMENDACIONES DE ALMACENAMIENTO
Almacene los paquetes Para cerrar un Mantenga los paquetes

cerrados a una paquete abierto, doble cerrados (según se
temperatura <8 °C (<46 el extremo y séllelo indica en el punto 2) a
°F). Las placas deben con cinta adhesiva temperatura <25 °C (<77
usarse antes de su fecha para evitar el ingreso °F) y una humedad
de caducidad. En áreas de humedad y, por lo relativa <50%. No
de alta humedad, donde la tanto, la alteración de refrigere los paquetes
condensación puede ser las placas. que ya hayan sido
un inconveniente, es abiertos. Utilice las
recomendable que los Placas Petrifilm máximo
paquetes se atemperen al un mes después de
ambiente del lugar de abierto el paquete.
trabajo antes de abrirlos.
Las Placas Petrifilm tienen
un tiempo de vida útil de
18 meses desde su fecha
de elaboración. Observe
la fecha de caducidad en
la parte superior de la
placa.
8. SEGURIDAD INDUSTRIAL
 Durante la ejecución de un análisis es obligatorio usar el equipo de

protección personal que sea necesario: bata, gafas, guantes, tapabocas,
entre otros.
 Antes de utilizar cualquier producto químico se debe tener conocimiento de
la información contenida en las Fichas de Seguridad.
Disponer de los residuos generados en el análisis de acuerdo al procedimiento

Manejo y Disposición de Residuos POS-GI-022, versión vigente.
9. FORMATOS RELACIONADOS
 “Autorización del Personal del laboratorio”,.

 “Hoja de Trabajo Analítico – Microbiología
10. CONTROL DE CAMBIOS
CONTROL DE CAMBIOS
Fecha Realizó el cambio
Versión Descripción
(aa-mm-dd) Cargo Nombre

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Establecer un procedimiento operativo estándar para la determinación

Este procedimiento aplica para materias primas, producto terminado,

Es responsabilidad del Analista capacitado, entrenado y autorizado por el

 Coliformes: bacterias anaerobias facultativas, Gramm negativas, no

 Colonia: Grupo o conjunto de microorganismos que se multiplican sobre

 Inoculación: Introducción de una sustancia en un organismo

 Placas Petrifilm específicas para E. COLI / COLIFORMES.

Las Placas Petrifilm™ para el Recuento de E.coli/Coliformes (Placa Petrifilm EC)

 Con el lado rugoso hacia abajo, coloque el dispersor o esparcidor sobre la

 Las Placas Petrifilm pueden ser contadas en un contador de colonias

6.5. ANÁLISIS DE MATERIAS PRIMAS

6.6. ANÁLISIS DE AMBIENTES

 Se inoculan las placas con 1 mL caldo letheen únicamente y se sigue

6.7. ANÁLISIS DE SUPERFICIES

 Seguir procedimiento del numeral 6.3.

6.8. REGISTRO DE ANÁLISIS

Los análisis deben registrarse en el formato “Hoja de Trabajo Analítico –

Almacene los paquetes Para cerrar un Mantenga los paquetes

 Durante la ejecución de un análisis es obligatorio usar el equipo de

Disponer de los residuos generados en el análisis de acuerdo al procedimiento

 “Autorización del Personal del laboratorio”,.

10. CONTROL DE CAMBIOS

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