I.

PROBLEMA

1.1. Planteamiento

Se observa cultivos de taperibá en ámbitos con pluviosidad elevada y

constante, pero también en zonas con una estación seca marcada, en suelos
de textura y acidez variables que cuentan con buena fertilidad y buen drenaje
(Foods, 2021). El taperiba (Spondias dulcis) es una fruta que crece en zonas
tropicales y es usada por sus pobladores como un fruto comestible y nutritivo.

En el Perú se encuentra principalmente en la Amazonía y, no cuenta con

la industrialización y popularidad que sus propiedades organolépticas y
nutricionales merecen. En Perú la madurez del fruto se da entre: Julio, Agosto,
Setiembre, Octubre, Noviembre, Diciembre, Enero.

El fruto del Taperiba se come directamente como cualquier otra fruta. El

jugo de la fruta es utilizado para preparar helados, mermeladas y bebidas, así
como el vino de taperibá, el cual posee propiedades diuréticas e indicadas para
aliviar la cistitis.

En este orden de ideas y teniendo en cuenta a alta demanda que tienen

en estos momentos las materias destinadas a la producción de distintas
variedades de productos comestibles, el taperibá se convierte en una
alternativa de fuente en vitamina C, vitamina A, Calcio, Hierro, compuestos
bioactivos, entre otros compuestos que lo hacen sumamente beneficioso para
la salud de cualquier persona, sumando como una alternativa de producción y
comercialización a los ya existentes (BRENDA, 2016).
1.2. Justificación

Para realizar la pulpa fresca y concentrada de Taperibá. El jugo deberá

ser extraído de frutas sanas, frescas, convenientemente lavadas y libres de
restos de plaguicidas y otras sustancias nocivas y en condiciones sanitarias
apropiadas.

El fruto de Taperibá (Spondias cytherea Sonn), se encuentra en las

zonas tropicales de selva alta en estado nativo y sin cuidados en su cultivo, no
existiendo hasta el momento información de plantaciones tecnificadas, este
fruto se produce una vez por año, pudiendo variar de época de acuerdo con las
condiciones climáticas. Parte de su producción es utilizada en la fabricación de
jaleas, licores, jugos, concentrados y pulpas.

El néctar producto constituido por el jugo y/o la pulpa de frutos,

finamente dividida y tamizada, con agua potable, azúcar, ácido orgánico,
preservante químico y estabilizador si fuera necesario (PÉREZ).

Por lo que urge la necesidad de realizar este estudio de caracterización

funcional, térmica, morfológica y color del almidón de dos variedades pituca
(Colocasia esculenta (L.) Schott), provenientes de la provincia de Leoncio
Prado; a fin de brindar las posibilidades de dar valor agregado de este producto
para su utilización a nivel de la industria alimentaria, química, farmacéutica,
entre otros, etc

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Antecedentes

Según (R, 1994) menciona que el taperiba crece hasta 15metros, el

tronco es recto y de corteza gruesa. Las hojas son pinnadas con cuatro o doce
pares de folíolos oblongos y uno terminal, los cuales son de bordes recortados
y miden de 6 a 16 cm de largo. El árbol en determinada época del año pierde
parte de su follaje. El fruto es una drupa elipsoidal de 4 a 6 cm de largo, el
pericarpio es coriáceo, el mesocarpio es firme, amarillento, aromático y de
sabor acidulado muy agradable. El endocarpio es grande y ovalado, se
proyecta en el mesocarpio en forma de prominencias longitudinales de las que
salen fibras duras que molestan al consumir Ja fruta en forma natural.

(MORTON, 1987) La ambarella (taperiba), en su estado maduro, produce

un jugo delicioso para bebidas refrescantes, mermeladas, ó usadas para
condimento de salsa, sopas y estofados. Las hojas jóvenes de la ambarella son
apelablemente ácidas y consumidas crudas en el sur-este de Asia. En
Indonesia son vaporizadas y consumidas como un vegetal (verduras), también
son usadas como sazonadores para varios platillos. Son algunas veces cocidos
con carne para ablandarlos. De acuerdo al análisis hecho en las Filipinas y
Hawai. Miller, Lovis y Y anazawa en Hawai reportaron un contenido de ácido
ascórbico de 42 mg/lOOgr de pulpa cruda. Es una buena fuente de hierro. Las
frutas no maduras contienen 9.76% de pectina.

(GUNTER, 1999); Menciona que durante su desarrollo en el fruto se

producen unos complicados procesos bioquímicos.

Para su alimentación, el fruto depende en principio de la planta madre y,

una vez recolectado del árbol, su metabolismo puede proseguir de forma
independiente. Con el tiempo van declinando los procesos vitales individuales y
una acción descontrolada de los enzimas lleva al deterioro del fruto.

El estado de madurez óptimo para una degustación placentera se da

cuando el desarrollo de la fruta ha llegado a tal punto que su coloración,
jugosidad, aroma y la relación acidez-dulzor provocan en el consumidor una
sensación armónica, sensorial y típica de la fruta en cuestión.
 (LOPEZ, 1976); menciona que la pulpa es la parte comestible de las frutas o
el producto obtenido de la separación de las partes comestibles carnosas de
éstas, mediante procesos tecnológicos adecuados.

La pulpa se diferencia del jugo solamente en su consistencia; pulpas son

las más espesas, se desechan la cáscara, las semillas y el bagazo. Las 28
pulpas ·deben ser obtenidas de frutas sanas, maduras, limpias, exentas de
parásitos, residuos tóxicos de pesticidas y desechos animales o vegetales. Las
operaciones para obtener pulpa de frutas, se pueden dividir en tres fases de
operación: adecuación, separación y conservación .

(RUIZ, 1993); dice que esta especie nativa de la islas Sociedad y Fingí del
Pacífico, se encuentra distribuida en los trópicos del mundo hasta elevaciones
de 700 m.s.n.m.

En el Perú se encuentra muy extendida en la Región de Loreto, en

menor medida en otras regiones y también en la Selva Central, en bosques no
inundables (de altura y restinga. Aunque la Taperiba es una especie introducida
hace cientos de años, su adaptación en la Amazonia es sorprendente y ahora
parece una especie nativa y la naturaleza se ha encargado de crear·
poblaciones naturales.

2.2 Aspectos generales

2.2.1 El taperiba

Especie nativa amazónica originaria de las Islas Sociedad y Fuji del

Océano Pacífico, está adaptado a nuestra amazonia (CALZADA, 2010).
Adaptada a las tierras bajas y cálidas de las regiones tropicales, crecen en
regiones subtropicales cálidas donde no ocurren heladas (PHILLIPS et al.,
2009). Crece en zonas de vida natural, bosque húmedo tropical y bosque seco
tropical (GUTIÉRREZ, 1969).

2.2.2 Origen
 Esta fruta es nativa de las islas sociedades y Fuji del Océano Pacífico y
fue adaptada en las Amazonas cuando los expedicionarios de URSUA-
AGUIRRE bajaron en el año 1562-1564 y la consumieron por primera vez, esta
fruta fue proveniente de la tierra de Jaén – Bracamoros anteriormente se le
llamaba ciruelas agrias. Fue un brasileño que reporto la fruta en la época
colonial y lo llamo al árbol Titiribá en Tocantins. Se decía que era raramente
cultivada a pesar que ya se conocía que tenia efectos medicinales como
febricitantes (DAVILA, 2016).

2.2.3 Descripción morfológica

Árbol mediano, con una altura de 5 hasta 15 m y de 2 - 3 m del tronco

sin ramas. La copa es frondosa, de ramificación abundante que se inicia en el
primer tercio del tronco, ramas delgadas que toman diversas disposiciones y
las hojas se agrupan en la sección terminal de ellas (GUTIERRES, 2015).

Las hojas son pinnadas con cuatro a doce pares de foliolos oblongo y
uno terminal, los foliolos son de bordes recortados, miden de 6 a 16 cm de
largo. El árbol parte del año esta defoliado.

2.2.4 Clasificación taxonómica

Nombre Científico: Spondias dulcis P.

Nombre común : Taperiba, Tambisho

Familia : Anacardiáceas

Género : Spondias

Clase : Dicotiledónea

2.2.5 El fruto

El fruto es una drupa elipsoidal de 5 - 1 O cm de largo (casi como un

huevo de gallina siendo el fruto más grande dentro del grupo Spondias),
grisáceo o amarillo anaranjado a la madurez, con pulpa amarillo pálido,
aromática y de sabor acidulado agradable. El endocarpio se proyecta en la
pulpa (mesocarpio) en forma de prominencias longitudinales de las que salen
fibras espinosas, duras y curvas; esta característica espinosa interna del fruto
es una condición que limita la popularidad de su uso (ELIAS, 2020).

El endocarpio se divide en cinco celdas, alojándose una semilla en cada

una de ellas, de color amarillo claro, de 1 ,8 cm. de longitud.

2.2.6 Composición química y valor nutricional del fruto del taperibá

Componentes 1 00 g de pulpa

Energía, Kcal 56

Proteína, g 0,6

Grasa, g 0,3

Carbohidratos, g 14,2

Fibra, mg 0,6

Calcio, mg 39

Fósforo, mg 27

Hierro, mg 0,7

Retinol, mcg 0

Tiamina, mg 0,05

Riboflavina, mg 0,19

Niacina, mg 0,67

Acido ascórbico, mg 5,9

Fuente: CODEX (2005).

2.2.7 Usos
 Se utiliza directamente como fruta fresca, en la preparación de jaleas,
pastas, néctares, helados, bebidas refrescantes, licores caseros.

2.2 Concentración de alimentos

La concentración de un alimento consiste en reducir su contenido de

agua. El grado de concentración se determina con el refractómetro y se
expresa en °Brix. La concentración reduce los gastos de transporte y
almacenaje del producto. Además facilita la conservación (RAMIREZ, 2001).

Los métodos de concentración se realizan por evaporación al vacío y

congelación. La evaporación consiste en eliminar el agua por ebullición. Este
método se aplica, por ejemplo para producir el puré concentrado de tomate.

Durante el concentrado por evaporación, puede ocurrir pérdida de

compuestos nutricionales termosensibles, tales como la vitamina C. Para ello el
proceso de evaporación al vacío, es una técnica que permite concentrar jugos
o pulpas con menores pérdidas de nutrientes (ATENSIO, 2022).

Según el CODEX Alimentario 2005, se entiende por zumo o jugo

concentrado de fruta, el producto al que se ha eliminado físicamente el agua en
una cantidad suficiente para elevar el nivel de grados Brix al menos en un 50%
más que el valor 0 8rix, establecido para el zumo o jugo reconstituido de la
misma fruta. En la producción de zumo o jugo destinado a la elaboración de
concentrados, se utilizan procedimientos adecuados, que podrán combinarse
con la difusión simultánea con agua de pulpa y células y/o el orujo de fruta,
siempre que los sólidos solubles de fruta extraídos con agua, se añadan al jugo
primario en la línea de producción antes de proceder a la concentración .

2.3 Radicales libres

Un radical libre es una molécula o ión que tiene un electrón libre en su

órbita exterior. Las partículas radicales son inestables y muy reactivas.

Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un

electrón desapareado por lo que son muy reactivos ya que tienden a sustraer
un electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad
electroquímica. Una vez que el radical libre ha conseguido sustraer el electrón
que necesita para aparear su electrón libre, la molécula estable que lo cede se
convierte a su vez en su radical libre por quedar con un electrón desapareado
iniciándose así una verdadera reacción en cadena que destruye nuestras
células.

La doctora Gerschman (1954), citado por GARCÍA et al., (2001); sugirió

que los radicales libres eran agentes patógenos y estableció en este trabajo 3
postulados básicos: Los radicales libres constituyen un mecanismo molecular
común de daño, cuando los animales de experimentación son sometidos a
altas presiones de oxígeno y a radiaciones ionizantes. El desequilibrio entre
oxidantes y antioxidantes produce efectos tóxicos. La producción de radicales
libres es un fenómeno continuo con implicaciones en el envejecimiento y la
carcinogénesis.

Los radicales libres son especies reactivas de oxigeno (ROS) y especies

de nitrógeno reactivo (RNS), participan el oxígeno y el nitrógeno para formar
radicales libres como el radical hidroxilo (OH-), anión superóxido (02), oxígeno
singulete C02), peróxido de hidrógeno (H20 2), óxido nítrico (NO-), ácido
nitroso (HN02) el radical hipoclorito y varios peróxidos de lípidos.

2.4 Antioxidante
Antioxidante, es toda sustancia que hallándose presente a bajas
concentraciones respecto a las de una molécula oxidable (biomolécula), retarda
o previene la oxidación de este sustrato (SOTO, 2002). inactivan los radicales
libres o inhiben su producción, cediendo un electrón al radical libre, oxidándose
y transformándose en un radical libre débil que es inofensivo, en algunos casos
puede llegar a regenerarse. No todos los antioxidantes actúan de esta manera,
los llamados enzimáticos catalizan o aceleran reacciones químicas que utilizan
a su vez reacciones con los radicales libres.

Así cuando se incrementa la producción de radicales libres, estos

mecanismos se activan para controlar y estabilizar el ambiente rédox intra o
extracelular (AVELLO, 2006).
 Un antioxidante es una sustancia capaz de neutralizar la acción oxidante
de los radicales libres, liberando electrones en la sangre que son captados por
los radicales libres, manteniendo su estabilidad. Nuestro organismo está
constantemente luchando contra los radicales libres.

Los antioxidantes son compuestos como ácidos fenólicos, polifenoles y

flavonoides mientras que los radicales libres son aquellos como peróxidos,
hidroperóxidos.

Los antioxidantes que se encuentran normalmente en el organismo, se

llaman endógenos y generalmente son sistemas enzimáticos, mientras que los
antioxidantes exógenos son los que se ingieren con la dieta encontrándose en
los alimentos como las frutas y verduras (HUMBERTO, 2012).

2.4.1 Principales Antioxidantes

2.4.1.1 Antioxidantes Enzimáticos

Actúan a nivel intracelular conformadas por sistemas enzimáticos, que

intervienen en la regulación de especies oxidantes indeseables como el
superóxido y peróxidos antes que reaccionen e interaccionen con distintas
biomoléculas induciendo daño.

Principales antioxidantes endógenos y tipo de radical que neutralizan:

- Superóxido dismutasa (SOD); su reacción: dismutación de 02- a H20,

enzima intracelular o extracelular responsable de remover los radicales
superóxido. Necesita la presencia de cobre, magnesio, hierro y zinc.

- Catalasa (CAT); su reacción: conversión de H202 en H20 y 0 2, esta

enzima presente en la peroxisomas remueve el peróxido de hidrogeno.

- Glutatión peroxidasa (GPX); su reacción: reducción de hidroperoxidos

a expensas de Glutationa reducida (GSH), esta enzima intracelular
contiene selenio.

- Glutatión reductasa; su reacción: reducción a Glutationa oxidada

(GSSG) a Gluglationa reducida (GSH), este último necesario para la
 reacción catalizada por la glutatión peroxidasa requiere NADPH, el cual
es proporcionado por la vía de las pentosas fosfato.

2.4.1.2 Antioxidante no Enzimático

Transforman los radicales en sustancias menos agresivas. Los

antioxidantes exógenos, son los que se ingieren con la dieta encontrándose en
diversos alimentos como las frutas y verduras (ALIMENTACIÓN, 2022).

Principales antioxidantes exógenos y tipo de radical que neutralizan:

- Vitamina C; Antioxidante del plasma hidrosoluble, es un poderoso

inhibidor de la oxidación de lípidos, regenera la vitamina E y es protector
de los efectos del tabaco. Actúa específicamente con el radical
superóxido aniónico y el radical hidroxilo.

- Vitamina E; Principal antioxidante soluble de lípidos, previene la

oxidación de grasas. Aumenta su acción en presencia de zinc. Actúa
específicamente con el oxígeno singulete y el radical ácido graso
poliinsaturado.

- Vitamina A; La vitamina A, se puede encontrar en la naturaleza en

diferentes formas activas (retinol, retinal , acido retinoico o
dehidrorretinol) .la conversión de caroteno a retino! está influida por la
concentración de retinol sérico , zinc y yodo, este último es necesario
para la conversión de fJ -caroteno en vitamina A en humanos.

2.5 Polifenoles

Constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, considerados

metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes estructuras químicas y
actividad, englobando más de 8000 compuestos distintos (MARTINEZ, 2000).

Son un conjunto heterogéneo de moléculas, que comparten la

característica de poseer en su estructura varios grupos bencénicos sustituidos
por funciones hidroxílicas.
 Se originan principalmente a través de dos rutas biosintéticas: la ruta del
ácido shikímico y la ruta de los poliacetatos . En la ruta del ácido shikímico se
utilizan aminoácidos aromáticos como fenilalanina y tirosina para formar los
ácidos cinámicos y sus derivados (fenoles sencillos, ácidos fenólicos y
derivados, cumarinas, lignanos y derivados del fenilpropano). Por medio de la
ruta de los poliacetatos se originan quinonas, xantonas, orcinoles, etc, aunque
algunos compuestos fenólicos como los flavonoides (antocianidinas,
catequinas, ácido gálico e isoflavonas) se pueden formar a través de rutas
mixtas que combinan la vía del shikimato y del acetato (SOTO M. , 2013).

Su función principal en las plantas es de actuar como metabolitos

esenciales frente al ataque de agentes patógenos, incluyendo bacterias, fungi y
virus, así como metabolitos esenciales para el crecimiento y reproducción de
estas.

2.6 Ácido Ascórbico

Es un compuesto altamente polar, por lo tanto, altamente soluble en

agua, e insoluble en solventes no-polares. La vitamina C, actúa como agente
reductor en reacciones de hidroxilación o reacciones de oxido-reducción (son
reacciones donde ocurre transferencia de electrones entre especies,
permitiendo la oxidación de una especie y llevando la otra especie a ser
reducida). Es considerada como el agente reductor más reactivo que puede,
ocurrir en forma natural en el tejido viviente, también es considerada como
nutriente esencial para el ser humano, ya que éste no puede sintetizarlo por si
sólo

A diferencia de la mayoría de los mamíferos, los seres humanos no

poseen la habilidad de sintetizar su propia vitamina C. Esta vitamina debe ser
obtenida a través de la dieta, ya que es considerada como un nutriente esencial
en el sistema humano; esto debido a sus importantes roles en el
funcionamiento de este sistema. Dentro de los roles que posee, se encuentra la
síntesis de colágeno (componente estructural importante en los vasos
sanguíneos, tendones, ligamentos y huesos). También juega un rol importante
en la síntesis de norepinefrina (crítico neurotransmisor para la función
cerebral). Además, la vitamina e se requiere para la síntesis de carnitina
(pequeña molécula esencial en el transporte de grasas a los organelos
celulares llamados mitocondrias), para la conversión de energía (FAO, 2010).

2.7 Radical1'1 diphenyl -2- picrylhidrazyl (DPPH0 )

El DPPH0 es un reactivo muy usual para investigar la actividad de

inhibición de radicales libres de los polifenoles (YILDIRIM, 2001). El mecanismo
de reacción consiste en sustraer un átomo de hidrogeno de un fenol donador
para dar diphenylpicryhidrazyl y un radical fenoxil.

La reacción involucra un cambio de color de violeta a amarillo que

fácilmente puede ser monitoreada la reducción de la absorbancia medida a 515
nm del radical DPPH", por antioxidantes. (BRAND- WILLIAMS et al., 1995). El
radical fenoxil puede sufrir posteriores reacciones tales como el acoplamiento y
fragmentación, que resultan en productos complejos y que modifica la reacción
valores del coeficiente de inhibición del 50% del radical IC50 por la alteración
de la estequiometría.

2.8. Radical 2'2 azinobis -3- ethylbenzotiazolina -6- acido sulfónico (ABTS0 +)

El ABTS (verde - azul como catión ABTS0+), es un radical cromógeno

estable, fácil de usar, tiene un elevado nivel de sensibilidad y permite analizar
un gran número de muestras en tiempo relativamente corto (KIM et al., 2002).
ARNOA (2000), menciona que la química de reacción del ABTS0+ en las
pruebas, involucra una disminución en la intensidad del color del ABTS0+ de
verde - azul a blanco - transparente, por efecto de la inhibición del antioxidante.

2.9. Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

Es la técnica de separación más ampliamente utilizada en separaciones

analíticas, que permite aislar, identificar y cuantificar los compuestos
desconocidos tales como vitaminas, proteínas y compuestos activos como
flavonoides, alcaloides y esteroles en una muestra o solución conocida.
(HORIE y KOHATA 2000).

En alimentos es utilizado como un método confirmatorio para la

determinación de aditivos contaminantes y compuestos naturales (BOSANOVA
y BRANDSTETEROVA, 2000). Para la cuantificación de estos compuestos se
utiliza estándares específicos para cada uno de ellos (HORIE y KOHATA
2000).

La técnica HPLC describe el proceso en el cual la fase móvil (líquido) es

mecánicamente bombeado a través de una columna que contiene la fase
estacionaria (sólido) y la cuantificación de los analitos se realiza mediante un
detector (NIELSEN, 1998).

Según NIELSEN, 1998 el sistema HPLC consta de las siguientes partes:

- Una bomba que consta de dispositivos de alta tecnología que tiene por
función de entregar la fase móvil a través del sistema, a un flujo variado
(0, 1 a 10 mUmin.) en cantidades exactas y de manera precisa,
compuesto por dispositivos resistentes a la corrosión ountas de acero
inoxidable o teflón).

- Un sistema de inyección, el fin del proceso de inyección es introducir la

muestra en un reservorio sujeto a la acción de la bomba para luego ser
llevado a la columna.

- La columna es considerada como una herramienta para la separación de

las moléculas presentes en la muestra que está siendo analizada.

- Una precolumna para aumentar la vida de la columna analítica .Se

coloca delante de la columna para eliminar la materia de suspensión y
los contaminantes de los disolventes.

- El detector por lo general es ultravioleta (UV) o visible (VIS), es el

instrumento que detecta la presencia de las moléculas motivo de
análisis. Una vez que la muestra sale de la columna es presentada al
detector que identifica en función a la absorbancia la cantidad presente
de un determinado analito; luego el detector convierte esta interacción
en señal electrónica que es enviada al sistema de datos. La magnitud de
esta señal es graficada contra el tiempo.
 III. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

 Cuantificar el contenido de ácido ascórbico por HPLC en la pulpa fresca

y concentrada de Taperibá.

3.2 Objetivo Específico

 Evaluar las Características fisicoquímicas de la pulpa fresca de

Taperibá.
 Cuantificar el contenido de polifenoles totales en pulpa fresca y
concentrada de Taperibá.
 Determinar la capacidad antioxidante de la pulpa fresca y concentrada
de Taperibá medido por su capacidad de inhibir radicales libre 1,1
diphenil - 2- picrylhidrazil (DPPH) y por la prueba de ABTS.
 IV. HIPÓTESIS

H0= La cuantificación del contenido de ácido ascórbico por HPLC en la pulpa

fresca de taperibá es igual a la pulpa concentrada de taperibá.

Ha= La cuantificación del contenido de ácido ascórbico por HPLC en la pulpa

fresca de taperibá no es igual a la pulpa concentrada de taperibá.
 V. MATERIALES Y METODOS

5.1 Lugar de ejecución

El presente estudio se llevará a cabo en el Laboratorio Central de

Investigación, ubicado en el campus de la Universidad Nacional Agraria de la
Selva; políticamente ubicada en el distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio
Prado, región Huánuco, y geográficamente con coordenadas de altitud de 660
msnm., 09º 17' 08” de Latitud sur, 75º 59' 52” de latitud oeste. Las condiciones
climáticas de la zona de acuerdo a la Estación Meteorológica de Eduardo
Quiñonez son: temperatura máxima 30.05 ºC, mínima 20.7 ºC, y media 25.6 ºC,
precipitación promedio de 3758 mm, la humedad relativa 84%. De acuerdo a la
clasificación de las zonas de vida y el diagrama bioclimático de HOLDRIDGE
(1987) el distrito de Rupa Rupa se encuentra ubicada en la formación vegetal
de bosque muy húmedo Pre montano Tropical (bmh - PT). De acuerdo a las
regiones naturales del Perú, PULGAR (1938) menciona que Tingo María se
encuentra en la selva alta o Rupa Rupa.

5.2 Materia prima

Fruto de Taperibá (Spondias cytherea Sonn), obtenido de un lote de

cultivo de Taperibá ubicado en la zona de Aguaytía, se recepcionó la cantidad
necesaria para las pruebas y almacenó descartando las dañadas, las verdes y
sobremaduras. Se colocó en bolsas de 1 Kg para posteriormente realizar el
proceso de pulpeado.

5.3 Materiales
  Matraces de 100 y 250 mi
 Vasos de precipitación de 50 mi
 Pipetas de 5 y 10 mi
 Micropipetas de 1 0-1 00 ul y 1 00-1 000 ul
 Cubetas de poliestireno (1 cmx 1cm x 4,5 cm)
 Fiolas de 1 O, 25 y 50 mi
 Papel filtro
 Agua blanda
 Puntas para micropipeta
 Gradilla
 Microtubos
 Microjeringas (50 ~L)
 Microfiltros de membrana de nylon, de 0,2 ~m marca Gelman

5.4 Reactivos y soluciones

2,2 diphenyl-1-picrilhydrazyl (OPPH; Sig,ma Aldrich, USA), 2,2- azinobis

(3-etilbenzotiazolino-6- ácido sulfónico) (ABTS; Sigma Aldrich, USA),
Carbonato de sodio (Na2C03). Ácido ascórbico (Scharlau, UE), fosfato de
potasio dihidrogenado (Scharlau, UE), acido orthofosfórico (Scharlau, UE),
ácido sulfúrico (Merck KgaA), metanol grado HPLC (Fisher ChemAiert Guide),
(+)- catequin 1 Mm (Sigma Aldrich, USA), etanol (Merck KgaA), Solución de
fenol de Folin- Ciocalteu (Sigma Aldrich, USA), Carbonato de sodio (Scharlau,
EU).

5.5 Equipos

 Equipo de Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), marca Shimatzu

Scientific, MD, USA; las características de la bomba, horno de columna;
detector, controlador fueron de los siguientes modelos: LC-10ATVP,
PHENOMENEX GEMINI/C-18/110A/5um/ 250 X 46,0 MM, CTO - 10 AS VP,
UV-VIS SPD-10AWP, SCL-10AVP respectivamente. El inyector manual
Reodine de una capacidad de 20 ul.

 Balanza analítica marca Sartorius (USA) con una sensibilidad de 0,0001 g.

  Espectrofotómetro de absorción molecular marca Termo Electrón Corporation,
modelo genesys-6.
 pHmetro
 Pulpeadora o majador marca KAMPLEX tipo Ep-9 con juego.
 Desionizador de agua marca Easy Pure 11 RF/UV.
 Baño María Modelo YCW-OLOE GEMMYCO.
 Rotavapor Modelo R-300.
 Vortex marca Genie 2 Scientific Industries.
 Centrifuga

VI. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

6.1 Obtención de pulpa concentrada de Taperibá

Para la obtención de la pulpa concentrada de Taperibá, se procedió con las

operaciones indicadas:

- Recepción: Los frutos de Taperibá se recepcionarón en jabas de

polietileno para evitar daño durante el transporte de la zona de Aguaytía
a la ciudad de Tinge María.
- Selección: En esta operación se eliminaran las frutas en mal estado o
sobre maduras. Sólo se trabajó con frutas en estado maduro.

- Pesado: Se utilizará aproximadamente 6300 Kg de Taperibá, de los

cuales durante el proceso se separará para la pulpa fresca y pulpa
concentrada.

- Lavado: Los frutos serán lavados con agua blanda con el fin de eliminar
las impurezas adheridas a la fruta.

- Pelado: Se realizará de forma manual, debido a que este fruto presenta

una corteza semi-rugosa.

- Pulpeado: Una vez pelados los frutos, se procedera al pulpeado, para

esta operación se utilizará un tamiz fino de 1 mm de luz. Los frutos serán
ligeramente trozados, para que la operación sea más eficiente, por
medio del tamiz se separarán las semillas y partes leñosas. Parte de
 esta pulpa fresca se separará, se envasó en bolsas de polietileno
forradas de papel aluminio y se almacenara a T0 de congelación (-20
°C).

- Tamizado: Una vez pulpeado, la pulpa pasara por una operación de

tamizado, esto con la finalidad de refinarla más.

- Concentrado: Se procederá a concentrar la pulpa refinada empleando

el rotavapor al cual se adaptará una bomba de vacío, se añadirá 200 g
de pulpa al balón, este balón está inclinado en un ángulo de 30-35°
aproximadamente, el cual rotará para homogenizar la muestra y ayudar
a la transferencia de calor. Se eliminará hasta un 40% de agua a una
temperatura de 50°C y una presión de vacío de 24 pulg-Hg según la
lectura del vacuómetro.

- Envasado: La pulpa concentrada será envasa en bolsas de polietileno,

que serán selladas con selladora manual y cubiertas con papel aluminio.

- Almacenado: La pulpa fresca y concentrada protegida de la luz con

papel aluminio se almacenó a temperatura de congelación de -20°C.

6.2 Cuantificación de ácido ascórbico de la, pulpa fresca y concentrada de

Taperibá

6.2.1 Determinación de la curva patrón

El HPLC, se utilizará como fase móvil una solución a 0,2 M de KH2P04

ajustado a un pH de 2,4 con H3P04 y a una tasa de flujo de 0,5 mllmin. La
medición será a una longitud de onda de 254 nm. Se calibrará, preparando una
curva estándar de ácido ascórbico (AA), el estándar se disolverá en H20
destilada desionizada (dd) microfiltrada. Se preparará un stock de 100 uglml,
disolviendo 1 O mg de AA en 100 mi de agua dd y microfiltrada. A partir del
stock se preparará soluciones de concentraciones 1 O, 20, 30, 40, 50 pglml que
seran usados para levantar la curva estándar. Después de la inyección de cada
concentración del estándar, se registrará con exactitud y precisión el tiempo de
retención (tR), mili absorbancia (mUA) y el área debajo la curva (Ac).
 6.2.2 Cuantificación de ácido ascórbico

Las muestras de pulpa fresca y concentrada de Taperibá, serán

separadas en alícuotas de 1,5 mi en microtubos de 1 ,5 ó 2 mi, que serán
centrifugadas a 1 O 000 rpml5 m in a una temperatura de 4°C, luego de que
hayan sido centrifugada se separará el sobrenadante y se microfiltró con
membranas de Nylon de 0,2 J,Jm para inyectarse al HPLC.

Con la ecuación que se obtendrá en la curva, al graficar mUA vs.

Concentración (J,Jglml), se estimara la cantidad de ácido ascórbico en mgAAI1
OOg de pulpa fresca y concentrada.

6.3 Cuantificación de polifenoles totales en pulpa fresca y concentrada de

Taperibá

6.3.1 Determinación de la curva patrón

Se preparará las soluciones stocks de 20 por ciento Na2C03 y 10mM -

catequin en 10 mi de metanol. A partir del stock catequina, se preparará
concentraciones de 300, 1000, 3000 y 10000 f.Jg/ml. (Anexo 1). A cada tubo se
le agregará 1 ,58 ml de agua destilada desionizada (H20 dd) y 20 µI de cada
estándar de catequina. Se homogenizará y se agregará 100 µI de solución
Folin-Ciocalteu. Se volverá a homogenizar y se incubará por 1 min a
temperatura ambiente, se neutralizará la reacción adicionando 300 µI de
Na2C03 al 20 por ciento y se incubará por 2 horas a temperatura ambiente
para su completa reacción. Las lecturas en el espectro UV-VIS se realizarán a
700 nm. Con las lecturas de las absorbancias versus concentración se
construirá la curva patrón.

6.3.2 Cuantificación de polifenoles

Se siguirá la metodología utilizada para levantamiento de la curva

patron. En cuanto a las muestras se realizarán las diluciones necesarias con el
objetivo de que la absorbancia se ubique en el rango de la curva estándar.
 Las absorbancias que se registraran de la pulpa fresca y concentrada de
Taperibá, se reemplazarán en la ecuación de la curva estándar, obteniendo la
cantidad de polifenoles expresados en mgCAT/g.

6.4 Determinación de la actividad antioxidante de la pulpa fresca y

concentrada de Taperibá.

6.4.1 Radical 2,2-diphenyl-picrilhydrazyl (DPPH)

Esta prueba se fundamenta en la reducción del radical DPPH mediante

un donador de hidrógeno que procedería de los tipos de extractos evaluados.
Se hará reaccionar 975 ul del radical DPPH con 25 ul de la muestra analizada
en el espectrofotómetro a una absorbancia máxima de 515 nm, el cambio de
coloración de azul a amarillo es un indicativo de la completa reducción del
radical DPPH (POMA, 2015).

Las muestras de pulpa fresca y concentrada de Taperibá serán

separadas en microtubos de 2ml, centrifugadas a 10000 rpm/5min, separado el
sobrenadante en microtubos y vueltos a centrifugar a 1 0000 rpm/5min. Con
este sobrenadante se preparararán las soluciones de trabajo a concentraciones
de 1,2; 4; 12; 40 mg/mL para la pulpa fresca de Taperibá y 0,4; 1 ,2; 4; 12
mg/ml de pulpa concentrada de Taperibá.

A partir de estas concentraciones se tomará 25µL y se hará reaccionar

con 975 µL con radical DPPH (100 µM). El radical DPPH iniciará una
decoloración de violeta a amarillo inmediatamente después de reaccionar con
la muestra, se dará lectura de la absorbancia a 515 nm cada 15 s por 5 min.

El porcentaje de inhibición se obtendrá al restar la unidad menos el dato

final de la corrida de una concentración, todo esto estará dividido con el
promedio de las lecturas de la solución patrón en este caso el DPPH y así cada
una de las concentraciones de las muestras de pulpa fresca y concentrada de
Taperibá, será utilizado para determinar el coeficiente de inhibición (IC 50) para
el radical DPPH. Este coeficiente indicará la cantidad de pulpa fresca y
concentrada de Taperibá en µg/ml, requerido para inhibir el 50% del radical
libre DPPH.
 6.4.2 Catión 2,2 azinobis (3-benzotiazolino-6-ácido sulfónico)
(ABTS)

El radical ABTS0+ se obtendrá tras la reacción de ABTS (7mM) con

persulfato potásico (2,45 mM, concentración final) incubados a temperatura
ambiente (25 °C) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical
ABTS0 , se diluirá con etanol hasta obtener un valor de absorbancia
comprendido entre 0,70 (± O, 1) a 734 nm (longitud de onda de máxima
absorción). Las muestras filtradas se diluirán con etanol hasta que se produce
una inhibición del 20 al 80 por ciento, ,en comparación con la absorbancia del
blanco, tras añadir 20uL de la muestra. 980 uL de dilución del radical ABTS 0.

Para la preparación de la muestra se separarán en microtubos 2ml de

pulpa fresca y concentrada de Taperibá, se centrifugará a 10000 rpm/5min, se
separará el sobrenadante en microtubos y se volverá a centrifugar a 10000
pm/5min, y del sobrenadante se preparará la soluciones de trabajo para la
pulpa fresca 1 ,5; 5; 15; 50 mg/mL y para la pulpa concentrada: O, 15; 0,5.;
1 ,5; 5 mg/ml. Se procederá a reaccionar 20 µL de cada una de las
concentraciones con 980 µL ABTS ·+, hasta que se obtuvo 20-80% de inhibición.
Los resultados serán expresados en términos de Cl 50 en µg/mL.

VII. DISEÑO EXPERIMENTAL

Pulpa fresca y concentrada de Taperibá

Preparación de la pulpa fresca y concentrada a

diferentes concentraciones c1, c2, c3 y c4

Reacción de DPPH y Reacción con

ABTS

R1 R2 R3
Donde: C1,C2, C3 y C4= concentraciones (ug/ml)
R1, R2, R3 = son las repeticiones
Figura 2: Secuencia experimental para evaluar la actividad antioxidante de la
pulpa fresca y concentrada de Taperibá por el método del radical DPPH y por
el método del radical ABTS.

VIII. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

8.1 Obtenidos los datos, estos se sometieran a diversas pruebas estadísticas

de carácter descriptivo e inferencial, para luego probar las hipótesis planteadas
en el estudio. Para el análisis de los datos se realizaron un análisis de varianza
(ANOVA). Luego se realizó la prueba de TUKEY al 5% para establecer la
diferencia significativa. En el análisis de varianza (ANOVA) para el diseño de
bloques completamente al azar (DBCA) se siguió el modelo aditivo lineal que
se muestra.

Modelo estadístico lineal

Yij=μ+ti+βj+εij

Donde:

Yij=cualquier observación (activación antioxidante)

 μ = media poblacional

ti = efecto del i - esimo tratamiento (porcentajes)

βj = efecto de j - esimo panelista sobre la unidad experimental

εij = error experimental

i = 1, 2,…….t, donde t = número de tratamiento (porcentaje)

j = 1, 2,…….r, donde r = número de panelistas (bloques)

Al apreciar el ANOVA, se encuentra F calculada; que nos da a entender posible

significancia entre tratamientos y la siguiente posible significancia entre
bloques, a continuación, defino la siguiente hipótesis:

Ho: τj= 0

Ha: τj≠ 0

IX. CRONOGRAMA

Cuadro 1 cronograma de actividades

Actividades
Dic-01

Ene-10

Ene-30

Feb-22
Nov-22

Feb-12

Abr-01
Dic-30
Nov-30

Dic-15

Ene-20

Coordinación X
Elaboración del proyecto X
Preliminares X X
Recopilación de
información X X X X X X X X X X X
Muestra X
Fase de análisis X X X
Desarrollo X X X X X X X X
Procesamiento de datos X X
Resultados X X
 X. PRESUPUESTO

Costos totales del proyecto de investigación

Compra de bienes

Alimentos y bebidas
S/300.00
Suministros para uso agropecuario

Alimentos y bebidas para consumo humano

Vestuario, accesorios y prendas diversas

S/100.00
Materiales y útiles de oficina

Pasajes y gastos de transporte

Internet S/150.00

Electricidad
 Suministros médicos
S/100.00
Productos farmacéuticos

Alquiler de muebles e inmuebles

S/300.00
De maquinarias y equipos

Alquiler de equipos y materiales

TOTAL S/950.00

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