UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA DE

ALIMENTOS

TINGO MARIA

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL

Pseudelephantopus spicatus Y SU APLICACIÓN EN UN
PRODUCTO ATOMIZADO PARA FILTRANTES

Tesis
Para optar el título de:

INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

VELA ROMERO, JOHAN GILBERTO

PROMOCIÓN 2007 .. 11

Tingo Mana- Perú

2010
F60
V38
Vela Romero, Johan G.

Determinación de la Capacidad Antioxidante del Pseudelephantopus spicatus

y su Aplicación en un Producto Atomizado para Filtrantes. Tingo María 201 O

84 h.; 14 cuadros; 15 fgrs.; 50 ref.; 30 cm.

Tesis ( Ing. Industrias Alimentarias) Universidad Nacional Agraria de la
Selva, Tingo María (Perú ). Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias.

PSEUDELEPHANTOPUS SPICATUS /. ANALISIS SENSORIAL 1 CAPACIDAD

ANTIOXIDANTE 1 PROCESO- ATOMIZACIÓN 1 POLIFENOLES TOTALES 1

TINGO MARIA 1 RUPA RUPA 1 LEONCIO PRADO 1 HUANUCO 1 PERU.

 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
Tingo María
FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
Av. Universitaria sin. Teléfono (062) 561385- Fax (062) 561156
Apart. Postal 156 Tingo María E.mail; fia@unas.edu.pe

ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS

Los Miembros del Jurado que suscriben, reunidos en acto público el 1O de Marzo
de 2009, a horas 6:00 p.m. en la Sala de Audiovisuales de la Facultad de
Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria de la
Selva, ubicada en la ciudad de Tinge María, Provincia de leoncio Prado,
Departamento de Huánuco, para calificar la tesis presentado por el Bach. VELA
ROMERO, Johan Gilberto, titulado:

"DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL

Pseudelephantopus spicatus Y SU APLICACIÓN EN UN
PRODUCTO ATOMIZADO PARA FILTRANTES"

Después de haber escuchado la sustentación, las respuestas a las preguntas

formuladas, Jo declaran aprobado con el calificativo de EXCELENTE, en
consecuencia el Bachiller, queda apto para recibir el título de Ingeniero en
Industrias Alimentarias del Consejo Universitario, de conformidad con el Art. 22°
de la Ley Universitaria 23733; los artículos 51° y 52° del Estatuto Actualizado de la
Universidad Nacional Agraria de la Selva.

Tinge María, 1O de Marzo de 2009

. . . . :td:. . . . . .
lng. M.Sc. Pedro A. Vejarano Jara
Presidente

W. Vargas Solórzano
Asesor
 DEDICATORIA

A Dios, por darme la vida y acompañarme

en mi caminar para alcanzar muchas

metas y privilegios.

A mis padres, Winer y Neyba por su amor,

apoyo y comprensión en todo momento

para seguir adelante.

A mis hermanos, Paola y Renato,

y a toda mi familia por creer en mi y

por brindarme su apoyo y cariño.

A mi tía, Georgia por todo su amor, apoyo

incondicional y consejos que siempre me
brindó.

A Jessica, este amor sincero por ti,

se convirtió en una fuerza vencedora,

que pudo superar todos los obstáculos.

 AGRADECIMIENTO

- Al lng. Jhony William Vargas Solórzano, asesor de mi tesis, por su valiosa

colaboración y orientación desinteresada que hizo posible la culminación del

presente trabajo de investigación.

- A la UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA, por formarme como

un buen profesional.

- Al Ph.D. Manuel Sandoval Chacón, por su asesoramiento, consejos, apoyo y la

confianza que depósito en mi en todo momento para la culminación del

presente trabajo de investigación.

- A los Docentes de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias, por

todos los conocimientos brindados, quienes contribuyeron en mi formación

profesional.

- A mis compañeros Helmut Calvay, Joel Sullón, Wilfredo Tello, Marlen Félix,

David Hidalgo, Manuel Marinas, Marco Usquiano y Palomo, por brindarme su

apoyo y motivación siempre y por todos tos buenos momentos compartidos.

- A mi papá Gilberto y mamá Anita, por todo su apoyo incondicional que siempre

me brindaron en los momentos más difíciles.

- A todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron en la

culminación del presente trabajo de investigación.

 IN DICE

l. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 1

11. REVISIÓN DE LITERATURA. .......................................................................3

2.1. Aspecto general del Pseudelephantopus spicatus ..................................... 3

2.1.1 Taxonomía de la especie ............................................................... 3

2.1.2 Características fisiológicas de la planta ............................................ .4

2.1.3 Antecedentes ..............................................................................5

2.2 Radicales libres .....................................................................................6

2.2.1 Oxidación y producción de radicales libres .........................................6

2.3 Estrés oxidativo ................................................................................... 14

2.3.1 Efectos al nivel fisiológico de la célula ............................................ 15

2.4 Antioxidantes ........................................................................................15

2.4.1 Tipos de antioxidantes ................................................................. 17

2.5 Polifenoles ........................................................................................... 18

2.5.1 Flavonoides ...............................................................................21

2.6 Proceso de atomización ........................................................................22

2.6.1 Descripción ................................................................................23

111. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................25

3.1 Lugar de ejecución ..............................................................................25

3.2 Materia prima ......................................................................................25

3.3 Materiales ..........................................................................................26

 3.3.1 Materiales de laboratorio ..............................................................26

3.3.2 Equipos de laboratorio ................................................................26

3.3.3 Reactivos y soluciones ................................................................27

3.4 Métodos de análisis ............................................................................28

3.4.1 Determinación de la capacidad antioxidante ................................... 28

3.4.2 Atomizado de la muestra ...........................................................29

3.4.3 Determinación del Contenido de Polifenoles Totales ....................... 29

3.4.4 Cuantificación de Catequina mediante HPLC ................................. 29

3.5 Metodología experimental. .................................................................31

3.5.1 Micropulverización del Pseudelephantopus spicatus ..................... 32

3.5.2 Preparación de los extractos ...................................................... 34

3.5.3 Determinación de la Capacidad Antioxidante ................................. 35

3.5.4 Atomización de la muestra ....................................................... .40

3.5.5 Prueba de Polifenoles Totales .................................................. .43

3.5.6 Cuantificación de Catequina mediante HPLC ................................ 45

3.5. 7 Análisis sensorial. .................................................................. .48

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................50

4.1 Radical DPPH ................................................................................. 50

4.1.1 Capacidad antioxidante de acuerdo a la fisiología de la planta .......... 50

4.1.2 Capacidad Antioxidante con respecto a los tratamientos .................. 52

4.2 Radical peróxilo .................. , ............................................................ 55

4.3 Extracto atomizado ...........................................................................59

4.4 Contenido de polifenoles totales ...........................................................61

 4.5 Cuantificación de catequina mediante HPLC ........................................... 64

4.6 Análisis Sensorial. ............................................................................. 67

4.6.1 Atributo Sabor. ........................................................................67

4.6.2 Atributo olor ............................................................................68

4.6.3 Atributo color ...................... ; ....................................................69

V. CONCLUSIONES ....................................................................................70

VI. RECOMENDACIONES .............................................................................72

VIl. ABSTRACT ...........................................................................................73

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................75

ANEXOS ....................................................................................................84
 INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1. Clasificación de polifenoles totales ............................................................... 20

2. Cantidades indicadas para la reacción entre la solución intermedia y del radical

DPPH con respecto a las concentraciones finales ........................................... 36

3. Cantidades indicadas para la reacción entre la solución intermedia y el radical

peróxilo en las concentraciones finales .........................................................37

4. Cantidad de volúmenes adicionados para la obtención de cada una de las

concentraciones ..................................................................................... 46

5. Capacidad de Inhibición expresado en IC50 (ug/ml) de los extractos acuosos y

etanólicos frente al radical DPPH ................................................................50

6. Capacidad Antioxidante de los respectivos tratamientos expresado en IC 50 (ug/ml)

frente al radical DPPH .............................................................................52

7. Capacidad de Inhibición expresado en IC50 (ug/ml) de los extractos acuosos y

etanólicos frente al radical peróxilo .............................................................55

8. Capacidad Antioxidante de los diferentes tratamientos expresado en ICso ug/ml

frente al radical peróxilo ............................................................................57

9. Capacidad antioxidante de la muestra atomizada expresada en IC50 .................. 59

1O. Contenido de Polifenoles de la muestra atomizado .......................................61

11. Contenido de catequina de la muestra atomizada ........................................ 64

12. Resultados del análisis estadístico con respecto al atributo sabor. .................. 67
13. Resultados de los análisis estadísticas con respecto al atributo olor. ................. 68

14. Resultados de los análisis estadísticas con respecto al atributo color ................ 69
 INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1. Hábitat natural del Pseudelephantopus spicatus ... .......................................... 4

2. Radical DPPH .................................................. ·....................................... 10

3. Estructuras mayoritarias de flavonoides ....................................................... 22

4. Metodología experimental a seguir para la obtención del producto atomizado

y sus adicionales pruebas antioxidantes y sensoriales ..................................... 31

5. Operaciones seguidas para la obtención del producto micropulverizado .............. 33

6. Diseño experimental para determinación del coeficiente de inhibición IC 50 (ug/ml)

de las muestras en estudio ........................................................................ 39

7. Flujograma para la obtención del producto atomizado .....................................41

8. Esquema de un atomizador en ca-corriente ..................................................42

9. Flujograma para la obtención del contenido de polifenoles totales de la muestra

atomizada ..............................................................................................44

10. Imagen de las partes que componen el sistemaHPLC ................................... 47

11. Diseño experimental para la prueba de análisis sensorial.. ............................ .49

12. Eficacia de los extractos frente al radical DPPH ............................................ 50

13. Eficacia de los extractos frente al radical peróxilo .......................................... 56

14. Cromatograma de la muestra estándar de Catequina .....................................66

15. Cromatograma de la muestra atomizada analizada ........................................66

 RESUMEN

El presente trabajo de investigación se desarrolló en el Centro de Investigación

de Productos Naturales de la Amazonía (CIPNA)- UNAS. Los objetivos fueron:

Determinar la capacidad antioxidante en la raíz, hoja, tallo y parte aérea frente

a los radicales DPPH y peróxilo mediante extracción acuosa y etanólica (50%);

determinar el solvente con comportamiento más activo; realizar un proceso de

atomización al órgano de la planta con mayor capacidad antioxidante;

determinar el IC50 (ug/ml) del producto atomizado; evaluar el contenido de

polifenoles totales y cuantificación de catequina en el atomizado y realizar el

análisis sensorial. La materia prima utilizada fueron plantas de

Pseudoelephantopus spicatus. Los resultados se expresaron como la media ±

SEM, para el análisis estadístico se empleó el diseño bloque completo al azar

(DBCA) con arreglo factorial y la prueba de Tukey (p<0,05). La capacidad

antioxidante de la raíz, hoja, tallo y parte aerea mediante extracción acuosa

frente al radical DPPH fue (276.271±0.564, 207.131±0.574, 400.131±0.574,

413.687±1.698 ug/ml) y al peróxilo (46.920±0.390, 251.599±1.076,

32.370±0.705, 357.149±0.734 ug/ml); la capacidad antioxidante mediante

extracción etanólica (50%) frente al radical DPPH resultó (378.112±0.516,

418.654±1.950, 398.977±0.449, 124.246±1.260 ug/ml) y al peróxilo

(37.209±0.069, 104.322±1.710, 25.43±1.398, 39.17±0.833); el extracto

etanólico (50%) fue el más activo; se realizó atomizado a la parte aérea; el

valor ICso del producto atomizado (10, 13±0.30 ug/ml); el contenido de

polifenoles totales (68.08 mg eqCat/g); la cuantificación de catequina

(6.34±1.034 mg cat/g); en el análisis sensorial, las pruebas del atributo sabor

presento diferencia significativa mas no el color y olor.

 l. INTRODUCCIÓN

El estrés oxidativo generado mayormente por la contaminación

ambiental, la disminución de la capa de ozono, el ritmo de vida apresurada y

los malos hábitos alimentarios: exceso de comida chatarra, consumo de licor y

cigarrillos se ha acrecentado enormemente en estos tiempos haciendo a las

personas más proclives a sufrir enfermedades debido a que este estrés

oxidativo ocasiona un desbalance entre los antioxidantes endógenos y

radicales libres presentes en nuestros organismo. En el mismo sentido se ha

descubierto que el uso de antioxidantes sintéticos a la larga tiene efectos

nocivos para la salud lo que llevó un interés mayor por la búsqueda de

antioxidantes de origen natural.

El Pseudelephantopus spicatus mejor conocido como mata pasto,

oreja de chancho, lechugilla o lengua de perro es una maleza muy conocida en

la Amazonia peruana especialmente por su carácter invasivo. La medicina

tradicional casera en su mayoría la utiliza para aliviar los dolores asociados al

riñón siendo ingerida en forma de decocto (bebida tipo té) aunque estudios

recientes reportan actividad antiinflamatoria, antihemorragica y antibacteriana.

Paralelamente a esto no existen registros sobre un posterior

procesamiento de esta planta de manera que se pueda dar un valor agregado y

 2

venderlo como un producto nutracéutico y de esta manera influya directamente

en aliviar el estrés oxidativo y la socioeconomía de los habitantes de la zona.

En base a estos antecedentes se sugirió determinar la capacidad

antioxidante de esta planta teniendo como objetivos específicos:

Determinar la capacidad antioxidante expresado en IC 50 ug/ml de la raíz,

hoja, tallo y parte aerea frente a los radicales DPPH (1, 1diphenyl-2-

picrylhydrazyl) y peróxilo mediante extracción acuosa y etanólica al

50%.

Determinar el solvente con comportamiento más activo.

Realizar un proceso de atomización al órgano de la planta que reporte

mayor capacidad antioxidante.

Determinar eiiC5o (ug/ml) del producto atomizado.

Evaluar el contenido de polifenoles totales y cuantificación de catequina

en el producto atomizado.

Realizar el respectivo análisis sensorial a los atributos del sabor, color y

olor al producto atomizado en forma de filtrante.

 11. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Aspecto general del Pseudelephantopus spicatus

2.1.1. Taxonomía de la especie

Según el USDA (2007) lo clasifica de la siguiente manera:

Reino Plantae

Subreino Traqueobionta

Superdivisión Sphermatophyta

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Subclase Asteridae

Orden Astera les

Familia Astera cea

Género Pseudelephantopus Rohr

Especie Pseudelephantopus spicatus (Jux, ex

Aubl.) C. F Baker

Nombre vulgar mata pasto, lechuguilla, lengua de

perro, oreja de Chancho.

 4

2.1.2. Características fisiológicas de la planta

Esta planta es una hierba perenne, estolonifera, erecta, de hasta

80 cm de alto. Con tallos ramificados, velludos y foliosos hasta la

inflorescencia. Hojas alternas, obovadas, atenuadas en la base en un pecfolo

ensanchado y envainador, velludas en ambas cara, de 7-1 O cm de largo por 3-

4 cm de ancho. La planta es originaria de América Tropical distribuida desde El

Caribe hasta el norte de Argentina. Prefiere suelos bajos húmedos y sombrfos,

también forma parte de la flora invasora de los cultivos del Oriente peruano

(SAGASTEGUI y LEIVA, 1993).

Figura 1. Hábitat natural del Pseudelephantopus

spicatus.
 5

2.1.3. Antecedentes

El extracto etanólico de toda la planta del Pseudelephantopus spicatus

presentó una moderada capacidad antihemorrágica frente al veneno

Bothrops atrox venom en el noreste de Colombia (OTERO et al., 2001).

El Pseudoelephantopus spicatus es un esencial componente del Theng-

Khia-U que es una medicina casera que se usa contra el edema, fiebre y

neumonía. Además cita a partir del extracto metanólico de la parte aérea

de esta planta se aislaron dos nuevos sesquieterpenos lactones:

spicatolide C y el spicatocadinanolide A y de igual manera fueron

aislados con los conocidos isómeros piptocarphol isomers además un

eudismane tipo sesquiterpeno. Las estructuras y las relativas

estequiometrias de los nuevos metabolitos fueron determinados por

métodos espectroscópicos (ISSA et al., 2006).

- Algunas enfermedades como la metamorfosis hepática y la necrosis del

lóbulo central fueron tratas con Pseudelephantopus spicatus dando

como resultado una protección farmacológica moderada (UN et al.,

1991).

Un nuevo sesquiterpeno lactone fue obtenido a partir de el extracto de

cloroformo del Pseudelephantopus spicatus. Esta estructura fue aislada

en extenso por espectroscopia unidimensional (1 D) y espectroscopia de

masas 20 NMR. Este extracto mostró una moderada actividad

antifungica contra el C Albicans and A. Níger y baja actividad contra el

T. menagrophytes, S. aureus, E. coli y P. aeuriginosa. Siendo inactivado

en su totalidad frente al B.subtilis (RAGASA y RIDEOUT, 2001).

 6

2.2. Radicales libres

2.2.1. Oxidación y producción de radicales libres

Todos los seres vivos que utilizan el oxígeno para la generación

de energía liberan radicales libres, lo que es incompatible con la vida a menos

que existan mecanismos de defensa contra estas especies.

La doctora Gerschman (1954), citado por GARCiA et al., (2001);

sugirió que los radicales libres eran agentes patógenos y estableció en este

trabajo 3 postulados básicos:

a. Los radicales libres constituyen un mecanismo molecular común de

daño cuando los animales de experimentación son sometidos a altas

presiones de oxigeno y a radiaciones ionizantes.

b. El desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes produce efectos tóxicos.

c. La producción de radicales libres es un fenómeno continuo con

implicaciones en el envejecimiento y la carcinogenesis.

Los radicales libres producidos durante la respiración aerobia

causan daño oxidativo que se acumula y resulta una pérdida gradual de los

mecanismos homeostáticos en una interferencia en patrones de expresión

génica y pérdida de la capacidad funcional de la célula, lo que conduce al

envejecimiento y a la muerte.

Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un

electrón desapareado por lo que son muy reactivos ya que tienden a robar un

electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad

 7

electroquímica. Una vez que el radical libre ha conseguido sustraer el electrón

que necesita para aparear su electrón libre, la molécula estable que lo cede se

convierte a su vez en su radical libre por quedar con un electrón desapareado

iniciándose así a una verdadera reacción en cadena que destruye nuestras

células. La vida media biológica del radical libre es de microsegundos pero

tiene la capacidad de reaccionar con todo lo que este a su alrededor

provocando un gran daño a moléculas y a membranas celulares. Las especies

reactivas del oxigeno (EROS) son moléculas radicales y no radicales que son

agentes oxidantes y son fácilmente convertidos a radicales, en la última década

se han acumulado evidencias que permiten afirmar que los radicales libres y el

conjunto de especies reactivas que se les asocian juegan un papel central en

nuestro equilibrio homeostático (AVELLO y SUWALSKY, 2006).

Las especies oxigenadas reactivas (ROS), formadas

metabólicamente como intermediarios parcialmente reducidos, son especies

moleculares activadas, dotadas de un electrón desapareado (radical libre) en

un nivel energético superior y por tanto dotadas de propiedades

paramagnéticas que les confieren una alta e indiscriminada reactividad

(MOSQUERA et al., 2005).

MICHAELIS (1939) propuso que la oxidación de todas las

moléculas orgánicas bivalentes ocurre con la formación de un radical libre

intermediario y fue capaz de mostrar por titulación oxidante la formación de las

semiquinonas en la oxidación de las benzoquinonas y naftaquinonas de igual

manera MICHAELIS (1946) describió la reducción univalente secuencial del

 8

oxigeno como mecanismo molecular de cuatro pasos de transferencia de un

electrón, con formación de radical superóxido (02- ), peroxido de hidrógeno

(H202) y radical hidroxilo (OH-) como los intermediarios de la reducción parcial

del oxígeno y con formación de agua como producto final y de reducción total

(BOVERIS, 2005).

Los radicales libres son resultado de los procesos fisiológicos

propios del organismo, como en el metabolismo de los alimentos, la respiración

y el ejercicio o bien son generados por factores ambientales como la

contaminación industrial, el tabaco, la radiación, los medicamentos, los aditivos

químicos en alimentos procesados y los pesticidas. Los radicales libres son

átomos o moléculas extremadamente reactivas, debido a que en el orbital más

externo de su estructura tiene uno o más electrones sin aparear. Esta

inestabilidad les confiere una avidez física por la captura de un electrón de

cualquier otra molécula de su entorno, ocasionando que la estructura afectada

quede inestable. De esta forma pueden establecer reacciones en cadena por

medio de varios transportadores que se oxidan y se reducen secuencialmente,

cuando un radical libre inicial modifica una biomolécula después de transferir o

capturar un electrón (VELÁSQUEZ et al., 2004).

Los sistemas biológicos necesitan del oxígeno para su

metabolismo energético. Aproximadamente 80% del Adenosin Trifosfato (ATP)

que utilizamos se forma en las mitocondrias, donde se consume entre el 85% y

90% del oxígeno. En ellas, el oxígeno molecular disuelto entra a la cadena

respiratoria para reducirse en agua, proceso en el que son generados en forma

 9

sucesiva, el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo,

especies de radicales derivadas del oxígeno.

El punto de partida del entendimiento y del conocimiento de los

radicales libres en los sistemas biológicos esta dado por el descubrimiento de

la enzima superóxido dismutasa (SOD) por McCORD y FRIDOVICH (1969). La

enzima fue aislada por eritrocitos y se determinó que catalizaba la reacción:

La existencia de la superóxido dismutasa implicó el reconocimiento

inmediato de la existencia fisiológica del radical superóxido, basado en la teoría

de que la enzima implica la existencia del sustrato. Al mismo tiempo fue

adquiriendo vigencia el "Dogma de Fridovich" donde las enzimas superóxido

dismutasa (SOD) y catalasa constituyen la ·defensa principal del células

aerobias contra la toxicidad del oxígeno. Las dos enzimas poseen un efecto

sinérgico al eliminar 0 2- y al H20 2 de los sistemas biológicos. El mecanismo

molecular por el cual ambos productos de la reducción parcial del oxígeno

ejercen su toxicidad biológica se explicó a) tomando reacciones descritas por

FENTON e HABER y WEISS donde el 0 2- y el H202 disminuyen su acción

toxica al convertirse en un radical hidroxilo y b) considerando la altísima

reactividad química del OH- que hace una abstracción de hidrógeno, una

oxidación en cualquier colisión molecular con una biomolécula.

 10

Las mitocondrias son la fuente fisiológica más importante de H202

intracelular. Las mitocondrias producen H202 a velocidades que dependen del

estado metabólico mitocondrial. En el estado controlado y altamente reducido,

la producción de H202 es máxima 2% y en el estado activo y más oxidado, la

producción de H202 (0.1 %) es mínima. En conclusión los tres intermediarios de

la reducción parcial del oxígeno (02-, H202, OH-) pasaron a ser denominados

conjuntamente EROS (especies reactivas oxigenadas) a favor de efectos

biológicos semejantes este concepto favoreció el establecimiento del campo de

la biología de los radicales libres (BOVERIS, 2005).

N02

Figura 2. Radical DPPH

2.2.1.1. Fuentes endógenas de radicales libres

A. Autoxidación de Catecolamina

Otras fuentes de 02- y H202 son las enzimas oxidativas como la

xantin oxidasa, las NADPH/NADH oxidasas, la acil CoA oxidasa, que son

enzimas que se activan en procesos fisiológicos que favorecen la producción

 11

de metabolitos tóxicos del oxigeno, y los citocromos P-450 y pequeñas

moléculas autooxidables como las catecolamina y las quinonas (AVELLO y

SUWALSKY, 2006).

El superóxido (02-) formado por la oxidasa NADPH controla la

producción de eritropeyina, participa en el control de la ventilación, en la

relajación del músculo liso y en la traducción de señales de varios receptores

membranales que activan funciones inmunes (VELÁSQUEZ et al., 2004).

B. Fagocitosis

En el sistema inmunológico de los organismos, en especial las

células fagocíticas, generan una importante cantidad de H202, mediante

NADPH oxidasa unida a membranas. Aunque las células no fagocíticas

también generan H202 mediante NADPH oxidasa, esta es estructuralmente y

genéticamente diferente, y su tasa de generación es apenas el 1% del

generado por las células fagocíticas

Otra especie de oxígeno reactivo es el oxígeno singulete (¡02), que

puede generarse cuando los electrones que han sido excitados por la luz pasan

su energía de excitación a uno de los electrones apareados del 02, los que

cambian su sentido de giro y apareándose con el otro electrón (AVELLO y

SUWALSKY, 2006).
 12

C. Peroxidación de lípidos

Esta reacción se origina a partir de los ácidos grasos

poliinsaturados (PUFAs) y por lo tanto vulnerable al ataque de radicales libres

que traen como consecuencia la peroxidación lipídica. Esta es generalmente

inducida por un radical hidroxilo (OH") que sustrae un hidrógeno a la cadena

lateral de un ácido graso formando un radical carbonado (R). Este último

reacciona con oxígeno para formar peróxidos cíclicos y radicales

hidroperoxidos (ROO") que propagan esta reacción en cadena. Se forman

igualmente radicales alcoxílicos lipofílicos (RO"). La peroxidación lipídica puede

seguir propagándose en presencia de Me2+ metales de transición existentes en

el plasma, los que son catadores.

Peroxidación lipídica iniciada por el radical (R")

PUFA -----. LH +R. L.+ RH (1)

L. + 02 Loo· (2)

LH + Loo· L +LOOH (3)

LOOH + Me n+ Lo· + Me n+ (4)

LOOH + Me <n-1) + Loo·+ Me n+ (5)

(1) Fase de iniciación de la peroxidación lipídica provocada por el

radical (R) el que reacciona con un grupo metileno del PUFA; (2) etapa de

propagación; el oxígeno molecular reacciona con el radical carbonilo y forma

rápidamente el radicallipoperóxido (LOO·). Este puede sustraer un hidrógeno

de un ácido graso poliinsaturado, análogo a (1); (3) reacción que termina la

propagación formándose el producto estable de la lipoperoxidación, el

 13

hidroperoxido lipídico (LOOH), pero implica la conversión de numerosas PUFAs

en hidroperoxidos; (4) en presencia de metales de transición el hidroperóxido

lipídico (LOOH) puede generar radicales capaces de reiniciar la

lipoperoxidación lipídica por el ciclo rédox de estos iones metálicos (AVELLO y

SUWALSKY, 2006).

Una vez que a un fosfolípido se le arrebata un electrón, este busca

estabilizar su estructura química y toma el electrón de la molécula próxima,

generándose así una reacción en cadena. Los productos de la lipoperoxidación

son aldehídos, cetonas, esteres y alcoholes (VELÁSQUEZ et al., 2004).

D. Oxidación de proteínas

La exposición de proteínas a sistemas generadores de radicales

libres conduce a modificaciones en su estructura terciaria, que pueden

acompañarse de una fragmentación química, un incremento en la

susceptibilidad al ataque proteolítico y a la pérdida de la función biológica. Uno

de los radicales más reactivos a la estructura de proteínas es el óxido nítrico

(NO) (VELÁSQUEZ et a/., 2004).

E. Oxidación de los carbohidratos

La oxidación de carbohidratos puede dar lugar a la formación de

moléculas capaces de reaccionar con los grupos carbonilo de las proteínas.

Los monosacáridos de la glucosa, una vez oxidados por los radicales libres

producidos por metales en transición, pueden combinarse con los grupos

carbonilo de las proteínas (VELÁSQUEZ et a/., 2004).

 14

F. Oxidación de ácidos nucleicos y nucleótidos

La interacción de los radicales libres con el ADN causa cambios

conformacionales, alteración de bases y ruptura de una o de la doble cadena y

pérdida de nucleótidos, eludiendo el sistema de reparación al presentar una

mutación antes de la replicación. Esto conduce a la formación de genes

mutados y por ende de proteínas disfuncionales. Las modificaciones de las

bases se deben, en gran parte, a los metales de transición, fundamentalmente

el ión ferroso (Fe2+), que se encuentra unido al ADN y que, en presencia del

peróxido de hidrógeno (H 2 02), genera el hidroxilo (OH-) que modifica las bases

del mismo hidroxilo y que puede atacar tanto purinas como pirimidinas,

además de generar rupturas en las cadenas de ADN (VELÁSQUEZ et el.,

2004).

2.2.1.2. Fuentes exógenas de radicales libres

Las fuentes exógenos de especies reactivas de oxigeno en los

organismos son antibióticos, medicamentos contaminantes, quimioterapia, la

exposición a radiación ultravioleta e ionizante (AVELLO y SUWALSKY, 2006).

2.3. Estrés oxidativo

Cuando el aumento del contenido intracelular de EROS sobrepasa

las defensas antioxidantes de la célula se produce el estrés oxidativo, a través

del cual se induce daño a moléculas biológicas como lípidos proteínas y ácidos

nucleicos (AVELLO y SUWALSKY, 2006).

 15

Indica que el nivel del estrés oxidativo esta influenciado por

mecanismos genéticos, el incremento de la formación de EROS es un

mecanismo epigenético. Durante el desarrollo cambios en el nivel del estrés

oxidativo programados genéticamente inducen a la formación de nuevas

proteínas o a la supresión de determinados genes, por lo que es posible que en

la fase adulta de la vida, modificaciones en el estrés oxidativo por factores

epigenéticos, supriman también la expresión de determinados genes.

Se ha sugerido que el efecto del estrés oxidativo en la expresión

génica sea a través de 2 mecanismos (CÉSPEDES et al., 2000):

Efecto directo sobre la producción y el procesamiento del ARN.

Cambios en la distribución iónica de la célula.

2.3.1. Efectos al nivel fisiológico de la célula

Se ha observado recientemente que el procesamiento del ARN es

alterado por exposición de la célula a sistemas generadores de radicales

oxígeno. En organismos en desarrollo, en tejidos de individuos senescentes y

en tejidos bombardeados con 02 se ha encontrado ARN inmaduro en el

citoplasma, lo que sugiere que los cambios asociados con el envejecimiento y

el desarrollo pueden ser mediados pqr ~~ ~eneración y eliminación de ERO

(CÉSPEDEt? et al., 2000).

2.4. Antioxidantes

Antioxidante es toda sustancia que hallándose presente a bajas

concentraciones respecto a las de una molécula oxidable (biomolécula), retarda

 16

o previene la oxidación de este sustrato. El antioxidante al colisionar con el

radical libre le cede un electrón, se debilita su acción en algunos casos como la

vitamina E, puede regenerarse a su forma primitiva por la acción de otros

antioxidantes. No todos los antioxidantes actúan de esta manera, los llamados

enzimáticos catalizan o aceleran reacciones químicas que utilizan a su vez

reacciones con los radicales libres (GARC(A et al., 2001).

Los antioxidantes se definen como aquellas sustancias que

presentes en bajas concentraciones respecto a la de un sustrato oxidable,

retardan o previenen la oxidación. Al interactuar con el radical libre, el

antioxidante cede un electrón, se oxida y se transforma en un radical libre no

tóxico. Así cuando se incrementa la producción de radicales libres, estos

mecanismos se activan para controlar y estabilizar al ambiente rédox intra o

extracelular (VELÁSQUEZ et al., 2004).

Un antioxidante es una sustancia capaz de neutralizar la acción

oxidante de los radicales libres, liberando electrones en la sangre que son

captados por los radicales libres, manteniendo su estabilidad. Nuestro

organismo esta constantemente luchando contra los radicales libres (AVELLO y

SUWALSKY, 2006).

Los Antioxidantes son compuestos como ácidos fenólicos,

polifenoles y flavonoides mientras que los radicales libres son aquellos como

peróxidos, hidroperóxidos. Estos antioxidantes inhiben el mecanismo oxidatívos

que termina con la generación de enfermedades (PRAKASH, 2001).

 17

2.4.1. Tipos de antioxidantes

Los tipos de antioxidantes se dividen en dos grupos principales:

A. Principales antioxidantes endógenos y tipo de radical que

neutralizan

Superóxido Dismutasa; Enzima intracelular o extracelular

responsable de remover los radicales superóxido. Necesita la presencia de

cobre, magnesio, hierro y zinc.

Catalasa; Esta enzima presente en la peroxisomas remueve el

peróxido de hidrogeno.

Glutatión Peroxidasa; Esta enzima intracelular contiene selenio.

Remueve los peroxilos.

Glutatión; Poderoso antioxidante que protege contra los efectos

dañinos de metales pesados, tabaco y alcohol. Limita la actividad de los

radicales superóxido aniónico, peróxido de hidrógeno, oxígeno singulete,

radical de ácido graso y proteínas oxidadas.

Melatonina; Es un antioxidante potente que altera la actividad de

las enzimas superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y glutation reductasa e

inhibe la actividad de la sintasa de óxido nítrico. Se ha reportado que la

melatonina es capaz de neutralizar el radical hidroxilo, radical peróxilo, oxígeno

singulete, óxido nítrico y proteínas oxidadas.

 18

Estrógenos; Neutralizan radicales libres lipofílicos, disminuyendo

la peroxidación lipídica de las membranas celulares.

B. Principales antioxidantes exógenos y tipo de radical que

neutralizan.

Vitamina C; Antioxidante del plasma hidrosoluble, es un poderoso

inhibidor de la oxidación de lípidos, regenera la vitamina E y es protector de los

efectos del tabaco. Actúa específicamente con el radical superóxido aniónico y

el radical hidroxilo.

Vitamina E; Principal antioxidante soluble de lípidos, previene la

oxidación de grasas. Aumenta su acción en presencia de zinc. Actúa

específicamente con el oxígeno singulete y el radical ácido graso

poliinsaturado.

Vitamina A; Tiene una fuerte acción antioxidante que se reconoce

especialmente por la neutralización del oxígeno singulete por un mecanismo de

transferencia de energía del radical, formación de un triplete de vitamina A y

posterior disipación de esta energía con regeneración de la vitamina A.

2.5. Polifenoles

Los Polifenoles son metabolitos secundarios de las plantas y

constituyen un amplio grupo de sustancias químicas de numerosas especies de

plantas. Su función principal en las plantas es de actuar como metabolitos

esenciales frente al ataque de agentes patógenos, incluyendo bacterias, fungi y

 19

virus, así como metabolitos esenciales para el crecim ento y reproducción de

estas. En la actualidad se ha encontrado más de 800 compuestos diferentes

reportándose que los polifenoles son un conjunto het rogéneo de moléculas

que comparten la característica de poseer en su e tructura varios grupos

bencénicos sustituidos por funciones hidroxílicas (VIL

Los compuestos fenólicos o polifenoles se ncuentran ampliamente

distribuidos en el reino vegetal y tiene su origen en lo derivados metabólicos

de la ruta del shikímico y de los fenilpropanoides. La ruta del shikímico, que

genera los fenilpropanoides y cumarinas, o la ruta del cetato que proporciona

las fenonas más simples y varias quinonas. Ademá pueden generarse a

través de una ruta metabólica intermedia que genera avonoides, siendo este

el grupo más importante y numero de compuestos fenólicos (PIÑEIRO, 2005).

 20

Cuadro 1. Clasificación de polifenoles totales.

ESTRUCTURA CLASE FENÓLICA

Fenoles

Ácidos hidroxibenzoicos

Acetofenonas y ácidos fenilacéticos

Ácidos cinámicos, cumarinas,

lsocumarinas y cromonas

Naftoquinonas

Cs-C1-Cs Benzofenonas, xantonas

Cs-C2-Cs Estilbenos, antraquinonas

Flavonoides:flavononas, flavonoles,
antocianidinas, chalconas, flavanoles
auronas, flavonas e isoflavonas

(Cs-C3) 2 Lignanos

(Cs-C3-Cs) 2 Bioflavonoides, biflavanos

(Cs_C3) n Ligninas

(Cs-C3-Cs) Proantocianidinas

Fuente: (PINEIRO, 2005).

 21

2.5.1. Flavonoides

Los flavonoides son un ejemplo de compuestos antioxidantes

naturales que están ampliamente distribuidos en los alimentos vegetales

presentes en la dieta normal humana y son un amplio grupo de compuestos

polifenólicos de bajo peso molecular que tienen en común el esqueleto 2-

fenilcromano (C6-C3-C6). Esta estructura base puede presentar muchas

sustituciones y variaciones que dan lugar a diversos tipos de flavonoides:

flavanoles, flaconas, flavanonas, catequinas, antocianinas, isoflavonas y

charconas identificándose hasta la actualidad más de 4000 flavonoides siendo

las principales fuentes dietéticas: cebollas, vino, manzana y el té (DE LUIS y

ALLER, 2008).

Dentro de este grupo grande podemos encontrar distribuidos a las

antocianinas, flavanoles, flavanonas, flavanoles, flaconas, isoflavanoides y

chalconas. Este conjunto se caracteriza por poseer un flavonoide no unido a

ninguna otra sustancia química al que se conoce como "aglicona". Por otro

lado a los flavonoides unidos a cualquier tipo de azúcar se les llama

"glicósidos" (PINEIRO, 2005).

 22

FLAVONA FLAVANONA FLAVONOL

o o o
Figura 3. Estructuras mayoritarias de flavonoides.

2.6. Proceso de atomización

La atomización tiene por característica principal la formación de

gotas y el contacto de estas con el aire. La etapa de atomización produce un

rocío para una condición óptima de evaporación y por consiguiente un producto

dentro de estas características técnicas. La atomización resulta de la rotura del

seno del líquido en pequeñas gotas y las diferentes técnicas de atomización

disponibles varían de acuerdo al tipo de energía utilizado para producir las

gotas (BARBOSA- CANOVAS y VEGA, 2000).

El secado por aspersión se utiliza en una amplia gama de

aplicaciones, desde productos farmacéuticos hasta alimentos y detergentes.

Los materiales de la alimentación se hallan por lo general en forma liquida

capaz de ser dispersada en forma de rocío. El fluido es atomizado o dispersado

en forma de gotitas finas que se ponen en contacto inmediato con un flujo de

aire o gas caliente, proporcionando estas gotitas una extensa área superficial
 23

para la transferencia de calor y masa, por lo tanto el enfriamiento por

evaporación y el tiempo de residencia corto mantienen una temperatura baja

del producto. Básicamente, las pérdidas de calor sensible a partir del aire

caliente proporciona el calor latente para evaporar el líquido del producto.

Ventajas

Conserva la calidad y las propiedades funcionales del producto.

Relativa simplicidad y facilidad de regulación del sistema.

Utilización de energía comparable con la de otros métodos de secado.

Conservación de la mayoría de los compuestos volátiles.

Desventajas

Inversión inicial alta.

Tamaño de la partícula difícil de controlar.

Requiere una alimentación que pueda manejarse por medio de bombas.

Problemas con la recuperación del producto y los polvos.

(S HARMA et al., 2003)

2.6.1. Descripción

Las características y el funcionamiento del atomizador se detallan a

continuación:

1. Un tanque de depósito contiene el producto que se va a secar.

2. Una bomba lleva el líquido del tanque a la cámara de secado.

 24

3. Una tubería conecta la salida de la bomba con parte posterior del

secador.

4. El atomizador o pulverizador es un disco giratorio sobre la boquilla

aspersora a presión que dispersa el producto en partículas muy finas.

5. Cámara de secado, donde el líquido de las partículas de producto se

evaporan en el aire circundante.

6. Un soplador fuerza aire a alta velocidad al interior de la cámara.

7. El aire del medio ambiente es calentado en una cámara normalmente a

temperaturas de 150° e y 210° c.

8. El aire caliente es llevado a la parte superior del secador donde entra

por arriba del disco giratorio.

9. La mezcla de producto secado deja el atomizador.

1O. En la práctica comercial el polvo inicial se rehumedece con una

corriente de aire húmedo y se vuelve a secar.

11. Aire caliente deja la cámara a través de un conducto.

12. Este aire al girar arroja las partículas del producto que aun contienen al

exterior del ciclón donde choca contra las paredes del separador

ciclónico y cae al fondo de la cámara.

13. El polvo se recolecto en un cilindro desprendible.

14. El aire más ligero se desplaza hacia el centro y sale a través de la parte

superior del separador.

(SHARMA et al., 2003)

 111. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Lugar de ejecución

El presente trabajo de investigación se ejecutó entre los meses de

mayo a noviembre del 2008 en los ambientes del Centro de Investigaciones de

Productos Naturales de la Amazonia Peruana (CIPNA) que pertenece al Centro

de Investigaciones para el Desarrollo Biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM)

de la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS). Este centro superior de

estudio se encuentra a 09° 17' 08" de Latitud Sur, a 75° 59' 52" de Longitud

Oeste y a 665 msnm, en el distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio Prado,

departamento de Huánuco que presenta una temperatura y humedad relativa

promedio de 24 °C y 89% respectivamente (RAMOS, 2002).

~~~· Mat~r;~ prim~

Se utilizó como materia prima a las plantas tiernas del

Pseudoelephantopus spicatus las cuales fueron recolectadas en horas de la

mañana de los alrededores de la Universidad Nacional Agraria de la Selva p~.,.,. .

posteriormente ser seleccionadas en raíz, hoja, tallo y parte aérea.

 26

3.3. Materiales

3.3.1. Materiales de laboratorio

• Matraces de 100 y 250 mi

• Vasos de precipitación de 50 mi

• Pipetas de 5 y 10 mi

• Micropipetas de 10-1 00 ul y 100-1000 ul

• Cubetas de poliestireno (1 cmx 1cm x 4.5 cm)

• Fiolas de 10, 25 y 50 mi

• Papel filtro

• Tips

• Gradilla

• Microtubos

• Microjeringas (50 ul)

• Filtro de membrana de 0.2 J.Jm marca Gelman

3.3.2. Equipos de laboratorio

• El HPLC utilizado resultó ser de marca Shimatzu Scientific,

MD, USA; las características de la bomba, columna, detector,

controlador fueron de los siguientes modelos: LC-10ATVP,

P~~NOMf;N,F?< G~MINI/C-18/110A/5P m/ 250 X 46.0 MM, CTO

10 AS VP, UV-VIS SPD-10AWP, SCL-10AVP

respectivamente. El inyector requerido tuvo una capacidad de 20

ul.
 27

• Balanza analítica marca Sartorius (USA) con una sensibilidad de

0.0001 g.

• Espectrofotómetro de absorción molecular marca Termo Electrón

Corporation, modelo genesys-6.

• pH marca ATC.

• Desionizador de agua marca Easy Pure 11 RF/UV.

• Baño maría Modelo YCW-OLOE GEMMYCO.

• Rotavapor Modelo R-300.

• Vortex marca Genie 2 Scientific ldustries.

• Estufa.

3.3.3. Reactivos y soluciones

• 1,1 diphenyl-2-picrilhydrazyl (DPPH).

• 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolino-6- ácido sulfónico) (ABTS+).

• 2,2 - azobis (2- amidopropano) hidrocloride (ABAP).

• Carbonato de sodio (Na2C03).

• (+)- catequin 1 mM.

• Solución de fenol de Folin- Ciocalteu.

• Cloruro de sodio (NaCI) Q.P.

• Fosfato de sodio hepta hidratado (Na2 HP04 . 7H 20) Q.P.

• Fosfato de potasio (KH2P04) Q.P

• L (+)ácido ascórbico Q.P.

• Metano! (99.9% pureza) para HPLC.

 28

3.4. Métodos de análisis

3.4.1. Determinación de la capacidad antioxidante

a) Prueba del Radical DPPH

Se utilizó el método descrito por Brand-Williams et al., (1995)

modificado por SANDOVAL et al., (2001). Esta prueba se fundamenta en la

reducción del radical DPPH mediante un donador de hidrógeno que procedería

de los tipos de extractos evaluados. Se hizo reaccionar 975 ul del radical DPPH

con 25ul de la muestra analizada en un espectrofotómetro a una absorbancia

máxima de 515 nm, el cambio de coloración de azul a amarillo es un indicativo

de la completa reducción del radical DPPH (SANDOVAL et al., 2001). Los

resultados se reportaron en función al Coeficiente de Inhibición (ICso)

expresado en ug/ml.

b) Prueba del radical peróxilo

Se utilizó el método TRAP descrito por Bartoz et al., (1998)

modificado por SANDOVAL et al., (2001). Este método tiene como principio la

inhibición de la peroxidación lipídica mediante el secuestramiento del radical

peróxil~. Este radical tiene su origen a partir d~l r~dical .A,~TS .Las lecturas se

registr~r9n c~!jbranqg ~1 espectrofotómetro a un~ absorp~r¡~ja de 414 nm, el

cambio en la coloración de verde oscuro a incoloro significa el secuestramiento

integro del presente radical (SANDOVAL et al., 2001). Los datos registrados

fueron expresados mediante el Coeficiente de Inhibición (IC 50 ) en ug/ml.

 29

e) Análisis estadístico

Los resultados obtenidos de ICso expresados en ug/ml

fueron evaluados mediante el diseño en bloque completo al azar (DBCA) con

arreglo factorial 4*2 (Anexo-1) siendo los niveles de significancia analizados de

acuerdo a la prueba Tukey P < 0,01.

3.4.2. Atomizado de la muestra

Se utilizó el método reportado por SANDOVAL et al., (1998);

plantas medicinales. El objetivo principal del atomizado es la eliminación total

del agua del alimento (SHARMA, et al. 2003).

3.4.3. Determinación del Contenido de Polifenoles Totales

Se realizó según el método de Folin-Ciocalteu reportado por

SANDOVAL et al., (2001). Esta prueba consiste en la lectura de la

característica coloración azul que es causada por la reacción entre tugstato y

molibdato en un medio básico (Na2C0 3) acuoso a una absorbancia de 700 nm

debido a que estos compuestos pueden ser identificados y cuantificados a esta

longitud de onda (MARTÍNEZ, 2007). Los resultados se expresaron en

equivalente de catequina/ g atomizado (eq.CAT/ g atomizado).

3.4.4. Cuantificación de Catequina mediante HPLC.

Esta prueba se realizo de acuerdo al método descrito por DING, et

al (1999). La cuantificación del contenido de catequina se realizó en un

ambiente a temperatura de 20°C mediante el sistema HPLC en fase reversa,

 30

siendo separado por una gradiente. El eluente que se utilizo para este

determinación consistió en agua, metanol y ácido acético en una proporción de

70:30:0.1 (v/v) respectivamente.

3.4.5. Análisis sensorial

Se utilizó la Prueba F de Snedecor Aplicada a una Categorización

Cuantitativa Absoluta descrito por (UREÑA et al., 1999). De esta manera se

evaluó la intensidad de los atributos (color, olor y sabor).

 31

3.5. Metodología experimental

Pseudelephantopus spicatus
micropulverizado

1 1 1 1

Factor 1 RAIZ HOJA TALLO PARTEAEREA

Nivel1 NiV¡el 2 Nivel3 Nivel4
1 1 1 1

EXTRACCIÓN

Factor 2 ACUOSA ETANOLICA (50%)

Niv13l 1 Nivel2
1

DPPH-Peróxilo

Mejor resultado
le 50

ATOMIZADO

1 1 1

DPPH POLIFENOLES CUANTIFICACIÓN ANÁLISIS

1 1 1 1 DE SENSORIAL
CATEQUINA

Figura 4. Metodología experimental a seguir para la obtención del producto atomizado y sus

adicionales pruebas antioxidantes y sensoriales.

 32

3.5.1. Micropulverización del Pseudelephantopus spicatus

Para obtener la micropulverización de las partes en estudio de esta

planta se realizaran Jos siguientes pasos (Fig. 6):

a) Acopio: Se recolectó a las plantas tiernas de esta especie. Las

horas de recolección fueron de 7 a 9 la mañana.

b) Selección: Se seleccionó cuidadosamente a la raíz, hojas, tallo y

parte aérea de manera que no presenten daño mecánico con el

objetivo de presentar un producto final de calidad.

e) Lavado: Se hizo un lavado de cada una de las partes

seleccionadas por inmersión en agua.

d) Blanqueado: Las hojas recibieron un tratamiento térmico de 95

°C/10 segundos.

e) Oreado: Las partes de la planta a estudiar fueron expuestas al

medio ambiente por un tiempo de 1 a 2 horas.

f) Secado: Esta operación consistió en poner las partes en estudio

de la planta en la estufa a 65 oC/14-16 horas.

g) Molienda: Se realizo utilizando un molino eléctrico.

h) Envasado: Las partes de la planta en estudio se embolsaron cada

una por separado para su almacenamiento a temperatura

ambiente.
 33

ACOPIO - - - • de toda la planta

raíz, hojas, tallo y

SELECCIÓN parte aérea por
seoarado

Por inmersión en
LAVADO agua potable

BLANQUEADO r---~ 95°C/10segundos

L----~--~

OREADO 1-2 horas a

To ambiente

MOLIENDA

ENVASADO En bolsas de polietileno

Figura 5. Operaciones seguidas para la obtención del producto

micropulverizado.
 34

3.5.2. Preparación de los extractos

Se realizaron dos tipos de extracciones y los solventes utilizados

fueron: acuoso y etanólico (50%).

a) Extracto acuoso

• Se agregó 1 g de muestra seca en 1O mi de agua desionizada lo

cual resultó ser una solución de 100 mg/ml de concentración.

Esta solución se sometió a temperatura de ebullición por un

tiempo de 5 minutos.

• Seguidamente se filtró las muestras siendo el líquido filtrado

adicionado en microtubos de 2000ul de capacidad que luego se

centrífugo a 10000 rpm por un tiempo de 5 minutos a 4 oc.

• Finalmente se realizaron las diluciones respectivas para cada

una de las pruebas de capacidad antioxidante.

b) Extracto etanólico (50%)

• En esta extracción se realizó de la misma forma que la anterior

descrita con la diferencia de utilizar como solvente al etanol al

50% siendo el tiempo de maceración para este caso de 24

horas a temperatura ambiente.

• Posteriormente el sobrenadante se añadió en microtubos de

2000ul de capacidad para ser centrifugados a 10000 rpm por un

tiempo de 5 minutos a 4 oc.

• Para finalmente realizar las diluciones respetivas para cada una

de las pruebas de capacidad antioxidante.

 35

3.5.3. Determinación de la Capacidad Antioxidante

a) Prueba del radical DPPH

Primeramente se pesó 0.008 gramos del radical DPPH para luego

agregarlo a 20 mi de solución metanólica (96% pureza), obteniendo nuestra

primera solución stock (1mM). Seguidamente esta mezcla fue sometida al

vortex por un tiempo de 1O minutos con la finalidad de que tenga un adecuado

homogenizado. A continuación se tomó 2 mi de esta primera solución stock y

se añadió en 18 mi de metano! (96% pureza) resultando una segunda solución

stock (100 uM). Paralelamente se preparó la solución estándar de las muestras

teniendo un stock de 100 mg/ml. Para proseguir a la preparación de las

siguientes concentraciones: 40, 12, 4, 1.2 y 0.4 mg/ml a las que llamaremos

, soluciones intermedias. Finalmente a partir de estas soluciones se tomó 25 ul

para obtener las concentraciones finales de las muestras en estudio siendo 1O,

30, 100, 300 y 1000 ug/ml las cuales fueron reaccionadas con la segunda

solución stock del radical DPPH (100 uM) (Cuadro 3).

 36

Cuadro 2. Cantidades indicadas para la reacción entre la solución intermedia y

del radical DPPH con respecto a las concentraciones finales.

Concentraciones Solución intermedia *Radical DPPH Volumen final

(ug/ml) (ul) (ul) (ul)

1000 25 975 1000

300 25 975 1000

100 25 975 1000

30 25 975 1000

10 25 975 1000
*Se encuentra a una concentración de 100uM.

La reacción se genero en una cubeta de poliestireno de (1cm x

1cm x 4.5cm) lugar donde se mezcló la cantidad de 25 ul de la muestra con

975 ul del radical DPPH para seguidamente proceder a su lectura cada 30

segundos por un tiempo de 1O minutos para lo cual se utilizó un

espectrofotómetro de absorción molecular Termo Electrón Corporation

calibrado a 515 nm. La capacidad de inhibición del radical DPPH se determinó

mediante la siguiente ecuación.

% Inhibición DPPH= ((Adpph-Amuestra)/Adpph) X 100

Donde:
Adpph = Absorbancia de radical DPPH
Amuestra = Absorbancia de la muestra en estudio
 37

b) Prueba del radical Peróxilo

Primeramente se preparó dos soluciones stock por separado

conteniendo 0.225 mM de ABTS y 2 mM de ABAP las cuales fueron

posteriormente adicionados en un buffer PBS conformado por 50 Mm de

fosfato, 0.9% NaCL regulado a PH 7.4. Esta nueva solución fue sometida a

tratamiento térmico, 70 oc por 20 minutos para seguidamente enfriarse sobre

hielo. La relativa estabilidad del radical ABTS se da con la presencia del color

verde. Paralelamente a esto se prepararon las respectivas soluciones

intermedias que en este caso fueron de 12, 4, 1.2 y 0.04 ug/ml.

La inhibición del radical ABTS se determino a partir de la adición de

1O ul de cada una de las concentraciones de las soluciones intermedias

disueltos en 990 ul de la solución stock del radical ABTS. (Cuadro 4).

Cuadro 3. Cantidades indicadas para la reacción entre la solución intermedia y

el radical peróxilo en las concentraciones finales.

Concentraciones Solución Intermedia Radical peróxil Volumen final

(ug/ml) (ul) (ul) (ul)

300 10 990 1000

100 10 990 1000

30 10 990 1000
 38

El decrecimiento en la absorbancia a 414 nm fue determinado con

el registro de los datos cada 30 segundos por un tiempo de 1O minutos

mediante el uso de un espectrofotómetro molecular Termo Electrón

Corporation. El porcentaje de inhibición del radical ABTS fue calculado de

acuerdo a la siguiente ecuación.

% Inhibición Peroxilo= ((Aperoxno-Amuestra)/Aperoxno) X 100

Donde:
Aperoxilo= Absorbancia de radical peróxilo
Amuestra = Absorbancia de la muestra en estudio

e) Coeficiente de Inhibición (ICso)

Se determinó mediante el análisis de regresión del porcentaje

(%)remanente de Inhibición versus la concentración de los extractos acuosos y

etanólicos (50%) de cada una de las muestras en estudio necesarios para

inhibir al 50% de radicales libres (BRAND-WILLIAMS et al., 1995).

 39

Pseudelephantopus spicatus
micropulverizado

DPPH-peróxilo

Coeficiente de
Inhibición (ICso)

Análisis
Estadístico

Figura 6. Diseño experimental para determinación del coeficiente de inhibición

ICso (ug/ml) de las muestras en estudio,

 40

3.5.4. Atomización de la muestra

El proceso de atomización se describe a continuación:

a) La parte aérea del Pseudoelephantopus spicatus fue secada a

65°C por un tiempo de 16 horas.

b) Se procedió a realizar una molienda para lo cual se tuvo que

utilizar un molino de martillo (acero inoxidable) con el objetivo de

obtener una nuestra homogénea de 0.5 cm de longitud.

e) La proporción de muestra molida y agua fue de 1:1 O

respectivamente. Esta solución fue sometida a extracción acuosa

por un tiempo de 75 oc por 6 horas.

d) El material sólido fue desechado mientras que el extracto líquido

seguidamente fue filtrado para obtener un tamaño granular de

150 micras en este caso se uso mallas de acero inoxidable.

e) En el mismo sentido el extracto filtrado fue concentrado hasta

obtenerse una relación de 10% sólidos totales

 41
SECADO e=~> 651°C/16 horas

MOLIENDA e=~> Con molino de martillo

Muestra homogénea
de 0.5 cm longitud

EXTRACCIÓN e===>
1g muestra:10ml H20 ==~>
e' ACUOSA 751°C/ 6 horas

Material sólido
desechado
Con mallas de acero
FILTRADO e=~> inoxidable
Muestra homogénea
de 150 um

CONCENTRADO e=~> 1O% sólidos totales

ATOMIZADO

EMPAQUETADO e=~> En bolsas de

polietileno

ALMACENADO e::==::::::> T 0 ambiente

Figura 7. Flujograma para la obtención del producto atomizado.

 42

A continuación se muestra la imagen de un atomizador en co-

corriente con cada una de sus partes enumeradas, la explicación de estas se

encuentra en la revisión bibliográfica referida a la misma.

Ingreso f • Salida de
de aire r.===-~~==;, aire húmedo
caliente
8
4

Ingreso
de aire-
fresco 6

9
13

10 ~i'}S==:::ol~=======liEm====== ~
Salida de producto Al ciclón de
en polvo envasado

Figura 8. Esquema de un atomizador en ca-corriente.

 43

3.5.5. Prueba de Polifenoles Totales

La realización de esta prueba se explica detalladamente a

continuación:

a) Se preparó las siguientes soluciones stocks de (Na2C03 ). al

20% en H 20dd y (+)- catequina en metano! a 0.1 M a un

volumen de 20 mi respectivamente para cada uno.

b) Las concentraciones de catequina para la construcción de la

curva estándar fue de O, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 u M.

e) Seguidamente se adicionó a cada tubo de ensayo 1.58 mi de

agua destilada desionizada (H 20dd), 300 mi de Na2C03 y 20 ul

del estándar (catequina).

d) Luego se agregó 100 ul de solución de fenol Folin-Ciocalteu

agitando ligeramente.

e) Se Incubo por 1 minuto a temperatura ambiente.

f) Finalmente las absorbancias fueron registradas a 700 nm usando

cubetas de poliestireno (1 cm x 1 cm x 4.5 cm) en un

espectrofotómetro (marca Genesys 10 UVNIS).

Hay que recalcar que para el caso de los controles se agregó 20 ul

de agua destilada desionizada (H20dd). En cuanto a los extractos se realizaron

las diluciones necesarias con el objetivo de que la absorbancia se ubique en el

rango de la curva estándar.

 44

Solución stock
de la muestra
l
Preparación de La reacción será por
~
soluciones un tiempo de 2h

Absorbancia a
~ Registro de lecturas
700nm

Contenido de
Polifenoles

Figura 9. Flujograma para la obtención del contenido de

polifenoles totales de la muestra atomizada.

 45

3.5.6. Cuantificación de Catequina mediante HPLC

Esta prueba se divide en dos partes que se describen continuación:

a) Preparación de la muestra

Se agrego 1gr de la muestra atomizada a 1Oml de agua

desionizada resultando una solución stock de 1OOmg/ml. Esta solución se

sometió a tratamiento térmico (temperatura de ebullición por un tiempo de 5

minutos).

Posteriormente se filtró con papel Whatman (20 um) y se

centrifugó a (10000 r.p.m/10 min) a temperatura de 4°C. Se separo el sobre-

nadante nuevamente diluyendo 20 veces a partir la solución stock.

Seguidamente esta segunda solución stock (5mg/ml) se filtro mediante una

membrana de 0.45um antes de ser inyectados al HPLC. Las alícuotas

restantes se almacenaron a -20 oc para evitar el deterioro de las catequinas

presentes en las muestras.

b) Preparación del estándar

La concentración de la muestra estándar de catequina que se

utilizo fue de 1OOOuM esta se disolvió en agua de grado HPLC para

posteriormente levantar la curva estándar, las concentraciones elegidas en este

caso fueron de 50; 100; 200; 300 y 500 uM. En el cuadro 8 se explica

detalladamente la adición de los volúmenes respectivos para la obtención de

cada una de estas concentraciones.

 46

Cuadro 4. Cantidad de volúmenes adicionados para la obtención de cada una

de las concentraciones.

Concentraciones *Catequina Metanol HPLC Volumen final

uM
(ug/ml) (ul) (ul) (ul)

50 50 950 1000

100 100 900 1000

200 200 800 1000

300 300 700 1000

500 500 500 1000

*Se encuentra a una concentración de 1000uM.

El sistema HPLC trabajo en fase reversa a una temperatura

ambiente mediante una separación por gradiente y los buffers utilizados en la

fase móvil fueron agua, metanol y acido acético en una proporción de 70:30:0.1

(v/v) respectivamente. El volumen añadido de estándar o muestras al HPLC fue

de 20 ul y se realizo mediante inyecciones. La absorbancia seleccionada para

detectar el contenido de catequina fue de 270 nm.

 47

BOMBA RESERVORIO

DETECTOR

RESERVORIO

~J 1

PC

Figura 1O. Imagen de las partes que componen el sistema HPLC.

 48

3.5.7. Análisis sensorial

Se prepararon tres tipos de concentraciones: Las cuales fueron

evaluadas por un total de 30 panelistas quienes determinaron la intensidad del

sabor, color y olor de acuerdo a su juicio.

a) Preparación de la muestra

Primeramente se peso 150, 250 y 350 mg de la muestra atomizada

para posteriormente adicionarlo en 100 mi de agua para consumo humano

respectivamente. Estas soluciones nos dieron las concentraciones de 1.5, 2.5 y

3.5 mg/ml. Posteriormente se realizo un filtrado con el objetivo de separar

algunas sustancias groseras y de esta manera tenga una mejor presentación

frente a los panelistas.

b) Descripción de la prueba sensorial

La prueba de análisis sensorial a los tres atributos seleccionados

tuvo lugar en el laboratorio de análisis sensorial en horas de la mañana. Se

eligió un universo de 30 personas a las que se califico como panelistas no

entrenados, a los cuales se les entrego una hoja de calificación (Anexo-V) para

que dieran su veredicto. Los rangos establecidos fueron desde, me agrado

muchísimo, me agrada mas o menos y me desagrada mucho con un puntaje de

10, 5 y 1 respectivamente.
 49

Muestra atomizada

X Y Z X Y Z X Y Z
1 1

l
Evaluación de
panelistas

1
Análisis
Estadísticos

X: olor
Y: sabor
Z: color
C1: 150mg/1 OOmi
C2:250mg/1 OOml
C3:350mg/1 OOml

Figura 11. Diseño experimental para la prueba de análisis sensorial.

 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Radical DPPH

4.1.1. Capacidad antioxidante de acuerdo a la fisiología de la planta

Cuadro 5. Capacidad de Inhibición expresado en ICso (ug/ml) de los extractos

acuosos y etanólicos frente al radical DPPH.

Extracciones
Partes de la Planta Acuosa Etanólica (50%)

Raiz 276.271 ±0.564c 378.112±0.516 d

Hoja 207.131 ±0.574 b 418.654±1.950f

Tallo 400.131 ±0.574 e 398.977±0.449e

Parte aérea 413.687±1.698 f 124.246 ± 1.260 8

El valor ICso es el promedio (n=3 + SE). Los superindices diferentes indican la diferencia
significativa p< 0.01

500
400
300
200 lE acuoso
• etanólico(50%)
100
o
raiz hoja tallo parte
aerea
Figura 12. Eficacia de los extractos frente al radical DPPH.
 51

Los resultados mostrados en el cuadro 5 y figura 12 señalan a la

parte aérea mediante extracción etanólica (50%) como el fragmento con la

mayor capacidad de inhibir al radical DPPH expresado en leSO (ug/ml) y de

acuerdo al análisis de varianza (Anexo-llb) se puede advertir la presencia de

diferencia significativa (p< 0.01) en cuanto a todas las secciones analizadas.

Es necesario acentuar que la parte aérea está conformado por la

hoja y tallo, esta unión podría ser una la causa de su alto poder de inhibición

siendo además la parte de la planta que tiene mayor exposición a luz solar, en

ese sentido SALISBURY y ROSS, (2000) mencionan que la luz promueve la

formación de flavonoides. POKORNY et al., (2001) menciona que las hojas

tienen un alto poder antioxidante debido a su contenido de flavonas y

flavonoles que son los que capturan a los radicales libres aunque LARSON,

(1998) indica que los mayores constituyentes son quercetina y myrectina, de

igual manera todos estos grupos pertenecen al gran grupo de los Flavonoides

al cual muchos autores lo señalan como el causante principal la capacidad

antioxidante en varias especies de plantas.

Por otro lado una de las característica de esta planta es su rápida y

predominante presencia en el lugar que se establece, esta singularidad podría

darse a la presencia de galotaninos provenientes del ácido galico que tiene una

capacidad alelopática de manera que inhibe el crecimiento de otras especies a

su alrededor (SALISBURY y ROSS, 2000). En el mismo sentido se puede

resaltar la presencia antioxidante de este mismo acido ya que de acuerdo a

GIAO et al., (2009) el ácido gálico actúa protegiendo eficazmente a la bacteria

 52

P22/ Salmonella typhimurium contra el daño oxidativo producido por el

peróxido de hidrogeno.

Finalmente existen una variedad de pruebas antioxidantes a las

que se les podría someter esta planta, una de ellas es la prueba de la

capacidad de absorbancia del radical oxigeno mejor conocido por sus siglas en

ingles como (ORAC) que es comúnmente aceptada para medir la capacidad

antioxidante en nutraceúticos, farmacéuticos y alimentos procesados (HUANG

et al., 2002).

4.1.2. Capacidad Antioxidante con respecto a los tratamientos

Cuadro 6. Capacidad Antioxidante de los respectivos tratamientos expresado

en ICso (ug/ml) frente al radical DPPH.
Tratamientos Tipos de extracción ICso (ug/ml)

T1 raíz-extracto acuoso 276.271 ±0.564 e

T2 hoja-extracto acuoso 207.131 ±0.574 b

T3 tallo-extracto acuoso 400.131 ±0.574 e

T4 parte aérea-extracto acuoso 413.687±1.698 f

T5 raíz- extracto etanólico (50%) 378.112±0.516 d

T6 hoja- extracto etanólico (50%) 418.654±1.950f

T7 tallo- extracto etanólico (50%) 398.977±0.449 e

T8 p. aérea- extracto etanólico (50%) 124.246± 1.260 a

El valor ICso es el promedio (n=3 + SE). Los superíndices diferentes indican la diferencia
significativa p< 0.01
 53

Según el cuadro 7 y el análisis de varianza reportado en el Anexo-

lid se puede afirmar la existencia de diferencia altamente significativa tanto

para los diferentes tratamientos como para los tipos de solvente utilizados

(Anexo-llc). En consecuencia el tratamiento T8 correspondiente a la parte

aérea se exhibió como la sección que posee la mayor capacidad de inhibir a los

radicales DPPH y el solvente etanólico se comporto de manera mas activa.

MURILLO et al., (2007), menciona que la hoja del Bauhinia Kalbreyeri reporta

un leSO de 18,42 ug/ml cabe subrayar que aunque esta hoja se extrajo también

con etanol, en este caso se trabajo con el solvente en su más alto grado de

pureza lo que podría influir en su valor de leSO encontrado. Por otro lado la

Calycophyllum spruceanum (Benth) Hook.f.exk.schum reporta valores leSO de

48,378±5.291; 50.12±2.681 y 37,148± 5.565 ug/ml para las horas de

recolección de las 7 a.m., 12 p.m. y 5 p.m. respectivamente (DAZA, 2003).

Estos resultados son superiores hasta 3.3 veces a la parte aérea del

Pseudelephantopus spicatus demostrando que el solvente acetona/agua

(70:30) resultó ser más activo, en el mismo sentido los pigmentos del Atta/ea

butyracea extraídos con el solvente metanol reportaron un IC5o de 141.4 ug/ml

(GAVIRIA et al., 2007). En este último caso nuestra muestra estudiada se

comporto de manera más efectiva frente al radical DPPH.

Por lo visto los solventes etanólicos (50%) por lo general tienden a

ser superiores en su actividad antioxidante frente a los acuosos. Este punto lo

explica (MARTÍNEZ, 2007) quien menciona que los solventes mas polares

(metanol, acetato y acetato de etilo) poseen la capacidad de donar hidrógenos

con mucha facilidad influyendo directamente en su alta capacidad antioxidante.

 54

En cuanto a los extractos acuosos el tratamiento T2 perteneciente

a la parte de la hoja reporto un lc50 de 207.131 ±0.574 ug/ml superior a los

demás tratamientos pero inferior si lo comparamos con el mejor resultado IC 50

de los extractos etanólicos (50%). Diversos autores mencionan que la parte de

la hoja contiene una gran variedad de compuestos fenólicos pero es necesario

advertir que las hojas al igual que las otras partes de la planta estudiadas

fueron sometidas a un blanqueado y que la extracción acuosa se realizo a

temperatura de ebullición por un tiempo de 1O minutos. Navarro et al., (2006)

mencionado por CARRIÓN, (2008) señala que las operaciones de escaldado,

cocción y ebullición disminuyen el contenido de actividad y biodisponibilidad de

los antioxidantes. En consecuencia se puede afirmar que los extractos acuosos

están en desventaja frente a los etanólicos (50%).

Finalmente la absorbancia seleccionada para la prueba DPPH fue

de 515nm diversas investigaciones reportan sus resultados en base esta

longitud de onda. POKORNY, et al. (2001) menciona que el radical DPPH es

captado a esta absorbancia indicando además que una serie de reacciones

secundarias lentas van a influir para establecer el tiempo adecuado en la cual

se va a determinar el ICso. Este es un punto crítico en la investigación debido a

11,'

que las qjf~r~lltes muestras que reaccionan con este radical no se estabilizan

al mili,fTlO tiempo. BRAND-WILLIAMS, et al. (19~5) reporta en su inv~~tigación

mediante este método que la muestra que se demoro mas en estabilizarse fue

a 6 horas a partir del empiezo de la reacción. El tiempo en el cual se determino

el ICso para la presente investigación fue a 1O minutos, tiempo en el cual se

estableció su máximo porcentaje de inhibición así como su respectivo valor IC50

 55

expresado en ug/ml para cada una de las partes en estudio. Sin embargo

OZGEN, et al. (2006) manifiesta que con los compuestos estándares fenólicos,

el tiempo de 1O minutos solo es un estimado y no hace representación al punto

final de la oxidación. Ahora y volviendo al tema de la absorbancia MARTINEZ,

et al. (2007) menciona que el radical DPPH absorbe a 515nm y disminuye esta

absorbancia a partir de una reducción por un antioxidante proporcionando un

índice para estimar la capacidad de este antioxidante para secuestrar a este

radical.

4.2. Radical peróxilo.

Cuadro 7. Capacidad de Inhibición expresado en ICso (ug/ml) de Jos extractos

acuosos y etanólicos frente al radical peróxilo.

Extracciones

Partes de la Planta Acuosa Etanólica (50%)

Raíz 46.920±0.390 d 37.209±0.069 be

Hoja 251.599 ± 1.076 f 104.322 ± 1. 71 Oe

Tallo 32.370 ±O. 705 be 25.43 ± 1.398 a

Parte aérea 357.149±0.7349 39.17±0.833c

El valor IC50 es el promedio (n=3 + SE). Los superíndices diferentes indican la diferencia
significativa p< 0.01
 56

400

300

200 Bacuoso
100 • etanólico{SO%)

raiz hoja tallo parte

aerea
Figura 13. Eficacia de los extractos frente al radical peróxilo.

Después de observar el Cuadro 8, la Figura 12 y los resultados del

análisis de varianza (Anexo-lllb) se puede anunciar a la parte del tallo como la

sección de la planta que inhibió en mayor medida al 50% de los radicales

peróxilos (ICso) y también la existencia de diferencia altamente significativa (p<

0.01) en cuanto a las partes de la planta estudiadas respectivamente. Como se

sabe la función principal del tallo es el de transporte de nutrientes (DEVUN;

1980) pero si añadimos a esta situación la rigidez de la lignina en las paredes

celulares del xilema y la formación de los anillos caracterfsticos de los

flavonoides todo esto ocasionado por el estimulo de la luz (SALYSBURI y

ROSS; 2000). Esto explica el paso de los nutrientes que llegan hasta la hoja y

su alta capacidad de inhibición de radicales peróxilo de esta parte de la planta.

Además uno de los factores que influyen en la capacidad de una muestra es el

lugar de donde se extrae asi como el tiempo de la cosecha (OU et al., 2002).

Es necesario añadir que en la mayoria de los casos la parte seleccionada para

el consumo de las personas es la raiz en forma de infusión y como se puede

 57

apreciar en el cuadro 8 muy aparte de que exista diferencia significativa (p<

0.01) la variación entre los extractos acuosos y etanólicos (50%) no es

demasiada amplia.

Cuadro 8. Capacidad Antioxidante de los diferentes tratamientos expresado en

IC50 ug/ml frente al radical peróxilo.

Tratamientos Tipos de extracción ICso (ug/ml)

T1 raíz-extracto acuoso 46.920±0.390 d

T2 hoja-extracto acuoso 251.599± 1.076 f

T3 tallo-extracto acuoso 32.370±0.705 b

T4 parte aérea-extracto acuoso 357.149±0.734 g

T5 raíz- extracto etanólico (50%) 37.209±0.069bc

T6 hoja- extracto etanólico (50%) 104.322±1.710e

T7 tallo- extracto etanólico (50%) 25.43 ± 1.398 a

T8 p. aérea- extracto etanólico (50%) 39.17±0.833c

El valor IC50 es el promedio (n=3 + SE). Los superíndices diferentes indican la diferencia
significativa p< 0.01

En lo que respecta a los tratamientos mostrados en el cuadro 8 se

puede observar al T7 con la mayor capacidad de inhibir al 50% de radicales

libres (ICso) ug/ml seguido por el tratamiento T3 y T5 que son estadísticamente

iguales añadiendo ademas que T5 y T8 tienen la misma igualdad estadística.

Los resultados del análisis estadístico (Anexos-lile y llld) indican diferencia

altamente significativa en cuanto a los métodos de extracción y tratamientos.

Como se puede apreciar en el cuadro 7 los solventes etanólicos

(50%) vuelven a comportarse de manera mas activa frente a los acuosos.

 58

MURILLO et al., (2007) explica que la actividad antioxidante de algunos

extractos polares se debe en parte a los grupos hidroxilos que contiene, los

cuales ejercen su acción por donación de protones.

Por otro lado (VILLANUEVA, 2003) en sus estudios a los extractos

acuosos de la cáscara de camu-camu (Myrciaria dubia McVaugh H.B.K) en sus

tres estados: verde, pintón y maduro reporta valores leSO de 12.21 ±0.35, 8.30

±0.85 y 14.39±0.08 ug/ml respectivamente. De igual manera CARRIÓN

(2008) reporta valores IC50 de 12,722±0.18 y 11.375±0.02 ug/ml para los

extractos acuoso y etanólico de la yema terminal de la guanábana, muestra

originaria a partir de los 650 m.s.n.m que fue su primer nivel de análisis.

Aunque estos resultados son superiores hay que tomar en cuenta que no existe

una diferencia amplia con respecto aiiC 50 del extracto etanólico (50%) del tallo,

mas aun si nuestra muestra estudiada es considerada como una maleza.

En sentido contrario la extracción acuosa nuevamente tiene un

comportamiento menos efectivo frente a este radical, diversos estudios

mediante este mismo tipo de extracción ratifican este comportamiento.

PIÑEIRO (2005) en su investigación para la obtención de catequina mediante

diversos tipos de solventes sometidas a una variedad de tratamientos térmicos

reporta al solvente acuoso como el menos efectivo en cuanto a la obtención de

este flavanol.

Aunque hay que recalcar que determinadas partes (raíz y tallo)

sometidas a extracción acuosa reportan valores altos de IC50 . Estos resultados

podrían tener su explicación en el tiempo del tratamiento térmico. Goh (2003)

 59

citado por CARRIÓN (2008) indica que la liberación de antioxidantes en las

hojas aumenta con el tiempo de calentamiento requiriéndose como máximo 15

minutos. El tiempo al que fue sometida las partes de nuestra planta en estudio

fue de 1O minutos.

En cuanto a la absorbancia seleccionada para esta prueba

SANDOVAL, et al. (2001) menciona que la oxidación producida por el radical

ABTS tiene su máxima absorbancia a 414 nm. Por otro lado de acuerdo a las

experiencias de trabajo en el laboratorio se puede afirmar que este radical es

muy inestable además de reaccionar rápidamente al estar en contacto con la

sustancias antioxidante. Según OZGEN, et al. (2006) la inestabilidad se debe al

PH indicando que el PH 4.5 es el adecuado para determinar la capacidad

antioxidante utilizando al radical ABTS. En lo referente a la rápida reacción

Pokorny, et al.(2001) menciona que el ABTS es mas reactivo que el DPPH y

que su reacción transcurre completamente en 1 minuto. Este tiempo de

reacción podría estar influenciada por el tipo de muestra antioxidante,

finalmente esta alta reactividad del presente radical influye directamente en la

obtención del ICso.

4.3. Extracto atomizado

Cuadro 9. Capacidad antioxidante de la muestra atomizada expresada en ICso.

Muestra atomizado ICso (ug/ml) % Inhibición

Parte aérea 10.31 ±0.31 89.90±1.63

El valor IC50 es el promedio (n=3 +SE). El% de inhibición esta dado a 10ug/ml.
 60

Como se observa en la figura 1O, en el proceso de atomización la

muestra después de ser sometida a una extracción acuosa es filtrada con el

objetivo de separar los sólidos presentes y de esta manera el líquido restante

ser conducido hacia el atomizador dando como resultado partículas muy finas y

homogéneas.

BARBOSA-CANOVAS y VEGA-MERCADO (2000) mencionan que

el producto que primeramente se encuentra en estado líquido es transformado

en gotas y luego en partículas secas mediante un flujo de aire caliente. En el

mismo sentido SHARMA et al., (2003), indica que estas gotitas proporciona una

extensa área superficial para la transferencia de calor y masa haciendo por lo

tanto que el enfriamiento por evaporación, el tiempo de residencia corto

mantienen una temperatura baja al producto dando como consecuencia un

producto altamente concentrado en solutos. Esta teoría da la explicación del

por que el ICso obtenido del producto atomizado (1 0.13 ug/ml) según el

cuadro1 O y (Anexo-V) siendo su contenido IC50 similar al liofilizado de la

Uncaria Guianensis pero siendo mayor con respecto Uncaria Tomentosa

quienes reportan ICso de 12.6 y 20.8 ug/ml respectivamente, ambas especies

de uña de gato estudiadas por SANDOVAL et al,. (2001).

 61

4.4. Contenido de polifenoles totales

Cuadro 1O. Contenido de Polifenoles de la muestra atomizado.

Muestra atomizado Polifenoles (mg eqCat/g)

Parte aérea 68.08 ± 0.00

La mayoría de las especies vegetales poseen sustancias

polifenolicas, la cantidad se puede deberse a la exposición a la luz. Se han

realizado una serie de investigaciones para determinar la influencia de luz en la

formación de los anillos A y B de los flavonoides llegándose a la conclusión de

que la luz influye en la producción de ambos anillos (SALYSBURY y ROSS;

2000). Este mismo autor confirma esta versión al evaluar el contenido de

polifenoles en manzanas expuestas al sol frente a las que estaban en la

sombra, determino que la influencia de la luz es fundamental para la actuación

de la enzima chalcona sintasa que es precursor de los anillos A y B,

anteriormente mencionados.

Entonces llegamos a la conclusión de que la luz solo acelera la

acción de la enzima chalcona sintasa pero no al origen de la formación de

estos compuestos polifenólicos en las plantas. SALYSBURI y ROSS (2000)

mencionan que estos compuestos se componen siguiendo la ruta del acido

shikímico donde predominan dos compuestos fosforilados básicos. Aunque

esta afirmación en cierta manera es refutada por PIÑEIRO, (2005) indicando

que para la acumulación de estos compuestos polifenólicos como productos

finales es necesario tener en cuenta los azucares naturales propios de la planta

 62

que posteriormente van a seguir dos rutas bioquímicas, la del shikímico y

acetato creándose una ruta intermedia entre ellas que es la que genera una

gran cantidad de flavonoides. Ahora el mecanismo de absorción de estos

compuestos antioxidantes esta aun en estudio. WALLE (2004), menciona que

las reacciones biológicas de los flavonoides que se ingieren en la dieta en

forma de glicósidos es altamente complejo y depende de un alto número de

procesos.

Otro punto a resaltar es la temperatura de extracción porque de

todas maneras influye en el contenido final de polifenoles totales sabiéndose

que todos los productos de origen natural sufren la pérdida de sus compuestos

bioactivos aunque también es necesario para la inhibición de algunas enzimas

que van a degradar a los polifenoles (POKORNY et al., 2001). En base a estos

puntos PIÑEIRO (2005) señala que la temperatura de extracción es un factor

crítico ya que esta es selectiva y además rompe la unión del analito a encontrar

con la matriz.

El contenido de polifenoles totales encontrados en el producto

atomizado fue 68 mg eq.CAT/g atomizado (Cuadro 11). RUIZ (2004) en sus

estudios a la hierba Luisa (Cymbopogon citratos staph) reporta un contenido

de 1.018 g de AGE/100g del mismo modo RAMOS (2005) encontró que el

contenido de polifenoles totales del matico (Piper aduncum) recolectadas de

seis diferentes lugares en la provincia de Leoncio Prado estuvo entre 2.44±

0.06 a 4.94± O. 05mgcat/g seca mientras que CAMUSSONI y CARNEVALLI

(2004) mencionan que el contenido promedio de polifenoles en los vinos tintos

 t

63

argentinos es 1906 mgAGE/1. Observando todos estos resultados se puede

afirmar que la muestra atomizada se presenta como un excelente poseedor de

polifenoles frente a las especies de hierba Iuisa y matico pero siendo superado

muy largamente por el contenido de los vinos tintos argentinos. Por otro lado

MARTÍNEZ (2007) menciona que la cantidad de polifenoles totales encontrados

en las semillas del heliocarpus terebinthinaceus reportaron una cantidad de:

111.59, 128.87, 65.18 mgAGE/g para los extractos con Acetato de Etilo,

Acetona y Metano! respectivamente. Estos reportes indican que los extractos

trabajados con los dos primeros solventes tienen en su haber una alta

presencia de polifenoles totales llegando incluso a ser el doble con respecto a

la muestra atomizada. MARTÍNEZ (2007) resalta a la acetona como el

compuesto que tiene la capacidad de donar con mayor facilidad hidrógenos

además de presentar una alta polaridad debido a su estructura.

En consecuencia es recomendable consumir alimentos con un alto

contenido de polifenoles los cuales en su mayoría son frutas y vegetales.

Finalmente POKORNY et al., (2001) menciona que la presencia de

polifenoles en la dieta humana resulta de mucha importancia ya que aparte de

ser un excelente captador de radicales libres se desempeña con mucha

eficacia contra el dimero NF-KB que es el que controla la expresión de los

genes en la arteriosclerosis. En consecuencia es recomendable consumir

alimentos con un alto contenido de polifenoles los cuales en su mayoría son

frutas y vegetales.
 64

De igual manera que en las anteriores pruebas antioxidantes la

longitud de onda a la cual se trabaja es fundamental. Diversos autores reportan

sus investigaciones en base al contenido de polifenoles totales con una

absorbancia entre 700 y 750 nm. MARTINEZ (2007) expresa que los

polifenoles se oxidan fácilmente con el Molibdato formando oxido de Molibdeno

el cual origina una coloración azul siendo detectado a una absorbancia de 750

nm. En nuestro caso la determinación del contenido de polifenoles fue a una

absorbancia de 700 nm. Finalmente la cantidad de polifenoles esta relacionado

directamente con los grupos hidroxilos que posee en su estructura el

compuesto fenólico predominante (OZGEN, et al. 2008).

4.5. Cuantificación de catequina mediante HPLC

Cuadro 11. Contenido de catequina de la muestra atomizada.

Muestra atomizado Catequina (mgCat/g)

Parte aérea 6.343± 0.013

Dato expresado de acuerdo al promedio de tres repeticiones

El cuadro reporta a la parte aérea atomizada mediante extracción

acuosa con una cantidad de 6.343±0.013mg cat/ g atomizado. La Uncaria

Tomentosa y Gui~Qff'nSi$ contienen 8,47±0.1 y 5.53±0.07 de mg cat/g

liofilizado r~,8~q~,iy~rn~nte para cada u,~,~ qe ellas (SANDOVAL et a/., 2001).

Confrontando estos resultados se puede afirmar que el contenido de

catequina de la muestra atomizada siendo aun considerada como una maleza

es muy aceptable ya que se sitúa entre las dos especies de uña de gato.
 65

Por otro lado UN et al., (1998) mencionado por RAMOS (2002) en

sus estudios a varios productos de te verde chino y japonés resalta a Bei-Jing

Mo-Li-Hua y Osaka-Fu con 22,18± 0.97 y 8.92±0.86 mg catequina/100mg de

hoja seca, siendo los de mayor y menor contenido de catequina

respectivamente. La primera especie de te mencionada resulta ser superior

respecto a la muestra atomizada mientras que en cuanto a la presencia de

catequina en la segunda variedad se puede mencionar que su contenido es

similar. En el mismo sentido las especies de te verde Xin-yang-mao-jian y Yun-

nan-lu-cha reportaron un excelente contenido de catequina con un total de

14.44 y 12, 69 mg 1 100g de hoja seca frente a las demás variedades de te

oolong y negro estudiadas CHEN et al., (2001) mencionado por el mismo

RAMOS (2002). Para este caso la muestra atomizada equiparándolo con los

otros tipos de te oolong y negro ostenta una cifra superior de catequina siendo

solamente sobrepasado por las dos especies de te verde.

Finalmente es necesario mencionar que una de las variantes que

influyen en el contenido de catequina del extracto atomizado se puede deber a

que el tratamiento térmico se realizó en presencia de oxigeno. (PIÑEIRO, 2005)

menciona que las catequinas son compuestos fácilmente oxidables en

presencia de oxigeno de igual manera agrega que la temperatura influye

considerablemente sobre la selectividad que puede tener el fluido extractante.

Por otro lado cabe señalar que la absorbancia referente a esta

prueba es más selectiva y especifica. De acuerdo a DING, et al.(1999) la

catequina se absorbió de una mejor manera a 21 O nm y que a lecturas

diferentes a esta, otros compuestos presentes en la muestra atomizado podrían

 66

interferir para determinar el contenido final de esta especie de flavonoides.

PINEIRO, (2005) se manifiesta de manera diferente indicando que la catequina

tiene su máximo punto de emisión a 320 nm y de excitación a 290 nm.

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Figura 14. Cromatograma de la muestra estándar de Catequina.

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Figura 15. Cromatograma de la muestra atomizada analizada.

 67

4.6. Análisis Sensorial

4.6.1. Atributo Sabor

Cuadro 12. Resultados del análisis estadístico con

respecto al atributo sabor.

*Evaluaciones Promedio

c1 (1.5mg/ml) 6.647± 1.846 a

c2 (2.5mg/ml) 6.093± 2.175 ab

c3 (3.5mg/ml) 4.550± 3.617 b

* La formulación de las concentraciones se detallan en la metodología

de análisis sensorial.

Los resultados obtenidos del análisis de varianza (Anexo-IXa)

mostraron diferencia significativa (p< 0.01) con respecto al promedio de las

opiniones expresadas por el total de los panelistas mientras que los datos

presentados en el cuadro 12 indican a las concentraciones C1 y C2 como

estadísticamente iguales existiendo solamente diferencia entre C1 y C3.

VARGAS (1999) encontró diferencia significativa (p< 0.05) en cuanto a las

diferentes mezclas de uña de gato y jarabe simple presentadas como bebida

siendo las formulaciones con 0.05% de extracto concentrado y 58, 56% Brix las

que se reportaron con mayor aceptabilidad por parte de los panelistas. Del

mismo modo QUISPE (2003) menciona la existencia de diferencia altamente

significativa para los diferentes tratamientos, reportándose como el mejor

tratamiento a la sustitución con 60% de manteca de palma y 75% de agua. Por

otro lado MIRANDA et al., (2007) indica que la población encuestada devolvió

un valor promedio de 6 correspondiente a la categoría "Me gusta mucho" en

 68

cuanto a su bebida fermentada. Este valor es semejante a los tratamientos C1

y C2 según el cuadro 12 estando muy cerca del rango "Me gusta mas o

menos".

4.6.2. Atributo olor

Cuadro 13. Resultados de los análisis estadísticas

con respecto al atributo olor.

* Evaluaciones Promedio

c1 (1.5mg/ml) 6.487± 2.935a

c2 (2.5mg/ml) 6.413± 2.249a

c3 (3.5mg/ml) 6.193± 2.466a

* La formulación de las concentraciones se detallan en la

metodología de análisis sensorial.

Los resultados presentados en el Anexo-IXb con respecto al

análisis de varianza reportan la no presencia de diferencia significativa

concerniente a este atributo. De igual manera ARCILA y MENDOZA; (2006) y

QUISPE (2003) no encontraron diferencia significativa con respecto a los

resultados conseguidos del integro de panelistas que evaluaron esta particular

característica en sus trabajos sobre Elaboración de una bebida instantánea a

base de semillas de amaranto y Helado con sustitución parcial de manteca de

cerdo, respectivamente. Muy por el contrario RAMOS (2002) menciona la

presencia de diferencia significativa para las diferentes formulaciones de una

bebida a base de te verde y hierba Iuisa siendo la mezcla con la misma

cantidad de ambos ingredientes como el de mayor acogida.

 69

4.6.3. Atributo color

Cuadro 14. Resultados de los análisis estadísticas

con respecto al atributo color.

* Evaluaciones Promedio

c1 (1.5mg/ml) 6.537±1.938 a

c2 (2.5mg/ml) 6.242 ± 2.608a

c3 (3.5mg/ml) 6.447 ±3.102a

*La formulación de las concentraciones se detallan en la metodología

de análisis sensorial.

De acuerdo a RAMOS (2002) en lo que atañe a esta categoría

evaluada reporta diferencia significativa (p<O.OS) para las diferentes

formulaciones de una bebida a base de te verde y Hierba Luisa. Este resultado

difiere de los datos conseguidos a partir del análisis de varianza (Anexo-IXc) en

el cual declara la no existencia de diferencia significativa, en el mismo sentido

QUISPE (2003) resalta la presencia de esta misma diferencia no significativa

en lo correspondiente a su prueba de Elaboración de Helados con sustitución

de manteca de cerdo en cuatro diferentes tratamientos. De igual manera

ARCILA y MENDOZA (2006) mencionan igual significancia en lo concerniente a

esta misma categoría evaluada en cuanto a sus diferentes formulacione,~. Por

otro lado el color distintivo de nuestra bebida expuesta resulto ser marrón

RAMOS (2002) añade que este particular se debe a la oxidación de las

catequinas.
 V. CONCLUSIONES

- La capacidad antioxidante de la raíz, hoja, tallo y parte aérea expresada

en IC50 ug/ml mediante extracción acuosa frente al radical DPPH fueron

los siguientes: 276.271 ±0.564, 207.131 ±0.574, 400.131 ±0.574,

413.687±1.698 ug/ml y en cuanto al peróxilo fueron: 46.920±0.390,

251.599± 1.076, 32.370±0.705, 357.149±0.734ug/ml respectivamente.

- Por otro lado la capacidad antioxidante expresada en ICsoug/ml de las

mismas muestras pero mediante extracción etanólica al (50%) frente al

radical DPPH resultaron: 378.112±0.516, 418.654± 1.950, 398.977±

0.449, 124.246± 1.260 ug/ml y con respecto al radical peróxilo se

reportaron los siguientes: 37.209±0.069, 104.322± 1.710, 25.43±1.398,

39.17±0.833 respectivamente para cada una de ellas.

- El extracto etanólico (50%) se comportó como el más activo.

Se realizó el proceso de atomizado a la parte aérea de la planta,

eligiéndola por su fácil recolección y económica.

- El valor ICso del producto atomizado fue de 10, 13±0.30 ug/ml.

- El contenido de polifenoles totales expresado en mg eq Cat/g atomizado

fue 68.08.
 71

La cuantificación de catequina mediante el sistema HPLC fue de 6.34 ±

1.034 mg cat/g atomizado.

- En cuanto al análisis sensorial, las pruebas concernientes a los atributos

de sabor, color y olor del producto atomizado expresaron diferencia

significativa en cuanto al primer atributo y no presencia de diferencia

significativa en cuanto a los restantes.

 VI. RECOMENDACIONES

Realizar el respectivo análisis toxicológico in vivo en animales de

laboratorio (ratones y cuyes) para descartar la presencia de compuestos

nocivos.

Determinar la composición específica de otros compuestos polifenólicos

mediante el sistema HPLC.

Evaluar la capacidad antioxidante frente a otros radicales libres como el

anión superóxido e hidroxilo.

Evaluar la capacidad de retardar la oxidación lipídica en alimentos

grasos.
 VIl. ABSTRACT

The present research was developed in the Research Center of Natural

Products of the Amazonía (CIPNA)- UNAS. The objectives were to determine

the antioxidant capacity in the root, leaf, stem and aerial part opposite to the

radical DPPH and peróxilo by means of watery extraction and etanólica (50%);

determine the solvent with more active behavior; realize a process of

atomization to the organ of the plant with best antioxidant capacity; determine

the IC50 (ug/ml) of the atomized product; evaluate the content of total

polyphenols and quantification of catequina in the atomized and to realize the

sensory analysis. The used raw material they were plants of

Pseudoelephantopus spicatus. The results were expressed as mean± SEM, for

statistical analysis was used the design complete block at random (DBCA) with

arrangement factorial and the Tukey test (p<0,05). The antioxidant capacity of

the root, leaf, stem and aerial part by aqueous by means of watery extraction

opposite to the radical DPPH it was (276.271±0.564, 207.131±0.574,

400.131±0.574, 413.687±1.698 ug/ml) and the peróxilo (46.920±0.390,

251.599±1.076, 32.370±0.705, 357.149±0.734 ug/ml); the antioxidant capacity

by extraction etanólica (50 %) opposite to the radical DPPH was

(378.112±0.516, 418.654±1.950, 398.977±0.449, 124.246±1.260 ug/ml) and

 74

the peróxilo ( (37.209±0.069, 104.322±1.710, 25.43±1.398, 39.17±0.833); the

extract etanólico (50%) was the most active; lt was realized atomized to the air

part, atomized product ICSO value (10, 13±0.30 ug/ml); the content of total

poliphenols (6.34±1.034 mg cat/g); the quantification of catequina (6.34±1.034

mg cat/g); in the sensory analysis, the tests of the attribute flavor presented

significant difference but not the color and smell.

 VIl. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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VIII. ANEXOS
 85

Anexo-l. Muestra del diseño en bloque completo al azar {DBCA) con arreglo

factorial utilizado para las pruebas DPPH y peróxilo.

a. Distribución de los factores y niveles para su codificación

Factor Niveles Símbolo código

Raíz 1 a1

Hoja 2 a2
a
Tallo 3 a3

Parte aérea 4 a4

Agua 1 b1
b
Etanol {50%) 2 b2

b. Descripción del emparejamiento de los factores y niveles

mediante su codificación.

Partes/solvente Agua Etanol (50%)

Raíz a1b1 a1b2

Hoja a2b1 a2b2

Tallo a3b1 a3b2

Parte aérea a4b1 a4b2

 86

Anexo-11. Análisis estadístico con respecto a la prueba DPPH.

a. Análisis de varianza de acuerdo a las partes de la planta y solvente.

Fuente de variación GL se CM FC Sig

Parte 3 53025.23 17675.07 3809.89 **

Solvente 1 202,4029 202,4029 43,6283 **

Parte*solvente 3 208429,14 69476,38 14975,76 **

Error 16 74,228057 4,639253

Total 23 261731,018

b. Múltiple comparación de los promedio IC50 para las partes de la planta.

Partes Promedio sig

Raíz 327.19 e
Hoja 312.66 b

Tallo 399.55 d

Parte aérea 268,97 a

c. Múltiple comparación de las medias de los tipos de extractos.

Solvente Media sig

Agua 324.1891 a

Etanol (50%) 329.9972 b

 87

d. múltiple comparación de los tratamientos por 1Cs0 .

Tratamiento parte extracción ICso sig

4*2 p. aérea etanólica (50%) 124.25 a

2*1 hoja etanólica (50%) 206.67 b

1*1 raíz acuoso 276.27 e

1*2 raíz etanólico (50%) 378.11 d

3*1 tallo acuoso 398.98 e

3*2 tallo etanólico (50%) 400.13 e

4*1 p. aérea acuoso 413.69 f

2*2 hoja etanólico (50%) 418.65 f

 88

Anexo-111. Análisis estadístico con respecto a la prueba peróxilo.

a. Análisis de varianza de acuerdo a las partes de la planta y solvente.

Fuente de variación GL se CM FC Sig

Parte 3 141422,641 47140,880 15864,099 **

Solvente 1 87089,8114 87089,811 29307,926 **

Parte*solvente 3 97326,5044 32442,168 10917,611 **

Error 16 47,5447133 2.9715445

Total 23 325886,501

b. Múltiple comparación de los promedio IC50 para las partes de la planta.

Partes Promedio sig

Raíz 42,066 b

Hoja 177,960 e

Tallo 28,9 a

Parte aérea 198,159 d

 89

c. Múltiple comparación de las medias de los tipos de extractos.

Solvente Media sig

Agua 172,0106 a
Etanol (50%) 51,53258 b

d. múltiple comparación de los tratamientos por IC50 .

Tratamiento parte extracción ICso sig

3*2 tallo etanólico (50%) 24,43 a

3*1 tallo acuoso 32,37 b

1*2 raíz etanólico (50%) 37,208 be

4*2 p. aérea etanólico (50%) 39,17 e

1*1 raíz acuoso 46,92 d

2*2 hoja etanólico (50%) 104,321 e

2*1 hoja acuoso 251,599 f

4*1 p. aérea etanólico (50%) 357,149 g

 90

Anexo-IV. Hoja de calificación para la prueba de análisis sensorial.

Nombre del juez:._ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ Fecha.:...:_ _ __

Muestra evaluada: bebida filtrante a partir del atomizado del

Pseudoelephantos spicatus

Marque con un aspa (X) sobre la línea de acuerdo a su juicio para cada uno de
acuerdo a los atributos organolépticos

Me desagrada Me agrada Me agrada

Escala
Muchísimo mas o menos muchísimo

l 1 1
Sabor 1 1 1

1 1 1
Olor 1 1 1

L 1 1
Color 1 1 1
 91

Anexo V. Curva para el cálculo del coeficiente de Inhibición ICso de la muestra

atomizada.

100
90
E
e 80

-
11)
1 1)
ca
70
60
·aeca 50 y =2,367x + 20,615
40
ca R2 =0,9735
-eo 30
al 20
1i 10
o
o 5 10 15 20 25 30 35
ug/ml

Anexo-VI. Curva de calibración para cuantificar polifenoles totales.

1,6
1,4
E
e 1,2
o
~ 1
ca
ca 0,8
'(3 y =O,OOOSx + 0,0427
e R2 = 0,9957
ca 0,6
-eo 0,4
.Q
ca
0,2
o
o 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
uM
 92

Anexo-VIl. Curva de calibración para la cuantificación de catequina mediante el

sistema HPLC.

Curva de calibración Estándar

Niveles uM ug/ml Área mUA tr

o o o o o o
1 50 14.515 173175 13.284 7.363
2 100 29.03 377015 28.978 7.362
3 200 58.06 662806 51.256 7.360
4 300 87.09 934858 73.440 7.358
5 500 145.15 1520176 117.249 7.362

140 140
120 120
y = 0,2324x + 2,8195 y = 0,8006x + 2,8195
100 RZ =0,9973 100 RZ =0,9973
80 80
~
:::;) ~
E 60 E 60

40 40
20 20
o o
o 200 400 600 o 50 100 150
Con(uM) Con (ug/ml)

Análisis de catequina de la parte aérea atomizada

Muestra atomizada F.O. Área mUA tr mgCat/gatom

Acuoso-01 15 243839 36.700 7.192 6.3478

Acuoso-02 15 245998 36.785 7.19 6.3637
Acuoso-03 15 255400 36.543 7.187 6.3184
Promedio 6.3433
so 0.0230
SE 0.0132
 93

Anexo-VIl l. Análisis de varianza con respecto a las pruebas de análisis

sensorial.

a. atributo sabor.

Fuente de variación GL se CM FC Sig

Tratamiento 2 70.840 35.420 5.0054 0.0087

Error experimental 87 615.643 7.0764

Total 89 686.489

b. atributo olor.

Fuente de variación GL se CM FC Sig

Tratamiento 2 1.3982 0.6991 0.1061 0.8994

Error experimental 87 573.068 6.5869

Total 89 574.466

c. atributo color.

Fuente de variación GL se CM FC Sig

Tratamiento 2 1.3715 0.6857 0.1019 0.9032

Error experimental 87 585.387 6.7285

Total 89 586.756