DR.

PEDRO SÁNCHEZ CRUZ

ORGULLOSAMENTE POLITÉCNICO
MATERIAL PARA PROPÓSITOS EDUCATIVOS SIN FINES DE LUCRO
 Reconocer la importancia de las técnicas inmunológicas especializadas
inmunohistoquimica en el diagnóstico inmunológico, a través del
análisis de las características de la reacción antígeno-anticuerpo y de
las diferencias de las técnicas que les permitan ser utilizadas en
diferentes pruebas diagnósticas.

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 GENERALIDADES
➢ Las técnicas de IHQ son un grupo de procedimientos inmunoenzimáticos
capaces de reconocer varias sustancias (Ag) en células y tejidos.
➢ La introducción de enzimas marcadores de Ac han hecho de la IHQ un método
muy importante para el diagnóstico y la investigación.
➢ La técnica en sí se basa en la habilidad de los Acs par unirse a específicamente a
su Ag correspondiente.
➢ Se usa un cromógeno para visualizar esa unión.
➢ Búsqueda de mayor sensibilidad y especificidad.
➢ Reacción Antígeno - Anticuerpo.

➢ Detectar la unión Ag-Ac mediante un sistema de visualización.

➢ Existen diversos tipos de técnicas cuya indicación va a depender de:

▪ Anticuerpo a utilizar: mono o policlonal
▪ Material disponible: fresco, congelado o fijado en formalina
▪ Antigenos a estudiar: de superficie o membrana citoplasmática o nucleares.
I. Patología tumoral.

Neoplasias: Formación anormal en alguna parte del cuerpo de un tejido nuevo de

carácter tumoral, benigno o maligno.

II. Enfermedades de patogenia inmune.

Útiles en el seguimiento de trasplantes, patología pulmonar, tiroidea y patología

ostearticular.

III. Enfermedades infecciosas.

Adenovirus, Citomegalovirus, Herpes simple, Hepatitis B, HPV.

Otros utilizados son Toxoplasma spp., Pneumocystis spp., Chlamydia spp.

Desparafinar e Hidratar

Bloqueo de la tinción de fondo

Bloqueo de la actividad enzimática

endógena

Desenmascaramiento antigénico

Anticuerpo primario

Anticuerpo puente

Marcador

Revelador de la tinción

Contratinción

Deshidratar y montar
Desenmascaramiento antigénico
La fijación química del tejido en formol u otro fijador, se basa en la creación de un
complejo entramado proteico que “enmascara” nuestro epítopo a marcar.

Para obtener una buena reacción entre Ag-Ac, será preciso realizar
desenmascaramiento.

Métodos de desenmascaramiento antigénico

Los métodos mas usados son: la digestión enzimática y mediante calor.

➢ ENZIMAS PROTEOLÍTICOS:
Rompen los enlaces proteicos mediante digestión enzimática de los mismos. Ejemplo Tripsina,
Pepsina, Proteinasa K entre otros.
Desventajas:
▪ Se benefician pocos anticuerposde este método.
▪ Es difícil de reproducir (variaciones en el tiempo de fijación).
▪ Hay que adaptar la concentración, pH, temperatura, y tiempo.

➢ MEDIANTE CALOR:
La acción del calor, junto con soluciones de tampones de pH básico.
Apto para desenmascaramiento de antígenos tanto citoplasmáticos como nucleares. (No válido para
Ag temolábiles).
Desventajas:
▪ Demasiado tiempo de inducción de calor disminuye la antigenicidad de los tejidos.
▪ Puede dificultar la contratinción.
▪ Utilizar soluciones de pH muy ácido pueden dar falsos positivos.
 Tipos de aparatos utilizados:
➢ MICROONDAS: Fue el primer método que se utilizó, pero debido a que la temperatura es
poco estandarizable, está prácticamente en desuso.
Equipo y Materiales
a) microondas
b) tampón de desenmascaramiento (buffer citrato, EDTA)
c) gradillas para microondas
d) portas silanizados
Procedimiento
Poner tiempos exactos a máxima potencia. Normalmente se repiten 2 o 3 ciclos de 4 a 6
minutos.
➢ OLLA A PRESION: Estandarizan mejor la temperatura.
Alcanzan temperaturas superiores a la ebullición (130º).
Ventajas:
No les afecta el nº de portas ni el tamaño de las gradillas.
Ofrece uniformidad de Tª.
No existe evaporación y no es preciso repetir el proceso.
➢ Diversos experimentos pudieron demostrar que el citrato sódico era la mejor
solución de desenmascaramiento como norma general.

➢ Se puede concluir de igual manera la importancia que tiene la molaridad y el

pH, para lograr una buena solución de desenmascaramiento.
Los métodos de tinción IHQ utilizan reacciones de enzima con un sustrato para
convertirlos de cromógeno incoloro en un producto final coloreado.

Las enzimas mas ampliamente utilizadas son:

Peroxidasa Fosfatasa alcalina

➢ La peroxidasa es una enzima capaz de reducir el peroxido de hidrógeno en
agua y un oxígeno libre.
➢ En presencia de ciertas sustancias (cromógenos) esta reacción da lugar a un
depósito coloreado.
➢ La actividad peroxidasa endógena del tejido debe ser previamente bloqueada
mediante un exceso de peróxido de hidrógeno.
➢Primero provoca la formación de un complejo de sustrato-enzima y luego genera la
oxidación del donante de electrones (cromógeno) produciendo color.

➢Algunos cromógenos utilizados son:

▪DAB (diaminobenzidina).
▪AEC (3-amino-9-Etil-Carbazol).
➢ Da una coloración marrón altamente insoluble en alcohol y xilol.
➢ Los portas pueden ser deshidratados y montados con medios de montaje
convencional.
➢ Tras la oxidación forma un producto final de coloración rosa, soluble en alcohol.
➢ Utilizaremos un medio de montaje acuoso.
➢ Una exposición excesiva a la luz mermaría la intensidad de la tinción.
➢ La fosfatasa alcalina elimina y transfiere grupos fosfato de ésteres orgánicos,
creando un enlace temporal intermedio de sustrato-enzima.
➢ La ventaja principal es la ausencia de interferencia de la peroxidasa
endógena.

➢ Debido a la poca cantidad de fosfatasa alcalina en los tejidos, no es necesario

inhibir su actividad endógena.

➢ Los cromógenos mas utilizados para fosfatasa alcalina son:

▪ Naftol As-Mx Fosfato

▪ Nueva Fuchsina
➢ La búsqueda de técnicas lo más sensibles posibles, han llevado a desarrollar
distintos métodos:

▪ Método directo.
▪ Método indirecto en dos pasos
▪ Método indirecto en tres pasos
▪ Avidina-biotina
▪ Lsab
▪ Envision
▪ Doble tinción
➢ Es una vieja técnica, en la que el Ac primario es marcado por una enzima y
reacciona con el Ag en el tejido, siendo rebelado por un cromógeno.
➢ Es muy poco sensible. Es la IHQ “primitiva”.

Método Directo: Unión de un anticuerpo primario (2) conjugado

con una enzima (3), con la consiguiente formación del
anticuerpo primario conjugado, que se une al antígeno (1)
➢ En este método un Ac primario se une al Ag. Un Ac secundario marcado con
una enzima dirigida al Ac primario (ahora ya antígeno marcado), por último el
cromógeno.

Método Indirecto de dos pasos:

El anticuerpo primario (2) unido al antígeno
(1) se revela a través de un anticuerpo
secundario (3), previamente conjugado
con la enzima (4).
➢ Esta técnica desvela una mayor sensibilidad IHQ, ya que inserta un Ac terciario
(anti Ig del Ac secundario) que amplifica la señal.

Método Indirecto de tres pasos: Anticuerpo

terceario (5) conjugado con una enzima (6),
reacciona con un anticuerpo secundario (3)
conjugado con otra enzima (4), previamente
unido al anticuerpo primario
➢ Esta técnica se basa en la gran afinidad que poseen entre si las moléculas de
biotina y las de avidina.
➢ Avidina (Glucoproteína de alto Pm, presente en la clara de huevo).
➢ Biotina (Vitamina de bajo Pm que se encuentra en la yema del huevo).

El sistema avidina- biotina, debido

a su gran afinidad entre ellos,
puede ser utilizado como una
técnica muy estable de marcaje
Ag-Ac.
➢ El procedimiento es idéntico al anterior, excepto por el empleo de la
streptavidina diluida marcada con la enzima.
➢ Utiliza una molécula de dextrano inerte, en forma espinal, marcada por
una enzima.
➢ El Ac primario es conjugado al dextrano marcado por la enzima, reduciendo
la técnica a un solo paso.
➢ Esta técnica inhibe el paso de streptavidina-biotina, eliminando la tinción
inespecífica.
➢ Se utiliza en primer lugar como trazador de enzimas endógenas la peroxidasa,
el DAB como cromógeno revelador.
➢ En segundo lugar se utilizará la fosfatasa alcalina y como cromógeno de la misma,
rojo permanente, creando un claro contraste de coloración parduzca-rojiza.
Inmuno teñidores automáticos: permite Kits universales de Bloqueo de la tinción de fondo:
introducir los portaobjetos con las inmunohistoquímica: Incubando los cortes con un
secciones de tejido, previamente Conjunto de reactivos utilizados en el anticuerpo que no interfiera con el
etiquetados y con códigos de barras proceso de inmunotinción. El 85% de los Ac primario o en altas diluciones;
para su identificación a través de un kits empleados son los de añadiendo bloqueantes proteicos
lector. estreptavidina-biotina-peroxidasa o de la tinción a utilizar.
fosfatasa alcalina.
Anticuerpo Primario:
Desenmascaramiento antigénico o Inmunoglobulina que se une
específicamente a una proteína
recuperación antigénica: El proceso por
el que se consigue desenmascarar los
Conceptos o molécula, para purificarla y
epítopos para ser reconocidos por posteriormente medirla
anticuerpos Bloqueo de la actividad enzimática
método por el que se consigue inhibir la
actividad de la enzima que se va a
utilizar como marcador con el fin de que
no reaccione con el sustrato por
afinidad. Si no se bloquea esta
actividad, se inducirá a error por la
obtención de falsos positivos.
1. Visualizar en donde se produjo la
unión antígeno-anticuerpo es
necesario emplear un trazador o
marcador.
2. Fluorocromos, inmunofluorescencia.
(Fluoresceína y Rodaina)
3. Técnicas inmunoenzimáticas
(proxidasa y fosfatasa alcalina).
4. Iones metálicos en forma coloidal
(técnica de inmuno-oro). Oro coloidal
Se realizan para asegurar que no haya falsos negativos o positivos
➢ Los negativos incluyen una omisión del Ac primario o la sustitución del mismo por suero
no inmune o solución isotónica. Estas sustancias alternativas (no inmunes) no van a
reconocer al Ag a estudiar, pero si serán reconocidas por el Ac secundario o puente. Se
utiliza el mismo tejido que para el control positivo y si el resultado es positivo será
debido a una fijación inespecífica.
➢ Los positivos se llevan a cabo utilizando una sección de tejido que incluya el Ag a
demostrar de forma que si el resultado es negativo la causa es un defecto de fijación o
un error en el procedimiento. Es el de uso más extendido y se utiliza en todas las
preparaciones.
➢ El control de absorción consiste en demostrar que desaparece la inmunorreactividad
una vez el Ac primario con el Ag se hallan unido. Se utiliza para valorar nuevos Ac No es
una técnica de control que se haga muy rutinariamente.
Método inmunohistoquímico directo: este
método se refiere al anticuerpo específico contra
la sustancia que se quiere detectar. Está
marcado con partículas detectables al
microscopio.
Método inmunohistoquímico indirecto:
El antisuero primario no está marcado y es
detectado posteriormente mediante un antisuero
secundario marcado obtenido frente a Ig de la
especie en la que se ha obtenido el primario.
➢ Consiste en la utilización de un Ac
puente frente al Ac primario y después
los complejos PAP, constituidos por
tres moléculas de peroxidasa y dos de
Ac antiperoxidasa.
➢ Este método actualmente está en
desuso.
➢ Consiste en la utilización de un Ac
puente frente al Ac primario y des-
pués los complejos PAP, constituidos
por tres moléculas de peroxidasa y
dos de Ac anti- peroxidasa.

➢ La peroxidasa es sustituida por

fosfatasa alcalina.
➢ Es un método indirecto de tres pasos
en el que se utiliza un antisuero
secundario biotinado.
➢ La amplificación de la señal que se
logra con este método es elevada, ya
que los complejos que se forman son
grandes y contienen múltiples
moléculas de biotina conjugada a
peroxidasa.
➢ Se añaden los complejos ABC-
peroxidasa previamente preparados.
➢ Estos complejos se forman al mezclar
avidina con biotina unida a
peroxidasa en una proporción tal que
algunos de los sitios de unión de la
avidina queden libres para unirse a la
biotina del antisuero secundario.
MÉTODO DEL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA-PEROXIDASA
➢ Es un método similar al ABC, en el
que los complejos ABC son
sustituidos por estreptavidina
directamente conjugada a
peroxidasa.
➢ Los complejos son de menor
tamaño que los del ABC, por lo que
su acceso a la biotina que marca
los Ac secundarios puede ser
mejor.
Inmunohistoquímica

https://youtu.be/SoWhd4k-_O8

https://youtu.be/1_bu_iWaQeE

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