Realización de cultivos celulares.

Cultivo de células eucariotas

Los cultivos celulares permiten evaluar importantes funciones biológicas, como las estructura comportamiento y
patología celular.

Permiten ahondar en la comprensión de las funciones, así como en el estudia del desarrollo normal como de las
enfermedades que presentan las células.

Los primeros cultivos se iniciaron en el s.19 y alcanzaron el máximo nivel en el s.20.

Células Hela, son un linaje celular humano mas antiguo y mas empleado en la investigación. (líneas celulares
inmortalizadas).

El cultivo de células procedentes de insectos Sf9 se emplea para múltiples aplicaciones, pero en especial para el
control de plagas. Además, el cultivo de estas células nos permite el estudio de los procesos celulares básicos,
muchos de los cuales están presentes en eucariotas superiores.

Ventajas :

Estas células crecen fácilmente y no tienen requerimientos tan específicos como las células procedentes de
mamífero. Se pueden cultivar en atmósfera estándar y a temperatura ambiente. Todo ello reduce el coste del
cultivo además de simplificarlo. Estas células se emplean ampliamente en la industria biotecnológica para la
producción de proteínas y virus recombinantes

Crecimiento y mantenimiento de las células en un cultivo

En las células normales que han sido cultivadas tras su siembra estas comienzan a dividirse hasta completar el
espacio que presentan creado una monocapa, mientras que las células cancerígenas presentan inhibición por
contacto, lo que hace que dejen de dividirse y se forma una multicapa, de tal manera que debemos pasar las células
a otro frasco y completar con el medio de cultivo.

Las células en el medio de cultivo presentan varias etapas o fases de crecimiento, la fase latente, fase exponencial,
fase estacionaria y fase de muerte.

- La fase de latencia, es la fase de adaptación en la que el crecimiento es nulo ya que no suele existir una
división. Presentan un índice de confluencia, que es el porcentaje de células que han comenzado a
dividirse en la superficie. En esta fase se deberá encontrar entorno 50% mas o menos.
- Fase exponencial, la célula se encuentra en pleno rendimiento, debido a que existe crecimiento celular y
el número de células aumenta y su índice de confluencia aumenta (50-80%).
- Fase estacionaria, el número de células permanecerá constante, y se deberá sacar una parte de ellas y
meterlas en otra placa, y la otra parte en otra placa diferente. Todas las células morirán a no ser que se les
añada un medio de subcultivo con los nutrientes requeridos. Su índice de confluencia sigue aumentado
(90-100%).
- Fase de muerte, las células mueren.

Obtención de cromosomas
Análisis citogenético

Visualizamos los cromosomas y a partir de ello obtenemos el cariotipo, el cual nos permite saber si existe algún tipo
de anomalía en la estructura de los cromosomas o en el numero de cromosomas existentes.

Existen dos tipos de cariotipos; el constitucional y el hematológico.

• Constitucional, es el presente en todas las células de un individuo, excepto en las células sexuales. Se
mantiene invariable a lo largo de la vida del individuo.
• Hematológico, en los procesos oncohematológicos, la dotación cromosómica de algunos tipos de células
puede variar dependiendo de la evolución del proceso. Se habla entonces de CARIOTIPO HEMATOLÓGICO

Ambos se diferencian en su interpretación en que las cromátidas del constitucional son mas finas y sus bandas son
diferenciables, mientras que en el caso del hematológico es todo lo contrario.
Durante la metafase, los cromosomas alcanzan el mayor grado de condensación lo que facilita su reconocimiento y
análisis, dicha metafase la observamos en las gónadas, medula ósea y trofoblasto.

Tras realizar el cultivo, este se extiende sobre el porta y se comienza a su tinción para realizar el bandeo
cromosómico.

Tipos de cultivos celulares

Según el estado de las células

- Cultivo en suspensión, cultivos de corta duración y no requieren de cambio del medio ya que los
nutrientes no llegan a agotarse.
- Cultivo en monocapa, cultivos de larga duración por lo que hay que cambiar el medio, para ello se
despean las células mediante la tripsina.

Según el mantenimiento del pH

- Cultivos abiertos, las placas Petri, su pH es básico o alcalino, pero presentan mas riesgo de contaminación
y requieren de estar controlando la humidificación y los gases de la incubadora.
- Cultivos cerrados, frascos de roux, menor riesgo de contaminación y son mas sencillos ya que no deben
controlar los gases ni la humidificación, además presentan los HEPES, que amortiguan los cambios de pH.

Según su procedencia

- Primarios, provienen del tejido inicial.

- Secundaros, provienen de un primario, es decir por la resiembra.

Determinación del número de células y de la viabilidad celular

Cantidad de muestra, se deberá ajustar a la densidad celular. Se asume como densidad de la medula ósea
10^6celulas/mL, por lo que deberemos conocer la densidad de la muestra de partida.

Viabilidad celular, se define como el porcentaje de células vivas respecto al de células muertas. Se valora con
colorantes como el azul de tripán o la eritrosina. Las células muertas son adquieren el colorante ya que su
membrana a sido rota mientras que la de las vivas no, impidiendo que entre el colorante en ellas.

Cultivo de linfocitos en sangre periférica

- Obtención de la sangre
- Conservación de la muestra
- Siembra, se realiza con fitohematoglutamina A o PHA
- Sacrificio
- Choque osmótico
- Fijación
- Extensión, es echar varias gotas sobre el portaobjetos
-Húmeda
-Seca
- Tinción, que se realiza con giemsa.

Las muestras deberán procesarse lo antes posible, no deberán congelarse bajo ningún concepto. La sangre debe
recogerse en tubo estéril con anticoagulante HEPARINA DE LITIO o DE SODIO. Nunca debe usarse EDTA, ya que los
iones han de quedar libres.

Si se produce un rechazo de la muestra, puede ser por que hayan sido congeladas o por que den fallo en los cultivos
y deban ser rechazadas.

La cantidad que sembremos se deberá ajustar a las características de cada muestra. Es posible que no exista
crecimiento celular en la muestra cultivada y los fallos puedan ser por diversos motivos. Como medio de cultivo
empleamos el RPMI 1640, cuyo pH es de 7,4 y puede contener o no fitohematoglutamina, que es un factor de
limitante del crecimiento. Si esta no está presente se deberá de añadir. A dicho medio de cultivos como no es
completo debemos de añadirle una serie de complementos.

El ciclo celular de los linfocitos tarda unas 24h en completarse. La primera mitosis tiene lugar a las 48h tras la
adición de PHA. Los ciclos de mitosis se repiten cada 24h, es necesario añadir agentes que detengan las células en
 estado de metafase. El máximo de actividad mitótica se alcanza a las 72h. La detención en ese momento es lo que
se conoce como “sacrificio del cultivo”. Para ello, se utilizan inhibidores del huso acromático, bloqueando el ciclo
celular en metafase. Algunos inhibidores son el colcemid.

Al someter las células a una solución hipoosmótica, el agua pasa de esta solución al interior de las células para
producir el equilibrio osmótico. Esto provoca el estallido de los eritrocitos y la distensión de los leucocitos,
facilitando la expansión de los cromosomas.

Se produce la fijación en la cual los cromosomas, son fijados al material circundante y ayuda a la eliminación del
citoplasma y los restos celulares. El fijador habitual es el Carnoy que se prepara cada vez que se necesita pues hay
que prepararlo en fresco. Se prepara mezclando tres partes de etanol o metanol con una de ácido acético glacial. Se
debe aplicar en frío.

Calidad de la extensión depende de

- La temperatura, puede las bajas temperaturas inhibir la apertura de las metafases.

- Humedad, produce un retraso en el tiempo del fijador.

Evaluación de calidad de las extensiones en función de

- Morfología de los cromosomas, grado de condensación optimo.

- Distribución de los cromosomas en la metafase, deben estar organizados y encontrarse en la metafase
-

Problemas encontrados en la realización de extensiones y sus posibles soluciones

Metafases muy abiertas con dispersión - Demasiadas lisis - Evitar el pipeteado; manejar las
- Secado lento de la muestras con cuidado.
preparación - Reducir la humedad manteniendo la
suspensión a 20°C durante 1h.
- Diluir con fijador
Técnicas de bandeo cromosómico
Las técnicas de bandeo cromosómico originan una serie de marcas en formas de bandas y subsanadas a o lo largo
del cromosoma características de cada cromosoma que permiten su identificación individual y el estudio de la
estructura para determinar la presencia de anormalidades cromosómicas en su estructura.

Técnicas de bandeo.

▪ Bandeo GTG
Es la técnica empleada para la obtención del cariotipo, se emplea un tratamiento de tripsina con una
posterior tinción con Giemsa. La tripsina digiere las proteínas siendo más efectiva en las zonas más
condesadas de los cromosomas lo que se traduce en una tinción más intensa en las regiones
cromosómicas ricas en AT. Estas zonas se asocian a regiones pobres en genes constitutivos. Las regiones
menos condensas quedan representadas de forma más clara, presentando mas guanina y citosina,
además de asociarse a genes constitutivos.
En función del grado de condensación que presenten estos aparecerán de forma más o menos larga sus
brazos. Cuanto mas se condense las bandas se dividirán en subbandas, y cuanto mas largos sean mas
bandas presentaran, y mayor resolución presentaran. La resolución necesaria es de 450-550 bandas, es la
suma de las bandas de los 46 cromosomas del cariotipo humano.
El tiempo al que se encuentre expuesto al tratamiento de tripsina será clave, para obtener la mejor
calidad de las metafases, si es escaso el tratamiento provoca que no aparezcan las bandas, mientras que si
es demasiado tratamiento provocara que el cromosoma se hinche.
▪ Bandeo CBG
Es útil para detectar variantes ocasionales en la morfología. Consiste en un tratamiento de ácido
clorhídrico con hidróxido de bario y una posterior tinción con giemsa. Se emplea para observar la
heterocromatina constitutiva presente en los extremos de los cromosomas.
El tratamiento lo que realiza es digerir el cromosoma a excepción de las zonas donde se encuentra la
heterocromatina constitutiva, que será ahí donde se reflejen las bandas, que observaremos gracias a la
tinción, que esta con giemsa durante 45min.
▪ Bandeo NOR
Nos permiten visualizar las regiones de los organizadores nucleolares mediante un tratamiento de nitrato
de plata.
¿Qué son las regiones de NOR?
Son regiones cromosómicas que contienen los genes para las subunidades 18S y 28S de los ARNr para que
se puedan asociar a constricciones secundarias.
Con esta técnica se tiñen regiones proteicas adyacentes a las NOR, presentes en los ADN satélites de los
cromosomas acrocéntricos, aunque no todo este tipo de cromosomas presenta este tipo de ADN, de
manera que cada individuo presentara un patrón distinto de bandas NOR.

Cariotipos de alta resolución

El tratamiento de colcemid consiste en que paraliza la división de la célula en mitosis en la etapa de la metafase, ya
que los cromosomas son en la etapa en la cual mas condensados se encuentran. Cuanto más condensados estén
menor es la resolución de su cariotipo. Para aplicar dicho tratamiento se recomienda una exposición corta, cuando
se va a aplicar en fases tempranas, hasta llegar a la metafase.

Agentes sincronizantes

Metotrexato (MTX), es el mas empleado. Se encarga de bloquear la división en etapas tempranas.

Cultivos celulares en diagnóstico prenatal
Se emplea para conocer posibles alteraciones cromosómicas en el feto.

- Fibroblastos de líquido amniótico, se obtiene mediante amniocentesis, a partir de la semana 14.

- Vellosidades coriales, se realiza un FISH directa para evitar aneuploidías cromosómicas en el feto. Se
realiza como cultivos en monocapa.
Para el éxito del cultivo se deben de cumplir las siguientes condiciones.
-Condiciones de obtención de la muestra
-Conservación y envío de la muestra
-Preparación de la muestra.
- Sangre del cordón umbilical fetal.

Para la obtención de cada muestra aplicamos una técnica diferente.