Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023) 72–80

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Revista Internacional de
Parasitología:
Medicamentos y resistencia a los
medicamentos
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in vitroactividad y mecanismo de inducción de muerte celular de

derivados de cianometilviniléteres contratripanosoma cruzi
Carlos J. Bethencourt-Estrella a,b, Samuel Delgado-Hernandez´C,d, Atteneri
López-Arencibia´a,b,Es, deseo´ee San Nicolás-Hern´andez´a,b, David Tejedor C,**, Fernando García
TelladoC,***, Jacob Lorenzo Moralesa,b,Es,*, Si´y E. Piñero˜a,b,Es,****
a
Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Universidad de La Laguna, Avda. Astrofísico Fco. Sanchez, ´S/N, 38203, La Laguna,
Tenerife, Islas Canarias, Spain
b
Departamento de Obstetricia y Ginecología, Pediatría, Medicina Preventiva y Salud Pública, Toxicología, Medicina Legal y Forense y Parasitología, Universidad de La
Laguna, Tenerife, Islas Canarias, Spain
C
Instituto de Productos Naturales y Agrobiología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Avda. Fco. Sanchez ´3, 38206, La Laguna, Tenerife, Islas Canarias,
Spain
d
Departamento de Química, Unidad Departamental de Química Analítica, Universidad de La Laguna (ULL), Tenerife, 38206, Spain EsCentro
de Investigación´en bioma´Educador en Red de Enfermedades Infecciosas (CIBERINFEC), Instituto de Salud Carlos III, 28220, Madrid, España

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

Palabras clave:
Capuchina
tripanosoma cruzi
muerte celular
Actividad
ciano

Roth, 2015).
Descubierta por Carlos Chagas en 1909 y provocada por el protozoo
La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es una de las
1. Introducción
enfermedades tropicales desatendidas por sus características y su
ABSTRACTO
relación con las zonas de pobreza. Endémica en 21 países de América
La enfermedad de Chagas provoca una patología problemática que puede derivar Latina, incluidos América del Sur, América Central y México, afecta
en megacolon y cardiopatías, pudiendo incluso provocar la muerte del paciente. entre 6 y 8 millones de personas en estas áreas. En las últimas décadas,
Las terapias actuales para esta enfermedad son las mismas que hace 50 años, no debido a la globalización y la inmigración, el número de casos fuera de
son completamente efectivas y tienen fuertes efectos secundarios. La falta de una las áreas endémicas ha ido en aumento, con un estimado de 300.000
terapia segura y efectiva hace necesaria la búsqueda de nuevos compuestos personas infectadas en los Estados Unidos (Berna y Montgomery,
menos tóxicos y totalmente efectivos contra este parásito. En este trabajo se 2009;Organización, 2018;Stanaway y
estudió la actividad antichagásica de 46 nuevos derivados de cianometilviniléter. parásitotripanosoma cruzi, esta enfermedad se transmite principalmente
Además, para dilucidar el tipo de muerte celular que estos compuestos producen por el triatomino, aunque también se dan otras vías de transmisión
en los parásitos, se estudiaron varios eventos relacionados con la muerte celular menos frecuentes, que son la causa de casos fuera de las zonas
programada. Los resultados destacan cuatro compuestos más selectivos, E63, E64,
endémicas, como la transmisión congénita, las transfusiones o los
E74 y E83, que también parecen desencadenar la muerte celular programada y,
trasplantes (Capuchina, 1909;Guarner, 2019;Rassi et al., 2010).
por lo tanto, se postulan como buenos candidatos para su uso en futuras terapias
La enfermedad de Chagas presenta dos fases, la fase inicial,
para la enfermedad de Chagas.
conocida como etapa aguda, y la fase tardía, conocida como etapa
crónica, separadas por la fase indeterminada (Tanowitz et al., 1992).
La fase aguda es

* Corresponding author. Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Universidad de La Laguna, Avda. Astrofísico Fco.
Sanchez, ´S/N, 38203, La Laguna, Tenerife, Islas Canarias, Spain.
** Autor correspondiente.
*** Autor correspondiente.
**** Corresponding author. Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Universidad de La Laguna, Avda. Astrofísico Fco.
Sanchez, ´S/N, 38203, La Laguna, Tenerife, Islas Canarias, Spain.
 Correos electrónicos:cbethene@ull.edu.es(C.J. Bethencourt-Estrella), sdelgadh@ull.es(S. Delgado-Hern´andez),atlopez@ull.edu.es(A.
López-Arencibia),´dsannico@ull.edu.es(D. San Nicolás´as-Hernandez),´dtejedor@ipna.csic.es(D. Tejedor),fgarcia@ipna.csic.es(F.
García-Tellado),jmlorenz@ull.edu.es(J. Lorenzo-Morales),jpinero@ull.edu.es(J. E. Piñero).˜

https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2023.05.001
Recibido el 15 de febrero de 2023; Recibido en forma revisada el 10 de mayo de 2023; Aceptado el 12 de mayo de 2023
Disponible en línea el 31 de mayo de 2023
2211-3207/© 2023 Los autores. Publicado por Elsevier Ltd en nombre de la Sociedad Australiana de Parasitología. Este es un artículo de acceso abierto bajo la
licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
C.J. Bethencourt-Estrella et al. al., 2007), lignanos de Piper jericoense (García- Huertas et al., 2018) o
Zanthoxylum naranjillo (Bastos et al., 1999), celastroloides de
caracterizada por la ausencia de síntomas, en pocos casos existe Maytenus chiapensis (Núnez˜et al., 2021) o indolocarbazoles de
sintomatología indetermi- nada (fiebre, sudoración, dolores Streptomyces sanyensis (Cartuche et al., 2020).
musculares, malestar general, afección cardíaca, entre otras), que se El uso de compuestos a base de grupos nitrilo o ciano se ha
confunde fácilmente con otras patologías, aunque en ocasiones es el desarrollado durante décadas contratripanosomaspp.
signo más característico de la enfermedad. ocurre, inflamación en el (Bethencourt-Estrella et al., 2021;Quilles et al., 2020). Además, estos
área de la picadura (inoculación chagoma o Romana˜firmar) (Cora, compuestos se han relacionado con la inhibición de las cisteína
2007). Tras esta fase aguda inicial, que puede durar aproximadamente proteasas, más concretamente frente a la cruzaína (Beaulieu et al.,
2–A las 8 semanas, el paciente entra en la fase indeterminada, 2010;Burtoloso et al., 2017;Fonseca Lameiro et al., 2021).
caracterizada por la ausencia de síntomas, pero con serología positiva Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023) 72–80
(Linhares-Lacerda et al., 2018). La mayoría de los pacientes suelen
asentarse en esta etapa indeterminada hasta la muerte. pero unos En este estudio se probaron la actividad y la citotoxicidad de 46
20–El 30% de estos pacientes desarrollan la fase crónica, caracterizada nuevos derivados de cianometilviniléteres. Además, se estudió el
por la presencia de problemas cardíacos y digestivos (megacolon y mecanismo de acción para determinar el tipo de muerte celular que
megaesófago). Esta fase puede aparecer años, incluso décadas después estos compuestos producen en los parásitos.
de la fase aguda (Echavarría et al., 2021)(Echavarría et al., 2021). Es
importante mencionar que la sintomatología puede variar según la 2. Materiales y métodos
genética y la zona geográfica, lo que complica aún más su diagnóstico
clínico y tratamiento (Campbell et al., 2004;Miles et al., 1981;Urbina, 2.1. Compuestos
2010).
Como la tercera enfermedad parasitaria más común a nivel Los 46 nuevos compuestos probados, incluidos entabla 1, fueron
mundial, es importante enfatizar su prevención. Esta prevención debe sintetizados como se describe porDelgado-Hernandez´et al.,
llevarse a cabo en tres enfoques principales. En primer lugar, evitando (2021)(Delgado- Hernandez´et al., 2021). Estos 46
la transmisión (control de vectores, transfusiones, trasplantes), en cianometilviniléteres se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO, Merck,
segundo lugar, mejorando la detección de casos, permitiendo así un Darmstadt, Alemania) y se almacenaron en−20◦C en la oscuridad. Al
tratamiento precoz (análisis periódicos, tratamiento antiparasitario), y agregar los compuestos a los parásitos, se debe tener cuidado de no
por último, mejorando la calidad de vida del paciente.'s calidad de vida exceder el 1 % de DMSO, ya que concentraciones más altas podrían ser
una vez desarrollada la enfermedad (tratamiento de los síntomas, tóxicas para los parásitos.
seguimiento de la salud) (Abad-Franch et al., 2010;Rassi et al., 2009).
Los tratamientos actuales para la enfermedad de Chagas son los 2.2. Culturas
mismos que en la década de 1960, benznidazol y nifurtimox, cuya
actividad varía según la zona geográfica. Los tratamientos con estos Los análisis tripanocidas se desarrollaron utilizando epimastigotes
fármacos son prolongados y, además, son tóxicos, produciendo muchos detripanosoma cruzi(cepa Y) cultivada en medio de triptosa de infusión
efectos secundarios. Estos efectos secundarios incluyen principalmente de hígado (LIT) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) a
problemas gastrointestinales y del sistema nervioso central y, en el caso 26◦C. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron usando macrófagos
del benznidazol, la aparición de dermatitis alérgica. Todos estos efectos murinos J774A.1 (ATCC #TIB-67) cultivados en Dulbecco's Medio
obligan a menudo a interrumpir el tratamiento (PAG´erez-Molina y
Eagle modificado (DMEM) suplementado con FBS al 10 % a 37◦C y 5%
Molina, 2018;Rassi et al., 2012). Estos efectos secundarios, además de
su variabilidad en la eficacia, hacen necesario el desarrollo de nuevas CO2atmósfera.
terapias más eficaces y menos tóxicas para esta patología.
2.3. Actividad contra la etapa de epimastigote
A pesar de ser una enfermedad descubierta hace más de 100 años
por Carlos Chagas, aún falta investigación sobre la progresión de la
Los estudios de actividad frente al estadio de epimastigote se
enfermedad y su modo de acción, lo que hace muy complicada la
realizaron en placa de 96 pocillos, se añadieron diluciones seriadas de
búsqueda de nuevos fármacos para los investigadores.
Durante los últimos 50 años, se han realizado esfuerzos para los cianometilviniléteres a razón de 105epimastigotes deT cruzi,en un
desarrollar nuevos tratamientos para las fases aguda y crónica de la volumen final de 200metrol de LIT por pocillo. Para ver la reacción de
enfermedad de Chagas. Aunque no se han desarrollado nuevos fluorescencia un 10% de alamarBlue Cell Viability Reagent®(Thermo
fármacos actualmente utilizados en el tratamiento de la enfermedad de Fisher Scientific, Madrid, España). Después de 3 días de incubación,
que es el momento en que el cultivo de parásitos se encuentra en su
Chagas, se han desarrollado muchos candidatos prometedores para
fase de crecimiento exponencial, es decir, división máxima y
estudios adicionales de la tripanosomiasis. Estos candidatos se pueden
eliminación mínima, se determinó la fluorescencia con el lector de
dividir en dos grupos principales, un primer grupo que comprende placas multimodo EnSpire.®(PerkinElmer, ThermoFisher Scientific,
compuestos de origen sintético y semisintético, y un segundo grupo Madrid, España). Luego de corroborar al microscopio que los parásitos
que contiene productos de origen natural. Los compuestos de origen responsables del cambio colorimétrico están en proceso de muerte, la
sintético o semisintético incluyen, entre otros, inhibidores de la concentración inhibitoria 50 (IC50) se calculó mediante un análisis de
biosíntesis de esteroles, como el ravuconazol (Urbina et al., 2003) o regresión no lineal (Núnez˜et al., 2021).
análogos de fenarimol (Keenan et al., 2013), péptidos antimicrobianos,
como la bacteriocina AS-48 (Martí n-Escolano et al., 2020), inhibidores 2.4. Estudios de citotoxicidad en células murinas
de cruzipaína, como K777 (Barr et al., 2005), compuestos
nitro-heterocíclicos, como fexinidazol (Raether y Seidenath, 1983) o
Para determinar la concentración de citotoxicidad 50 (CC50) se
nitrotriazoles (Papadopoulou et al., 2016) o quinolonas (Nefertiti et al.,
realizó el mismo ensayo colorimétrico basado en el reactivo
2018). Los compuestos de origen natural incluyen flavonoides de
alamarBlue. En este caso, 104Se agregaron células por pocillo
Delphinium staphisagria (Marín et al., 2011) o Arra bidaea brachypoda
previamente hasta que se logra la adhesión celular completa a la placa
(da Rocha et al., 2014), artemisininas de Artemisia annua (Mishina et
 de 96 pocillos, después de eso, diluciones en serie de la com
libras se agregaron en un volumen final de 100metrol de medio RPMI 2.5. Actividad contra la etapa de amastigote
1640 (Gibco, Waltham, MA, EE. UU.). Se debe cambiar el medio de
DMEM, ya que puede interferir con las lecturas de fluorescencia con Determinar la actividad de los compuestos frente a la etapa
alamarBlue, debido a la intensidad de su color. Después de 24 h a las amastigota deT cruzi,Se utilizó el mismo método colorimétrico basado
37◦C con 5% CO2, que es tiempo suficiente para que el cultivo de en la reducción de alamarBlue. Se incubó un cultivo de epimastigotes
macrófagos alcance su fase de crecimiento exponencial, la durante 4 días en medio LIT. En una placa de 96 pozos, 104Se
fluorescencia se midió con el lector de placas multimodo agregaron macrófagos murinos por pocillo a un volumen final de
EnSpire®(PerkinElmer, ThermoFisher Scientific, Madrid, España). 50metrol en medio DMEM. Después de un mínimo de 2 h de
Finalmente, con el CC50y el CI50se calculó el índice de selectividad incubación a 37◦C con 5% CO2, 5×104parásitos
(CC50/CI50) (Cartuche et al., 2020).

73
C.J. Bethencourt-Estrella et al. Estructura molecular de los derivados de cianometilviniléteres. BENZ:
benznidazol.
tabla 1 Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023) 72–80

ID Estructura molecular ID Estructura molecular ID Estructura molecular E51 E67 E83

E52 E68 E84

E53 E69 E85 E54 E70 E86 E55 E71 E87 E56 E72 E88 E57 E73 E89

E58 E74 E90

E59 E75 E91 E60 E76 E92 E61 E77 E93

E62 E78 E94

E63 E79 E95 E64 E80 E96 E65 E81 BENZ

E66 E82
España) y el IC50de los compuestos se calculó utilizando un análisis de
regresión no lineal.
2.6. Ensayo de condensación de cromatina

Para analizar la presencia de condensación de cromatina, el

se añadieron a cada pocillo (relación 5:1 parásito:macrófago) y se
Vybrant®Kit de ensayo de apoptosis n◦5, Hoechst 33342/Yoduro de
incubaron durante 24 h a 37ºC.◦C con 5% CO2. Tras esta incubación, Propidio (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España). Los epimastigotes
los pocillos se lavaron 3 veces con medio fresco para eliminar los
se incubaron con la concentración inhibitoria 90 (IC90) de los
parásitos no internalizados y se añadieron diluciones seriadas de los
compuestos. Después de 24 h, la solución se centrifugó (825 g, 10 min,
compuestos a un volumen final de 100metrol de DMEM. Después de
4◦C), resuspendido en 50metrol de tampón con Hoechst (5metrog/mL)
una incubación de 24 h a 37◦C con 5% CO2, se eliminó el DMEM y
30metroSe añadió l de SDS al 0,05% en LIT durante 30 s para inducir y yoduro de propidio (PI) (1metrog/ml) y se incubó durante 20 min a
la lisis de los macrófagos, seguido de esto, 170metroSe añadió 26◦C. Para ver los resultados EVOS®Se utilizó FL Cell Imaging System
rápidamente l de LIT fresca para alcanzar un volumen final de (ThermoFisher Scientific, Madrid, España). Para determinar la
200metroyo Finalmente, se añadió un 10% de alamarBlue, y tras 72 h concentración celular de DAPI light cube y RFP light cube se
de incubación a 26◦C, la fluorescencia se midió con el lector de placas procesaron con el software FIJI ImageJ 2.0, en
multimodo EnSpire®(PerkinElmer, ThermoFisher Scientific, Madrid,

74
C.J. Bethencourt-Estrella et al. nucleico verde (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.). Esta sonda
normalmente es impermeable a las membranas plasmáticas intactas,
triplicar utilizando imágenes de 40x. Se añadió un control negativo (sin pero es capaz de penetrar en las células con mayor permeabilidad,
ningún tratamiento) y un tratamiento de referencia (benznidazol) alcanzando el núcleo y uniéndose a los ácidos nucleicos, lo que resulta
(Bethencourt-Es trella et al., 2022). en un fuerte aumento de su fluorescencia. Los epimastigotes se
incubaron con el IC90de los compuestos durante 24 h a 26◦C. Luego, la
2.7. Ensayo de permeabilidad de la membrana plasmática
solución se centrifugó (825 g, 10 min, 4◦C) y resuspendido en 50metrol
Para determinar las alteraciones en la permeabilidad de la membrana de tampón con 1metroM concentración del kit. La medida de la
plasmática el SYTOX®Se utilizó tinte fluorescente de tinción de ácido concentración de células verdes se desarrolló utilizando el Countess II
 FL (ThermoFisher Scientific, Madrid, España) y las imágenes se citómetro Tali®(ThermoFisher Scientific, Madrid, España)
realizaron utilizando el cubo de luz GFP en el EVOS.®FL Cell Imaging (Lopez-Arencibia ´et al., 2021).
System (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España). Se añadió un
control positivo (Triton 0,5% durante 30 min), un tratamiento de 2.12. métodos de estadística
referencia (benznidazol) y un control negativo (sin ningún tratamiento)
(Lopez-Arencibia ´et al., 2019b).
el CI50y cc50fueron calculados mediante un análisis de regresión no
lineal con un 95% de confianza, con el software estadístico GraphPad
2.8. Ensayo de alteraciones ATP
Prism 9.0.0. Todos los experimentos se realizaron por duplicado en tres
días diferentes y se expresaron como media±desviación estándar.
Las alteraciones en los niveles de ATP se determinaron utilizando
Luego de verificar la distribución normal de los datos mediante la
CellTiter Glo®Ensayo de viabilidad de células luminiscentes (Promega,
prueba de Shapiro-Wilk, se'Se utilizó la prueba de s, considerando
WI, EE. UU.). Tras una incubación de 24 h de epimastigotes con el
valores significativos depag<0.05. Los resultados obtenidos del
IC90de los compuestos, la solución se centrifugó (825 g, 10 min, 4◦C) y
mecanismo de muerte celular inducida se procesaron realizando un
resuspendido en 25metrol de tampón y 25metrol del equipo. Después ANOVA unidireccional, también se utilizó el GraphPad Prism 9.0.0.
de 10 minutos de incubación, se midió la luminiscencia con el lector de
placas multimodo EnSpire®(Per kinElmer, ThermoFisher Scientific,
3. Resultados
Madrid, España) en placa blanca. Se añadió un control positivo (azida
sódica 20 mM durante 3 h), un tratamiento de referencia (benznidazol)
y un control negativo (sin ningún tratamiento) (Lopez-Arencibia ´et al., 3.1. Actividad contra la etapa de epimastigote
2019a).
Los resultados de la actividad contra la etapa epimastigota
2.9. Ensayo de alteraciones potenciales de la membrana mitocondrial decruzise presentan enTabla 2, la concentración inhibitoria 50 se
expresó enmetroM como media±desviación estándar.
Para determinar las alteraciones en el potencial de membrana
mitocondrial, el kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial 3.2. Estudios de citotoxicidad
JC-1®(Cayman Chemical, MI, EE. UU.). Los epimastigotes se incubaron
con el IC90de los compuestos durante 24 h a 26◦C. Después de Los resultados de la citotoxicidad contra los macrófagos murinos se
centrifugar (825 g, 10 min, 4◦C) y resuspender en 50metroyo, presentan enTabla 3, la concentración de citotoxicidad 50 se expresó
5metroSe agregaron l del kit. Luego, la fluorescencia se midió con el enmetroM como media±desviación estándar.
lector de placas multimodo EnSpire®(PerkinElmer, ThermoFisher
Scientific, Madrid, España) en placa negra. Un control positivo 3.3. Índice de selectividad frente al estadio de epimastigote
(Cianuro de Carbonilo Clorofenilhidrazona, CCCP 100metroM durante
3 h), se añadió un tratamiento de referencia (benznidazol) y un control Los índices de selectividad del estadio de epimastigote se
negativo (sin ningún tratamiento) (Bethencourt-Estrella et al., 2022).
calcularon como la relación CC50/CI50, estos valores se incluyeron
enTabla 4. Se seleccionaron los cianometilviniléteres más selectivos
2.10. Ensayo de presencia de especies reactivas de oxígeno para realizar los diferentes análisis para dilucidar el tipo de muerte
celular producida en el parásito.
La presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) se midió
utilizando el CellROX®Reactivo Deep Red (Thermo Fisher Scientific,
3.4. Actividad contra la etapa de amastigote
Madrid, España). Después de incubar los epimastigotes con el IC90de
los compuestos a 26◦C por 24 h, centrifugando (825 g, 10 min, 4◦C) y Los resultados de la actividad contra la etapa amastigota decruzide
resuspender en 50metrol de tampón, se añadió el kit a las los compuestos más selectivos contra el estadio de amastigote se
5metroconcentración de M durante 30 min a 26◦C. La medida de la presentaron enTabla 5, la concentración inhibitoria 50 se expresó
concentración de glóbulos rojos se realizó con el Countess II FL enmetroM como media±desviación estándar.
(ThermoFisher Scientific, Madrid, España) y las imágenes con el cubo
de luz Cy5 en el EVOS.®FL Cell Imaging System (ThermoFisher Tabla 2
Scientific, Madrid, España) (Bethencour t-Estrella et al., 2021).
Actividad de los derivados de cianometilviniléteres frente al estadio de epimastigote
de Trypanosoma cruzi, representada como concentración inhibitoria 50
2.11. Ensayo de externalización de fosfatidilserina (IC50enmetroMETRO).BENZ: benznidazol.

CI de identificación50(metroM) CI de identificación50(metroM) CI de
La exteriorización de la fosfatidilserina desde el interior hacia el
identificación50(metroMETRO)
exterior de la membrana plasmática es otro evento característico de
Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023) 72–80 E51 39,96±3.73 E67>150 E83 11.25±1,47 E52 50,09±0,28 E68>150 E84 67,6±1,35
E53 8,84±0.37 E69>150 E85>150 E54 13.4±1,24 E70>150 E86>150 E55 36,24±0,65
E71>150 E87>150 E56 49,1±2,79 E72>150 E88>150 E57>150 E73 38.48±3.51
apoptosis. Esto se determinó utilizando el Tali™Kit Apoptosis - E89>150 E58>150 E74 8,88±0,95 E90>150 E59>150 E75 10.1±1.74 E91>150
Anexina V Alexa Fluor®488 (ThermoFisher Scientific, Madrid, E60>150 E76 10.27±1,64 E92>150 E61>150 E77>150 E93>150 E62>150 E78>150
España). Este kit que contiene anexina y PI divide las células en 3 E94>150 E63 5,43±0.14 E79>150 E95>150 E64 8,91±1.75 E80 >150 E96>150 E65
47,77±1.3 E81>150
poblaciones: vivas (sin teñir), muertas (teñidas con PI) o apoptóticas
E66 46,62±5.21 E82>150 BENZ 6,92±0.77
(teñidas con anexina). Las células se cuantificaron utilizando el

75
C.J. Bethencourt-Estrella et al. E61 ND E77 ND E93 ND E62 ND E78 ND E94 ND E63 167.13±4,13 E79 y E95 y
E64>300 E80 ND E96 ND E65>700 E81 ND
Tabla 3 E66>700 E82 ND BENZ 399.91±1.4metroMETRO

Citotoxicidad de los derivados de cianometilviniléteres frente a macrófagos murinos,

representada como concentración citotóxica 50 (CC50enmetroMETRO).ND: no
determinado. BENZ: benznidazol. Tabla 4
DNI CC50(metroM) DNI CC50(metroM) DNI CC50(metroMETRO) Índice de selectividad (SI) de los derivados de cianometilviniléteres frente al
estadio epimastigote de Trypanosoma cruzi. ND: no determinado. BENZ:
E51 709.44±20,48 E67 ND E83 339,82±6.36 E52>700 E68 ND E84>300 E53
benznidazol.
47,47±52,24 E69 ND E85 ND E54 200,46±6.04 E70 ND E86 ND E55>700 E71 ND
E87 ND E56>700 E72 ND E88 ND E57 ND E73>300 E89 ND E58 ND E74>1300 ID SI ID SI ID SI
E90 ND E59 ND E75 96.76±23,36 E91 ND E60 ND E76 157,98±18.99 E92 ND
E51 11,52 E67 ND E83 30,2 E52>13,97 E68 ND E84 4,4 E53 5,37 E69 ND E85 ND
 E54 15,0 E70 ND E86 ND E55>19.3 E71 ND E87 ND E56>30 .8 E79 ND E95 ND negativo y se incluyeron enFigura 4.
E64>33.7 E80 ND E96 ND E65>14.7 E81 ND
E66>15,0 E82 ND BENZ 57,8
3.10. Presencia de análisis de especies reactivas de oxígeno

La presencia de especies reactivas de oxígeno se presentó enFigura

Tabla 5 5, en porcentaje con respecto al control negativo. Las imágenes
Actividad de los derivados de cianometilviniléteres frente a la etapa amastigota de
obtenidas con el cubo de luz Cy5 en el EVOS®FL Cell Imaging System
Try panosoma cruzi, representada como concentración inhibitoria 50
se incluyeron enfigura S4.
(IC50enmetroMETRO).BENZ: benznidazol.

CI de identificación50(metroM) CI de identificación50(metroM) CI de 3.11. Análisis de externalización de fosfatidilserina

identificación50(metroMETRO)
E63 16.11±0,70 E74 38,62±8.88 La externalización de fosfatidilserina se expresó como porcentaje de
E64 9,94±0,80 E83 23,27±2,93 BENZ 2,67±0.39
células vivas (negras), muertas (rojas) y apoptóticas (verdes). El
porcentaje de células teñidas obtenidas con el Tali®fue presentado
3.5. Índice de selectividad frente al estadio de amastigote enFigura 6.

Los índices de selectividad frente a la etapa de amastigote de los 4. Discusión

éteres de cianometilvinilo más selectivos se presentaron enTabla 6.
De los 46 cianometilviniléteres estudiados, 16 presentaron actividad
contra la etapa epimastigota decruzien el rango entre 5.43 y
3.6. Análisis de condensación de cromatina
67.6metroM. Estos compuestos más activos fueron seleccionados para
estudiar la citotoxicidad y determinar la actividad contra la etapa de
La presencia de condensación de cromatina y células muertas fue
amastigote. De estos compuestos, cuatro de ellos, E63, E64, E74 y E83,
mostraron un buen índice de selectividad frente al estadio de
Tabla 6
epimastigote, cercano al tratamiento de referencia, benznidazol.
Índice de selectividad de los derivados de cianometilviniléteres frente al
estadio amastigote de Trypanosoma cruzi. BENZ: benznidazol.
Además, E74 mostró un índice de selectividad casi tres veces mayor
que el benznidazol. Estos cuatro compuestos mostraron actividad
ID SI ID SI ID SI
contra la etapa de amastigote con índices de selectividad entre 10,4 y
E63 10,4 E74 33,7 33,7.
E64 30,2 E83 14,6 BENZ 149,8 Comparando los resultados de actividad frente a las diferentes
Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023) 72–80
formas del parásito, los éteres de cianometilvinilo muestran una mejor
actividad frente a las formas epimastigotas del parásito. Esto se
expresada en intensidad de fluorescencia media enFigura 1. Las
corrobora con la idea de que, por contener grupos ciano, actúan sobre
imágenes de los cubos de luz DAPI y RFP tomadas EVOS®FL Cell
la cruzipaína, que se expresa en mayor medida en las formas
Imaging System se incluyeron enfigura S1 y S.2.
epimastigotas que en las formas amastigotas (Beaulieu et al.,
2010;Burtoloso et al., 2017).
3.7. Análisis de permeabilidad de membranas plasmáticas
Estos cuatro compuestos más selectivos fueron seleccionados para
estudiar el tipo de mecanismo que realizan para la eliminación del
La presencia de permeabilidad de la membrana plasmática se
parásito. Para ello, se estudiaron diferentes eventos característicos de
expresó en porcentaje con respecto al control negativo. Estos resultados
la muerte de tipo apoptótico. Los eventos estudiados incluyen la
fueron incluidos enFigura 2. Las imágenes del canal de luz GFP
condensación de la cromatina, la disminución del nivel de ATP celular,
obtenidas con el EVOS®FL Cell Imaging System se incluyeron enfigura
la alteración de la permeabilidad de la membrana plasmática, la
S3.
disminución del potencial de la membrana mitocondrial, la exposición
a la fosfatidilserina y la acumulación de especies reactivas de oxígeno.
3.8. Análisis de alteraciones ATP
Todos estos son característicos de la muerte celular apoptótica
(Basmaciyan et al., 2019;Basmajian y Casa
Los niveles de ATP se expresaron en porcentaje con respecto al
nuevo, 2019;Bethencourt-Estrella et al., 2022;Lopez-Arencibia ´et al.,
control negativo y se incluyeron enFig. 3.
2019a;Menna-Barreto, 2019).
En este paso, para demostrar que estos cuatro compuestos más
3.9. Análisis de alteraciones del potencial de membrana mitocondrial
selectivos producían muerte celular apoptótica, los resultados
mostraron que estos cuatro
Los resultados de alteraciones en el potencial de membrana
mitocondrial se expresaron en porcentaje con respecto al control

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C.J. Bethencourt-Estrella et al. Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023) 72–80

Figura 1.Resultados de la condensación de la cromatina y el número de células muertas representadas como intensidad de fluorescencia media, se utilizó
benznidazol como tratamiento de referencia. Una prueba de Tukey con GraphPad.PRISM®Se hizo el software 9.0 para probar las diferencias estadísticas entre las
medias. (no significativo [ns]; p<0,05 [*]; pag<0,001 [***]; pag<0,0001 [****]).
Figura 2.Resultados de la permeabilidad de la membrana plasmática representados como porcentaje de células verdes, se utilizó benznidazol como tratamiento de
referencia y Tritón al 0,5% como control positivo (C+). Una prueba de Tukey con GraphPad.PRISM®Se hizo el software 9.0 para probar las diferencias estadísticas
entre las medias. (no significativo [ns]; p<0,01 [**]; pag<0,001 [***]; pag<0,0001 [****]).

Fig. 3.Resultados de la disminución de los niveles de ATP representados como el porcentaje relativo al control negativo (C-), se utilizó benznidazol como
tratamiento de referencia y azida sódica como control positivo (C+). Una prueba de Tukey con GraphPad.PRISM®Se hizo el software 9.0 para probar las diferencias
estadísticas entre las medias. (pag<0,0001 [****]).

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C.J. Bethencourt-Estrella et al. Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023) 72–80
Figura 4.Resultados de las alteraciones del potencial de membrana mitocondrial (△Ψm) representado como el porcentaje relativo al control negativo (C-), se
utilizó benznidazol como tratamiento de referencia y CCCP como control positivo (C+). Una prueba de Tukey con GraphPad.PRISM®Se hizo el software 9.0 para
probar las diferencias estadísticas entre las medias. (pag<0,001 [***]; pag<0,0001 [****]).

Figura 5.Resultados de especies reactivas de oxígeno representadas como porcentaje de células fluorescentes, se utilizó benznidazol como tratamiento de referencia
y H2O2se usó como control positivo (C+). Una prueba de Tukey con GraphPad.PRISM®Se hizo el software 9.0 para probar las diferencias estadísticas entre las
medias. (pag<0,05 [*]; pag<0,01 [**]; pag<0,001 [***]; pag<0,0001 [****]).

compuestos producen los eventos antes mencionados característicos de este

tipo de muerte celular programada. Por lo tanto, se puede concluir que son
parecen ser buenos tripanocidas, ya que no producirán los problemas
causada por la muerte celular necrótica.
Con respecto al CI50valores, la configuración del doble enlace no
no parecen jugar un papel importante porque la actividad de cada par de
isómeros es muy similar en la mayoría de los casos. De hecho, no hay casos
donde uno de los isómeros carece de actividad (>150) mientras que su contraparte tiene
una actividad importante (<100).
Las diferencias más significativas entre pares de isómeros son 73–74,
donde el isómero Z es más de cuatro veces más activo que el isómero E, y
83–84, donde el isómero E es esta vez seis veces más activo que el Z
isómero No hay una explicación evidente para la actividad mejorada de uno
de los dos isómeros en cada caso.
La diferencia en el IC50valores de estos cianometil vinil éteres es
por lo tanto, debido principalmente al sustituyente presente en el carbono sp3, otro
que el grupo ciano. Mientras que alifático (85–96) o heteroaromático
Figura 6.Los resultados de la exposición a la fosfatidilserina representados (57–58, 69–70) no tienen actividad significativa, algunos sustituyentes
como porcentaje de células apoptóticas (verde), muertas (rojas) y vivas aromáticos presentan IC50en el 1–70metrogama M. Entre todos los
(negras), se utilizó benznidazol como tratamiento de referencia. (Para la sustituyentes aromáticos, nuevamente, no hay una explicación clara
interpretación de las referencias al color en la leyenda de esta figura, se remite sobre cómo la naturaleza electrónica del anillo aromático afecta la
al lector a la versión web de este artículo). actividad biológica, pero hay numerosos

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 Revista internacional de parasitología: fármacos y farmacorresistencia 22 (2023)

ejemplos en los que el IC50los valores estan en el 5–15metrogama M.

72–80Referencias
Atendiendo a las estructuras de estos compuestos, parece que parte de
su actividad proviene del grupo ciano, pero claramente los demás
sustituyentes modifican la actividad de estos compuestos. Esto se Abad-Franch, F., Santos, W.S., Schofield, C.J., 2010. Necesidades de investigación para
corrobora con la literatura previa, donde ya se ha informado de la la prevención de la enfermedad de Chagas. Acta Trop. 115,
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ejemplo es el estudio de Gerpe et al. donde los mejores resultados de Ancizu, S., Moreno, E., Torres, E., Burguete, A., P.´erez-Silanes , S. , Benitez , D. , Villar ,
IC50contra epi mastigotes de dos cepas diferentes detripanosoma cruzise R. , Solano , B. , Marin , A. , Aldana , I. , Cerecetto , H. , Gonz´alez, M., Monge, A.,
2009. Derivados de amida del ácido heterocíclico-2-carboxílico
obtuvieron como valores de 7 y 16metroM, y otro ejemplo de trabajo (3-ciano-1,4-di-N-oxidequinoxalin-2-il)amida como éxitos para el desarrollo de
es el de Ancizu et al. donde el IC más bajo50los valores estaban fármacos para enfermedades desatendidas. Moléculas 14,
2256–2272.https://doi.org/10.3390/molecules14062256.
alrededor de 10 y 19metroM (Ancizu et al., 2009;Gerpe et al., 2006). Barea, C., Pabón,´A., Galliano, S., P. S.´erez-Silanes, S., Gonzalez, G., Deyssard, C.,
Todo esto, en comparación con el presente trabajo, destaca la mejor Monge, A., Deharo, E., Aldana, I., 2012. Antiplasmodial and leishmanicidal Activities of
actividad de los éteres, que presenta hasta 8 compuestos con valores en 2-cyano-3-(4-phenylpiperazine- Derivados de 1,4-dióxido de 1-carboxamido)
estos rangos, donde destaca por su actividad el compuesto E63 con un quinoxalina. Moléculas 17, 9451–9461.https://doi.org/10.3390/molecules17089451.
Barr, S.C., Warner, K.L., Kornreic, B.G., Piscitelli, J., Wolfe, A., Benet, L., McKerrow,
valor de IC50 de 5,43.metroM. Por lo tanto, este estudio confirma la
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literatura, y pone a los compuestos con grupos ciano como línea para durante la infección por Trypanosoma cruzi. Antimicrobiano Agentes Quimiotera.
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