ADAPTACIÓN DE MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITRÓGENO DE VIDA

LIBRE A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SALES DE AMONIO

MAYRA ALEJANDRA GONZÁLEZ CASTILLO

UNIVERSIDAD DEL VALLE

SEDE MELÉNDEZ
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA DE LOS RECURSOS NATURALES Y DEL MEDIO AMBIENTE
PROGRAMA ACADEMICO DE INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL
SANTIAGO DE CALI
2019
ADAPTACIÓN DE MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITRÓGENO DE VIDA
LIBRE A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SALES DE AMONIO

MAYRA ALEJANDRA GONZÁLEZ CASTILLO

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE

INGENIERA SANITARIA Y AMBIENTAL

DIRECTORA
PhD JANETH SANABRIA GOMEZ

CODIRECTORA
CLAUDIA LORENA RODRIGUEZ GONZALEZ

UNIVERSIDAD DEL VALLE

SEDE MELÉNDEZ
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA DE LOS RECURSOS NATURALES Y DEL MEDIO AMBIENTE
PROGRAMA ACADEMICO DE INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL
SANTIAGO DE CALI
2019
DEDICATORIA

Especialmente dedico este trabajo a mi madre, quien con su esfuerzo y dedicación procuro
brindarme la mejor educación y crianza, para formarme como profesional y persona.

A mi familia que de una u otra forma ha estado presente durante este proceso con su motivación,
apoyo incondicional y entrega.

A las amistades construidas en mi recorrido por la Universidad del Valle.

AGRADECIMIENTOS

A mi familia, por su acompañamiento y compromiso durante la carrera. Agradezco a la

Universidad del Valle y al programa de Ingeniería Sanitaria y Ambiental por darme las
herramientas necesarias para formarme como profesional.

A la profesora Janeth Sanabria por brindarme la oportunidad de pertenecer al grupo de

investigación GAOX y proporcionar los elementos necesarios para realizar mi trabajo de grado.

A Dany Acevedo y Claudia Rodríguez por su apoyo y acompañamiento durante este trabajo, y
por brindarme los conocimientos necesarios en los diferentes temas que fueron requeridos.

Al grupo de investigación por sus aportes y apoyo a lo largo de este trabajo.

CONTENIDO

RESUMEN 1

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2

2. ANTECEDENTES 3

3. OBJETIVOS 5

3.1 OBJETIVO GENERAL 5

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 5

4. MARCO TEÓRICO 6

4.2 REACTORES SECUENCIALES EN BATCH (SBR) 6

4.3 FIJACIÓN DE NITRÓGENO 8

4.3.1 Fijación Biológica de Nitrógeno 8

4.3.2. Complejo enzimático nitrogenasa 9

4.3.3. Microorganismos fijadores de Nitrógeno de vida libre 9

4.3.4. Resistencia microbiana a la salinidad 10

4.4 DEGRADACIÓN DEL SUELO 11

4.4.1 Degradación del suelo por salinidad 13

4.4.2 Salinidad en el suelo 13

4.4.4 Naturaleza de las sales solubles 15

4.5 ESTRATEGIAS DE REMEDIACIÓN DE SUELOS SALINOS 15

4.5.1 Lavado 15

4.5.2 Remediación con la utilización del yeso 16

4.5.3 Biorremediación 16

4.6 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN MICROBIANA 17

4.7 HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU 19

5. MÉTODOS 20
 5.1 INOCULOS SELECCIONADOS 20

5.2 FASE 1: Reactivación del crecimiento de inóculos. 20

5.3 FASE 2: Adaptación a condiciones salinas 22

5.4 SEGUIMIENTO DEL PROCESO 24

5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 24

6. RESULTADOS Y ANÁLISIS 25

6.1 FASE 1. REACTIVACIÓN DEL CRECIMIENTO DE INOCULOS 25

6.2 FASE EXPERIMENTAL 2: CONDICIONES DE ESTRÉS SALINO 30

6.3 PRUEBAS DE DETECCIÓN BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA 35

7. CONCLUSIONES 39

8. RECOMENDACIONES 40

9. BIBLIOGRAFÍA 41

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de funcionamiento de un reactor SBR ......................................................... 7

Figura 2. Procesos de degradación de suelos ...................................................................... 12
Figura 3. Etapas de un ciclo de operación de los reactores que fueron inoculados con suelo y
lodo. ...................................................................................................................................... 21
Figura 4. Montaje de reactores con sus réplicas .................................................................. 22
Figura 5. Promedio del cambio entre las concentraciones de biomasa en los reactores (RL y RS)
al inicio y final de los ciclos de la fase de renovación del crecimiento de inóculos ............ 25
Figura 6. Promedio del cambio entre las concentraciones de Amonio de los dos reactores (RL y
RS) al inicio y final de los ciclos de la fase de renovación de los inóculos ......................... 27
Figura 7. Promedio del cambio entre las concentraciones de nitratos de los dos reactores (RL y
RS) al inicio y final de los ciclos de la fase de renovación de los inóculos ........................ 27|
Figura 8. Densidad poblacional de los reactores RL y RS presente en tres medios de cultivos al
inicio y al final de la fase de renovación de inóculos........................................................... 29
*UFC: Unidades Formadoras de Colonias, RBA: Medio selectivo para diazotrofos, EMB:
Methylene Blue Agar ........................................................................................................... 29
Figura 9. Ciclo del nitrógeno................................................................................................ 30
Figura 10. Cambio entre las concentraciones de amonio al inicio y final de los ciclos de
operación de los reactores RL y RS de la Fase de condiciones de estrés salino ................. 31
Eje horizontal: Concentraciones de amonio añadidas al medio cada semana...................... 31
Figura 11. Concentraciones de nitratos al inicio y final de los ciclos de operación en RL y RS de
la Fase de condiciones de estrés salino ................................................................................ 32
Eje horizontal: Concentraciones de amonio añadidas al medio cada semana...................... 32
Figura 12. Concentración de biomasa al inicio y final de los ciclos de operación de los reactores
RL y RS de la fase de condiciones de estrés salino ............................................................. 33
Figura 13. Densidad poblacional de los reactores RL y RS presente en dos medios de cultivo al
final de los ciclos de la Fase de condiciones de estrés salino .............................................. 34
*RBA: Medio selectivo para diazótrofos, EMB: Methylene Blue Agar .............................. 34
Figura 14. Micrografía de FISH tomada con microscopio Nikon 90i de (A) Microorganismos
nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3 al inicio de la fase experimental I del
reactor de lodo y (B) Microorganismos nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y
NIT3 con concentraciones de 250mg/L N en el reactor y (C) Microorganismos nitrificantes
hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3 al final de la fase experimental II. ........... 37
Figura 15. Micrografía de FISH tomada con microscopio Nikon 90i para reactor de suelo (A)
Microorganismos nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3 al inicio de la fase
experimental I (B) Microorganismos nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3
con concentraciones de 250mg/L N en el reactor (C) Microorganismos nitrificantes hibridados
con mezcla de sondas NITB y NIT3 al final de la fase experimental II. ............................. 37
LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de salinidad del suelo para el Valle del Cauca. (CVC, 2015) .......... 14
Tabla 2. Interpretación de pruebas bioquímicas................................................................... 17
Tabla 3. Condiciones de operación de los reactores en la Fase 1. ....................................... 20
Tabla 4. Composición del medio RBA para los reactores ................................................... 21
Tabla 5. Concentraciones de amonio y conductividad eléctrica del sulfato de amonio utilizadas
en la segunda fase de experimentación ................................................................................ 23
Tabla 6. Condiciones de operación para los reactores en la fase 2 ...................................... 23
Tabla 7. Pruebas bioquímicas aplicadas a colonias aisladas de lodo y de suelo .................. 35
 RESUMEN

La Fijación de Nitrógeno es considerada uno de los puntos clave de investigación para la

sostenibilidad global en el planeta. Por tanto buscar alternativas sustentables es una prioridad
mundial. La adaptación a condiciones de estrés salino puede afectar negativamente las bacterias
nativas del suelo y limitar el desarrollo de las plantas y la calidad del suelo. Se realizó la
selección y la adaptación de comunidades microbianas fijadoras de Nitrógeno provenientes de
suelo y de lodos de tratamientos industriales. En Reactores Secuenciales en Batch (SBR). Un
primer reactor se inoculó con lodos obtenidos de un Sistema de Tratamiento de Agua Residual de
la industria de las levaduras (RL), el segundo reactor se inoculó con un suelo de vocación
agrícola del Valle del Cauca (RS). Ambos reactores se alimentaron con un medio libre de
nitrógeno para reactivar el crecimiento de los inóculos. Una vez reactivados los inóculos se
sometieron a concentraciones definidas de sales para verificar su resistencia al estrés salino. El
reactor RS presentó mayores densidades de BFN (2,8E+06 UFC.mL-1) para la fase de
enriquecimiento. Al final de la fase de adaptación el reactor RL presentó densidades de BFN
4,6E+07 UFC.mL-1 y el reactor RS de 4,9E+07 UFC.mL-1. Por lo tanto, los resultados obtenidos
en el experimento sugieren este tipo de inóculos como una alternativa para la recuperación de
suelos degradados por salinidad.
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El nitrógeno es uno de los elementos más importantes para la vida, es necesario en la

composición de proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares, siendo así una
molécula esencial para el crecimiento de todos los organismos, (Cerón & Aristizábal, 2012). En
su forma molecular (N2) el nitrógeno representa el 78% de los gases que componen la atmósfera,
y es la única reserva natural accesible de nitrógeno. Sin embargo, esta fuente no es asimilable
por los organismos presentes en el suelo (Philippot & Germon, 2005).

Ningún organismo eucariota es capaz de asimilar el nitrógeno atmosférico por sí mismo. Los
microorganismos procariotas tienen la capacidad de transformar el nitrógeno molecular a la
forma asimilable de amonio ya que tienen el complejo enzimático nitrogenasa que es el
encargado de reducir el nitrógeno atmosférico en amonio en un proceso llamado Fijación
Biológica de Nitrógeno (FBN) (Mantilla-Paredes et al., 2009). Estos microorganismos pueden
vivir libremente en el suelo o vivir simbióticamente con determinadas plantas (principalmente
leguminosas), contribuyen al uso eficiente de los nutrientes y productividad del suelo.

Buscando satisfacer las demandas de producción alimenticia mundial, es esencial el uso de

fertilizantes químicos nitrogenados (Danso & Eskew, 2005). Aproximadamente el 40% de la
agricultura mundial depende del uso de fertilizantes químicos (Cherkasov et al, 2015) y se
producen alrededor de 500 Mton por año (Engel & Reid, 2007). La síntesis industrial de estos se
lleva a cabo en un proceso que demanda altas cantidades de energía y presión llamado Haber-
Bosch. Los fertilizantes nitrogenados de síntesis (nitrato amónico-cálcico, nitrato amónico, nitro
sulfato amónico, sulfato amónico, entre otros) se obtienen utilizando como fuente básica el
amoniaco, obtenido a su vez por el proceso de Haber Bosch. Las elevadas temperaturas y
presiones requieren del consumo del 2% de los suministros mundiales de energía. La producción
de fertilizantes químicos emite más de 400 Mt.año-1 de CO2, lo que conlleva un 1,6% de las
emisiones totales de CO2, contribuyendo al efecto invernadero del planeta (Hernández, 2011). El
uso de fertilizantes químicos por la planta no es eficiente, entre el 30 y 50% del nitrógeno es
aprovechado por los cultivos (Wang et al, 2014), perdiéndose el resto por procesos de
volatilización y lixiviación. Estas pérdidas se asocian a problemas ambientales como la
eutrofización de los ecosistemas acuáticos, con ello lleva a la proliferación de algas, anoxia del
agua, muerte de peces y pérdidas de biodiversidad. El incremento de las concentraciones de
derivados nitrogenados (NOx y NH3), aumento de la concentración de ozono a nivel del suelo y
material particulado (PM2,5) que puede incrementar la probabilidad de enfermedades
cardiovasculares y respiratorias y cánceres mortales.

La aplicación de fertilizantes nitrogenados y la deposición atmosférica de nitrógeno reactivo

causa acidificación de los suelos, lo cual supone una reducción del crecimiento de los bosques y
cultivos e incrementa el arrastre de componentes que afectan la calidad del agua, como los
metales pesados. Participan también al incremento de persistencia de plagas generando un círculo
vicioso de dependencia creciente de los cultivos frente a estos productos. De hecho, los expertos
estiman que, en la actualidad, el nitrógeno de la síntesis Haber-Bosch se encuentra presente por lo
menos en el 30% del cuerpo humano (Estupiñán & Quesada, 2010). El remanente que se deposita
en el suelo, ocasiona salinidad e inhibición de la FBN y el deterioro de la calidad del suelo.
(Mulas et al, 2011).
En 2010, fue publicado el primer informe europeo sobre nitrógeno. The European Nitrogen
Assessment (ENA), y la comunidad científica se refirió por primera vez a la síntesis Haber -
Bosch como una amenaza para la humanidad (Estupiñán & Quesada, 2010). Un informe
Elaborado por la FAO (2015) muestra un incremento del 1,8% en el uso de fertilizantes a nivel
mundial por año, hasta alcanzar en 2018 los 200,5 Mton de fertilizante. En el caso de Colombia,
en la década de los años 80, el uso de fertilizantes se incrementó en más del 80%. A partir de ese
momento la calidad del suelo se vio afectada por la práctica extensiva e inadecuada de la
agricultura, en especial del monocultivo (Jiménez & Thomas, 2003).

Los suelos susceptibles a la salinización en Colombia cubren una extensión de 86.592Km2 de los
cuales 78.277 Km2 están en zonas secas, es decir el 90,39% (Zúñiga et al, 2011). Las zonas
susceptibles a la salinización abarcan gran parte de la región del caribe, los valles interandinos
(ríos Magdalena y Cauca) y los altiplanos donde se desarrollan actualmente y se tiene proyectado
ampliar la producción agrícola del país. En el Valle del Cauca son destinados a cultivo 156.372
Has (secretaria de agricultura y pesca, 2008) y debido al uso de fertilizantes y pesticidas se ha
generado un incremento en la ocurrencia de suelos salinos y sódicos (Guerrero, 1995), por lo que
es indispensable adoptar medidas preventivas para garantizar la calidad de los suelos, no solo en
el Valle del Cauca, sino en otras zonas donde las condiciones pueden ser similares. Por eso,
existe la necesidad de que se complemente el uso de fertilizantes nitrogenados con otro tipo de
inóculos, enmiendas y tecnologías.

De las alternativas utilizadas hasta el momento se encuentran: Inoculación microbiológica en

suelos salinos, lavado, biopolímeros, electromagnetismo, entre otras. Estas metodologías tienen
la desventaja de exigir un manejo más cuidadoso o de causar otro tipo de daños al suelo. Por otra
parte, se ha demostrado que en los sistemas de tratamiento de agua residual se encuentran
Bacterias Fijadoras de Nitrógeno - BFN (Pérez-Peláez, Peña-Varón, & Sanabria, 2011). La
característica interesante de estos sistemas es que tienen altas concentraciones de salinidad, y
amonio. Por lo cual, los microorganismos allí presentes ya están adaptados a estas condiciones
ambientales. La extracción de estos microorganismos, su enriquecimiento en ambientes
controlados y adaptación a altas concentraciones de sales de amonio podría ser una potencial
alternativa complementaria para la producción de nuevo bioinoculantes y por ende la
recuperación de suelos degradados por salinidad. Por lo tanto, este trabajo de investigación busca
seleccionar y enriquecer microorganismos fijadores de nitrógeno adaptados al estrés salino,
presentes en dos tipos de muestras, utilizando reactores biológicos de tipo SBR. Sentando así las
bases para la obtención de un biofertilizante alternativo a la fertilización química.
 2. ANTECEDENTES

En el siglo XVIII, la fertilización de las tierras se llevaba a cabo mediante la rotación de los
cultivos y la adición de guano, un sustrato resultante de la acumulación masiva de excrementos
de murciélagos, aves marinas y focas. Cerca del año 1800 inició un incremento exponencial de la
población, vinculado principalmente al mejoramiento de las condiciones sanitarias y alimentarias,
exigiendo una mayor producción agrícola y trabajo intensivo del suelo, lo que impulsó el
desarrollo de fertilizantes nitrogenados químicos. La creación del primer fertilizante nitrogenado
por medio de la reducción química del nitrógeno atmosférico fue desarrollada en Noruega por los
ingenieros Kristian Birkeland y Sam Eyde a partir del uso de un arco eléctrico con un potente
campo magnético o lo que se conoce como el proceso Birkeland-Eyde (Santilla, 2003). Pero este
proceso es ineficiente debido a su consumo de energía, de más de 78 GJ (López, 2017), por lo
que en 1909 fue reemplazado con el proceso Haber-Bosch.

Alternativo a la producción de fertilizantes químicos se ha buscado otras fuentes de nitrógeno que

entreguen los nutrientes al suelo para cubrir la demanda alimenticia de una manera más
sustentable y económica. Investigaciones sobre la fijación simbiótica de nitrógeno, centran la
atención sobre el sistema Rhizobium-leguminosa el cual constituye una importante alternativa
para la producción agrícola de leguminosas, grano y forrajeras (Corrales et al, 2017). Es por esto
que se investiga con base en el conocimiento de la diversidad y ecología de bacterias fijadoras de
nitrógeno.

La producción de biofertilizantes en el mundo inició a finales del siglo XIX, a partir de los
estudios realizados por Winogradsky, Waksman y Lipman, pioneros de la microbiología del
suelo, al enfocarse en la investigación de microorganismos y su capacidad metabólica para
degradar nutrientes importantes en la fertilización del suelo (Cuervo, 2010).La fijación del
nitrógeno ha sido estudiada desde hace más de 100 años. En 1901, Beijerinck reporta la
interacción de microorganismos como Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clostridium y
Klebsiella, que lo fijan por asociación y algunos que forman simbiosis como Rhizobium y
Bradyrhizobium. En 1907, Ashby realizó estudios con Azotobacter en un medio libre de
nitrógeno, medianamente selectivo para bacterias fijadoras de éste, que permite el crecimiento de
bacterias fijadoras de nitrógeno y que se conoce como medio Ashby (Portela et al, 2013).

Dentro de las metodologías de obtención de estos biofertilizantes, se han desarrollado aislados de

suelos fértiles. Para la obtención de fijadores de nitrógeno se toman muestras del suelo y se
enriquecen en medios líquidos/sólidos libres de nitrógeno, en los que se encuentran todas las
sustancias necesarias para el crecimiento de los microorganismos, con el fin de que el aumento de
biomasa sea solo de organismos capaces de fijar nitrógeno. Con procesos como la prospección de
la biodiversidad, se identifican y caracterizan microorganismos que pueden ser aprovechados
para la producción de biofertilizantes (Duarte, 2016).

Así mismo, dentro de la trayectoria del grupo de Investigación de Procesos Avanzados de

Oxidación de la Universidad del Valle (GAOX) en el Laboratorio de Microbiología y
Biotecnología ambiental, se han realizado estudios donde se demostró la presencia de inóculos
diazótrofos provenientes de plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas en altas
concentraciones de amonio (Pérez-Peláez, Peña-Varón, & Sanabria, 2011). También se llevó a
cabo el enriquecimiento de microorganismos fijadores de nitrógeno de vida libre provenientes de
Sistemas de Tratamiento de Aguas Residuales Domésticas (STARD), concluyendo que los
inóculos provenientes sistemas de lodos activados son un potencial de biofertilizante como
alternativa a la recuperación de suelos degradados por salinidad y altas concentraciones de
amonio, (Rodríguez, C, 2014). Se ha evaluado la biofertilización de nitrógeno en suelos salinos a
partir de consorcios microbianos obtenidos de STARD, con el fin de encontrar y cultivar a escala
de laboratorio, organismos fijadores de nitrógeno de vida libre y evaluar la recuperación de FBN
en un suelo degradado por salinidad. (Rodríguez, O.M, 2014).

De manera más reciente (2017) se realizó el estudio de una alternativa a escala de laboratorio
para la producción de amonio y biomasa activa fijadora de nitrógeno a partir de una mezcla de
inóculos proveniente de sistemas de tratamiento de aguas residuales, además de la determinación
del modelo cinético del comportamiento de los microorganismos. (Arroyo, 2017). Finalmente,
estos inóculos fueron probados como una alternativa a la fertilización química en cultivos de
albahaca a escala de invernadero, donde se obtuvieron resultados promisorios de reducciones de
uso de fertilizante del 75% (Sarria 2018).
 3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Seleccionar y adaptar microorganismos fijadores de nitrógeno presentes en suelos intervenidos y

agua residual, a altas concentraciones de sales de amonio, como alternativa de obtención de
biofertilizantes resistentes a condiciones de suelo degradado por salinidad.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Enriquecer los inóculos de microorganismos fijadores de nitrógeno pertenecientes a un

lodo de un sistema de tratamiento de aguas residuales y un suelo intervenido.

- Adaptar los inóculos de microorganismos fijadores de nitrógeno pertenecientes a un suelo

intervenido y un lodo de un sistema de tratamiento de aguas residuales a condiciones de
altas concentraciones de sales de amonio.

- Comparar la adaptación entre los inóculos estudiados en diferentes fases del

experimento, utilizando técnicas dependientes y no dependientes de cultivo.
 4. MARCO TEÓRICO

4.1 ADAPTACIÓN MICROBIANA

Proceso biológico que ocurre cuando un cambio en el ambiente induce la expresión de un rasgo
alternativo no heredable, (ej. modificación de elementos constituyentes y de la organización
estructural) lo que proporciona a los microorganismos la capacidad para ajustarse a las nuevas
condiciones (Ocaña et al, 2010). La adaptación está limitada por la constitución genética; solo los
microorganismos que tengan el mejor genotipo pueden sobrevivir. Una mutación es un cambio
heredable del genotipo, que causa un cambio permanente del individuo, llamado mutante. Si es
capaz de prosperar bajo las condiciones ambientales de su entorno, el mutante se perpetuara, de
lo contrario perecerá. La mutación se puede producir de manera espontánea o por transferencia
genética con otros microorganismos mediante los procesos de transformación, transducción o
conjugación (Betancur et al, NA).

4.2 REACTORES SECUENCIALES EN BATCH (SBR)

Un reactor discontinuo secuencial (SBR) se puede definir como un sistema cuyo funcionamiento
se basa en la secuencia de llenado y vaciado Los procesos unitarios que intervienen son similares
a los de un proceso convencional de lodos activados. En ambos sistemas intervienen la mezcla,
reacción y sedimentación, pero entre ambos existe una diferencia importante, ya que, en las
plantas convencionales, los procesos se llevan a cabo simultáneamente en tanques separados,
mientras que en un sistema SBR los procesos tienen lugar en el mismo tanque (Paredes et al,
2014). La configuración del ciclo depende de las características del agua residual y los requisitos
legales a cumplir, y sigue fundamentalmente las siguientes etapas que pueden observarse en la
Figura 1.
 Figura 1. Ciclo de funcionamiento de un reactor SBR
Fuente Absun Palayesh, 2018

Etapa de llenado: El reactor es llenado con medio fresco, donde tiene todos los micro y macro
nutrientes necesarios para el crecimiento celular, esta etapa puede ser estática, mezclada o
aireada. En el llenado estático resulta una entrada mínima de energía y una concentración alta de
sustrato al final de la misma. En lodos activados puede presentarse desnitrificación con la
presencia de nitratos y generar condiciones propicias para la remoción del fósforo. Con respecto
al llenado aireado, se genera al comienzo de las reacciones aerobias y mantiene bajas
concentraciones de sustrato, situación importante cuando existen elementos tóxicos en el agua
residual.

Etapa de reacción: Es el tiempo en donde ocurren las transformaciones químicas, generalmente se

proveen condiciones de mezcla, en las que se permite el consumo de sustrato en condiciones
ambientales controladas que pueden ser oxicas, anóxicas o microarofilas, favoreciendo diferentes
tipos de metabolismos.

Etapa de sedimentación: La aireación y mezcla son detenidas para separar la biomasa del medio.
Su objetivo es la regulación de la concentración de sólidos en el reactor. Los sólidos se dejan
separar del líquido en condiciones de quietud, lo que resulta en un sobrenadante clarificado que
puede ser descargado como efluente. El tiempo de asentamiento puede durar entre 0,5 y 1,5 h, en
lodos activados se usa para prevenir que el manto de sólidos flote debido a la acumulación de
gas.

Etapa de vaciado: el sobrenadante clarificado se descarga del reactor como efluente. El exceso de
lodo activado residual también se remueve, empleando un tiempo que puede variar desde un 5 a
un 30 % del tiempo total. El proceso llevado a cabo en un SBR puede ofrecer muchas
características ventajosas para aplicaciones en investigación: el control de las condiciones de
funcionamiento es más fiable, preciso y versátil.

Está secuencias de pasos, permite a los microorganismos la adaptación a un tipo de sustrato o

medio de cultivo, consigue la degradación de la materia orgánica y la eliminación de nutrientes,
como el nitrógeno.

4.3 FIJACIÓN DE NITRÓGENO

La fijación de nitrógeno es el proceso a través del cual, microorganismos altamente

especializados, que incluyen algas, bacterias y actinomicetos reducen el nitrógeno hasta una
forma accesible para el crecimientos de las mismas (Figueroa, 2004). La Fijación de nitrógeno
puede darse de manera abiótica o biológica. A partir de la primera opción se forman óxidos por
consecuencia de la combustión de compuestos orgánicos y descargas eléctricas, los cuales
posteriormente son arrastrados en el suelo por la precipitación. Por otro lado, se da por Fijación
Biológica de Nitrógeno (FBN), por descargas eléctricas (rayos) o de forma artificial para la
fabricación de fertilizantes, por medio del proceso Haber Bosch (Travers, 2007).

4.3.1 Fijación Biológica de Nitrógeno

La FBN es una capacidad metabólica presente en muchas procariotas (Eubacteria y Arquea y

cianobacterias); se realiza por medio de la enzima nitrogenasa responsable de reducir los triples
enlaces de la molécula de N2 a NH4+ (Ecuación 1), que le permita incorporarse a la biósfera, el
complejo de la enzima nitrogenasa tiene dos co-proteínas, una que contiene hierro y molibdeno, y
otra que solamente contiene hierro. Para el funcionamiento de la nitrogenasa se requiere de
grandes cantidades de ATP y se inactiva en presencia de oxígeno (Travers, 2007). Este proceso
naturalmente es altamente consumidor de energía, por esta razón el triple enlace formado para
unir a los dos átomos de nitrógeno es duro de romper y el trabajo que desempeña la nitrogenasa
implica el consumo de 16 moléculas de ATP por cada molécula de N reducido.

Ecuación 1

La cantidad potencial de nitrógeno fijado por estas bacterias depende en gran medida del
ecosistema en el que los organismos son activos. Se destacan organismos anaerobios,
microaerobio, aerobios, así como también organismos con capacidad fotosintética y
metanogénica entre otros (Estrada, 2008).

4.3.2. Complejo enzimático nitrogenasa

Enzima proteica encargada de realizar la ruptura del enlace de N2 y la adición de tres átomos de
hidrógeno a cada átomo de nitrógeno (Wagner, 2012). La misma está compuesta por dos
proteínas solubles o metaloproteínas: la proteína del hierro o ferroproteina (dinitrogenasa
reductasa) y la proteína del MoFe o molido ferro proteína (dinitrogenasa). El MoFe es un
cofactor esencial en la dinitrogenasa. Las dos enzimas del complejo funcionan conjuntamente: la
dinitrogenasa reductasa reduce la dinitrogenasa, mientras que esta última reduce el nitrógeno.
Ambas enzimas son necesarias para que se produzca la fijación. Cada electrón transferido
requiere 2 ATP, como es necesario transferir cuatro pares de electrones por cada molécula de
nitrógeno reducido, el balance final de consumo es de 16 ATP. La fuente primaria de energía y
poder reductor es la sacarosa, un disacárido formado por una molécula de glucosa y otra de
fructosa originada en el proceso fotosintético (Calvo, 2011).

4.3.3. Microorganismos fijadores de Nitrógeno de vida libre

En su mayoría las bacterias fijadoras de nitrógeno, no están asociadas a plantas o animales. Estas
viven libres en el suelo o el agua y fijan nitrógeno para su propio beneficio, de estas bacterias de
vida libre, las cianobacterias son las más conocidas dentro del ámbito agrícola. Las especies
bacterianas de vida libre más ampliamente estudiadas pertenecen al filo de las proteobacterias,
del orden de las pseudomonales y de las enterobacterias y son; Azotobacter vinelandii (aerobio
obligado), Klebsiella pneumoniae (anaerobio facultativo), Clostridium pasteurianum (anaerobio
obligado), Rhodobacter capsulatus (bacterias fotosintéticas) y varias especies de Anabaena y
Nostoc (cianobacterias formadoras de heteroquistes). El nitrógeno fijado por estos organismos
solo llega a ser disponible para el ecosistema circundante, generalmente cuando la bacteria muere
(Fisher & Newton, 2002).

Las bacterias fijadoras de nitrógeno en vida libre, son frecuentes en todo tipo de suelo y se
encuentran principalmente en la rizosfera de las plantas superiores. Pueden ser heterótrofas,
cuando utilizan como fuente de energía (carbono orgánico) restos vegetales o, autótrofas, cuando
son capaces de obtener el carbono del CO2 atmosférico, mediante la fotosíntesis. También se
presentan organismos aeróbicos y anaeróbicos en este grupo de fijadores. (Orozco, 1999) Según
Rodríguez (2009), entre las bacterias fijadoras libres, las más numerosas y eficaces son las
aeróbicas.

4.3.4. Resistencia microbiana a la salinidad

Los ambientes salinos naturales son acuáticos o terrestres. Estos poseen una microflora nativa, la
cual es pieza clave para los ecosistemas. Los ambientes salinos poseen una diversidad de grupos
bacterianos, los cuales poseen adaptaciones evolutivas en su plano fisiológico y estructural, que
les permite sobrevivir a estas condiciones extremas. Las bacterias halófilas obligadas sólo pueden
desarrollarse en una concentración de 1,5 M de NaCl equivalentes. Asimismo, toleran bien las
altas temperaturas, ya que los ambientes cálidos donde se desarrollan (suelos áridos y agua de
lagunas endorreicas) pueden llegar a los 50 ºC (Calderón, 2015)

Las bacterias halófilas se han definido como quimioheterótrofos, adaptándose a la disponibilidad

de nutrientes que se encuentran en el medio. Pese a esto, se han registrado casos de bacterias
halófilas que han fijado dióxido de carbono en un principio de fotosíntesis. La actividad de las
bacterias halófilas involucra degradación de materia orgánica, fijación de nitrógeno y producción
de metabolitos que son cedidos para otros microorganismos o para las plantas mismas (Castillo y
Carvajal, 2011; Frioni, 2011).

Un ejemplo de hábitat para bacterias halotolerantes son los sistemas de tratamiento de agua
residual. Estos lodos residuales, cuando no contienen sustancias tóxicas, pueden ser compostados
y ser usados para mejorar la calidad de los suelos y estimular a la población microbiana para que
promueva la degradación de contaminantes orgánicos, ya que son ricos en materia orgánica,
macro y micro nutrientes.

4.4 DEGRADACIÓN DEL SUELO

La degradación de los suelos y tierras se refiere a la disminución o alteración negativa de una o

varias de las ofertas de bienes, servicios y/o funciones ecosistémicas y ambientales, ocasionada
por procesos naturales o antrópicos que, en casos críticos, pueden originar la pérdida o la
destrucción total del componente ambiental.

La degradación de los suelos puede ser física, química y biológica como se muestra en la Figura
2. En la degradación física se destaca la erosión y la compactación; y consiste en la pérdida
físico-mecánica del suelo a causa del agua o del viento con daño en sus funciones y servicios
ecosistémicos. En la degradación química se resalta la salinización de los suelos, la acidificación
y la contaminación, debida en general al uso excesivo de riego y fertilizantes y como
consecuencias de las actividades mineras e industriales. En la degradación biológica, el proceso
de degradación más importante es la pérdida de materia orgánica, que influye en la disminución
de la actividad biológica y en procesos de descomposición y mineralización. (IDEAM, 2015).
 Figura 2. Procesos de degradación de suelos
Fuente: IDEAM, 2015

En muchas ocasiones la degradación es compleja, en la medida en que puede presentarse de

forma física, química y biológica al mismo tiempo, o una de ellas puede ser el comienzo de otras.
Cuando estas ocurren en tierras con climas secos se llama desertificación. Las causas de la
degradación de los suelos y de sus servicios ecosistémicos pueden ser de diferente índole: social,
económica, cultural y por amenazas naturales y seminaturales como son la variabilidad climática
y el cambio climático, entre otras. Sin embargo, se puede afirmar en forma general, y de acuerdo
con la política para la gestión sostenible del suelo, que las causas son el uso, manejo y gestión
insostenible de los suelos del país, que a su vez tiene otras causas. Esta degradación afecta
directamente la oferta de servicios ecosistémicos de los suelos, y con ello se genera la amenaza a
la supervivencia humana
4.4.1 Degradación del suelo por salinidad

La salinización es proceso químico de origen natural o inducido por las actividades antrópicas
Corresponde al proceso de aumento, ganancia o acumulación de sales en el suelo, es decir, al
incremento de la salinidad. Por lo general, el aumento de sales en el suelo y en concentraciones
elevadas afecta las características fisicoquímicas y biológicas de los suelos y sus servicios
ecosistémicos, entre ellos el desarrollo de las plantas, especialmente de cultivos y la biota edáfica.
En consecuencia, se considera como un proceso de degradación de suelos (IDEAM et al, 2017).
.

4.4.2 Salinidad en el suelo

Se define como la concentración de sales totales en el suelo (se incluyen las sales en solución,
intercambiables y poco solubles). El estado de salinidad de un suelo no indica por sí solo su
origen, es decir, si es natural (primario o secundario) o antrópico. La medición de la salinidad se
realiza con la conductividad eléctrica (CE) y sus relaciones con el contenido de bases
intercambiables (Na, K, Ca, Mg) y de aniones. Para el estudio de la salinidad, los suelos se
clasifican en salinos, sódicos y salino – sódicos (IDEAM et al, 2017).

La salinidad de un suelo puede cuantificarse a través de la medición de la conductividad eléctrica

del líquido filtrado a partir del suelo saturado. Se emplea un conductímetro. Para determinar la
conductividad se sumerge el conductímetro en el extracto del suelo, aquel establece un potencial
eléctrico y las sales disueltas conducen la corriente eléctrica que es proporcional a su
concentración. La conductancia media se asocia directamente con la concentración de las sales
disueltas. Según el sistema internacional la unidad de conductividad es el Siemens (Pernasetti,
2010).

Ecuación 2

Dónde: S = (medida de la conductancia eléctrica)

dS/m = define la conductividad de un material; es inversa a la resistividad
Un suelo salino es aquel que contienen en la zona radicular una cantidad de sales disueltas en la
solución del suelo elevada, Conductividad Eléctrica (CE) suficientemente alta para restringir el
desarrollo de los cultivos. La reacción de estos suelos va de neutra a ligeramente alcalina. El pH
puede variar entre 7 y menos de 8,5. El PSI (Porcentaje de Sodio Intercambiable) se mantiene por
debajo de 7, por lo que la estructura no se ve afectada (CVC, 2015). La clasificación de los tipos
de salinidad se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Clasificación de salinidad del suelo para el Valle del Cauca. (CVC, 2015)

CE
Definición PSI
(Ds/m)
No salino – No sódico 0-2 > 15
No salino – ligeramente sódico 0-2 0-7
No salino – sódico 0-2 7 - 15
Ligeramente salino – No sódico 2-4 > 15
Ligeramente salino – ligeramente sódico 2-4 0-7
Ligeramente salino-sódico 2-4 7 - 15
Moderadamente salino – No sódico 4-8 > 15
Moderadamente salino – ligeramente sódico 4-8 0-7
Moderadamente salino – sódico 4-8 7 - 15
Fuertemente salino – No sódico 8 – 16 > 15
Fuertemente salino – ligeramente sódico 8 – 16 0-7
Fuertemente salino – sódico 8 – 16 7 - 15
Muy fuertemente salino – No sódico > 16 > 15
Muy fuertemente salino – ligeramente sódico > 16 0-7
Muy fuertemente salino – sódico > 16 > 15
4.4.4 Naturaleza de las sales solubles

Las sales pueden encontrarse en dos estados: disueltas en solución dentro de los espacios
disponibles en la estructura del suelo o precipitadas en forma de cristales. El contenido y los tipos
de sales cambia de acuerdo a la humedad edáfica, la capacidad de intercambio catiónico (CIC) y
el pH. Durante el periodo húmedo aumentan las sales en solución, disminuyen las cristalizadas y
adsorbidas. Durante el periodo seco el comportamiento es inverso. Las sales más abundantes
están formadas por cuatro cationes; de sodio, calcio, magnesio y potasio y cuatro aniones;
cloruro, sulfato, carbonato y bicarbonato (Pernasetti, 2010).

4.5 ESTRATEGIAS DE REMEDIACIÓN DE SUELOS SALINOS

La recuperación de suelos salinos es esencialmente el proceso donde la solución de suelo con alta
concentración de sales es reemplazada por otra menos salina. La concentración y los mecanismos
de transporte de sales de la solución del suelo responden a mecanismos que controlan la
eficiencia de la lixiviación. La eficiencia de la lixiviación se mida a partir de la cantidad de sales
removida desde la zona de las raíces, y esta depende de la concentración de sales y la distribución
en el suelo, la composición de los solutos, la estructura del suelo y los métodos de manejos de los
sistemas de riego.

4.5.1 Lavado

El método más utilizado para la recuperación de suelos salinos es el lavado o la lixiviación de las
sales solubles con agua de baja salinidad; este método consiste básicamente en aplicar una lámina
grande de agua para disolver las sales y removerlas de la zona radical del cultivo. Aunque para
lavar un suelo salino es indispensable que éste sea permeable y que exista una salida para el agua
de drenaje, también la tolerancia del cultivo a establecer es importante. El método hidrotécnico
consiste en manejar la cantidad y calidad química de las aguas disponibles para mantener las
sales solubles y las intercambiables a un nivel que no afecten, directa o indirectamente, el
desarrollo de los cultivos y, según Richards (1980), es el procedimiento más efectivo para
eliminar el exceso de sales solubles del suelo (Serrato et al, 2002).
4.5.2 Remediación con la utilización del yeso

El yeso es un material que desde el punto de vista agronómico desempeña tres funciones en el
tratamiento de suelos: mejoramiento, acondicionamiento y fertilización El yeso que se utiliza en
la agricultura es el fosfoyeso, que es un producto de la fabricación del ácido fosfórico a partir de
rocas fosfatadas usando ácido sulfúrico. A nivel mundial la cantidad producida de fosfoyeso es
superior a 150 millones de toneladas, lo que ha ocasionado en algunos países como España
problemas de manejo sobre el impacto ambiental (Hernández, 2011).

4.5.3 Biorremediación

La biorremediación es una tecnología que utiliza el potencial metabólico de los microorganismos

(su capacidad de biodegradación) para limpiar terrenos o aguas contaminadas (Watanabe, 2001).
También se puede definir como un grupo de tratamientos, contra la contaminación de un medio,
que aplica sistemas biológicos para catalizar la destrucción o transformación de compuestos
químicos en otros menos tóxicos (Atlas & Unterman, 1999; Hughes et al, 2000). Estos
microorganismos utilizan su potencial enzimático para mineralizar los compuestos contaminantes
o degradarlos hasta productos intermedios, en un ambiente aerobio o anaerobio. Existen factores
limitantes (King et al, 1997) como son: nutrientes esenciales (nitrógeno y/o fósforo), aceptores
adecuados de electrones, condiciones medioambientales apropiadas (pH, potencial redox,
humedad), inexistencias de poblaciones microbianas con potencial enzimático.

4.6 ESTADISTICA DESCRIPTIVA

Rama de la estadística que formula recomendaciones de como resumir, de forma clara y sencilla,
los datos de una investigación en cuadros, tablas, figuras o gráficos. El objetivo de las tablas o
cuadros es proporcionar información puntual de los resultados. Las gráficas muestran las
tendencias y pueden ser histogramas, representaciones en “pastel”, “cajas con bigotes”, gráficos
de líneas o de puntos de dispersión. En general, para resumir o presentar los datos obtenidos de
un proyecto de investigación inicialmente se debe tratar de ubicar cómo se distribuyen, lo cual se
realiza de acuerdo con la escala de medición de cada variable. Algunos datos deben resumirse en
un estimador de promedio y otros en uno de dispersión.

El estimador de promedio indica la tendencia central o cifra que representa mejor el valor de la
muestra, la cual puede ser: Promedio o media (aritmética), obtenido con la suma de todos los
valores individuales entre el número total de valores; representa el punto de equilibrio de la
distribución de los datos. Mediana, que representa la cifra o valor que divide la muestra en dos
mitades, es decir, el valor donde 50% de la población está por debajo o arriba del mismo. Moda o
valor más frecuentemente encontrado en las mediciones. Las medidas de dispersión para las
variables cuantitativas son tres: la desviación estándar o desviación típica, los rangos
intercuartílicos y los valores mínimo y máximo. Todas permiten entender cómo se alejan los
datos del promedio y la distribución dentro de los límites medidos. (Rendón et al, 2016).

4.7 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN MICROBIANA

Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias
objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la
presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas
horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una
incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan
componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una
sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar
(Cercenado et al, 2010) En la Tabla 2 se muestran las pruebas bioquímicas utilizadas en este
trabajo de grado y su interpretación.

Tabla 2. Interpretación de pruebas bioquímicas

Resultado
Prueba Propósito
Positivo Negativo
Determina la capacidad Cambio de color en el medio de Ningún cambio de
TSI que tiene un rojo a amarillo indica la color en el medio
microorganismo para fermentación de la glucosa lactosa indica ausencia de la
 fermentar la glucosa, y sacarosa (pico de flauta ácido/ fermentación de los
lactosa y sacarosa. profundidad ácida: A/A. tres azúcares (K/K)
-
Cambio de color en el tercio del
medio (parte inferior), indica
fermentación de la glucosa, pero
no de la lactosa ni sacarosa (pico
de flauta alcalino/ profundidad
ácida: (K/A).
-
Cambio de color en dos tercios
del agar (parte inferior y medio),
indica la fermentación de la
glucosa y lactosa pero no de la
sacarosa.

Cambio a un color
Cambio a un color púrpura más amarillo, ausencia de
Descarboxilación de la
LIA fuerte indica presencia de la la enzima y
lisina
enzima: K/K. fermentación del
carbohidrato: K/A.
Determina la capacidad de
un microorganismo de
desdoblar la urea formando Si el medio vira a un color Si no hay cambio de
UREA
dos moléculas de Rosado intenso o púrpura color
amoniaco por acción de la
enzima Ureasa
Determinar la capacidad de
un microorganismo de
utilizar el citrato de sodio
CITRATO Color azul Color verde
como única fuente de
carbono para su
metabolismo y crecimiento
 La parición leve y
diminutas
La aparición rápida y sostenida de
Determinar si la bacteria burbujas de gas al cabo
CATALASA una cadena de burbujas de gas o
posee la enzima catalasa de 20 a 30 segundos
efervescencia
luego de adicionado el
reactivo

Color azul profundo en un tiempo

menor
No hay desarrollo del
Determinar la presencia de de 10 segundos. Se considera
OXIDASA color o un tono
la enzima oxidasa positivo lento a confirmar cuando
amarillo
el color se
desarrolla entre 10 y 60 segundos
Determinar producción de
Producción de color negro El medio queda igual
SULFURO H2S.
Determinar si la bacteria
Amarillo (la bacteria
S puede degradar Rojo: presencia de indol (el
no puede degradar el
I triptófano a indol a través triptófano fue degradado)
triptófano)
M INDOL de Triptofanasa.
La bacteria sólo crece
Determinar si la bacteria es Difuminación del crecimiento de
MOTILIDA en la
Móvil la bacteria hacia los lados
D línea de inoculación

4.8 HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU

FISH es una técnica molecular que ha sido ampliamente usada en la cuantificación y descripción
de células microbianas presentes en los lodos activados, las aguas residuales y ecosistemas
naturales. En esta técnica, los microorganismos son tratados con un fijador e hibridados con
sondas específicas marcadas con colorantes fluorescentes en una lámina portaobjetos.
Posteriormente las láminas son observadas en un microscopio de fluorescencia. Para el presente
estudio se utilizaron mezclas de diferentes sondas; una de ellas, compuesta por una mezcla de las
sondas Nit3 y NitB, que permiten reconocer grupos microbianos asociados al ciclo del nitrógeno
como, las bacterias nitrificantes.
 5. METODOS

5.1 INOCULOS SELECCIONADOS

Se seleccionaron 2 tipos de inóculos líquidos, estos se encontraban previamente enriquecidos en

reactores tipo SBR en el laboratorio de microbiología ambiental, los inóculos utilizados fueron
1) 100 mL de inóculo proveniente de un sistema de tratamiento de Agua Residual Industrial -
ARI (RL), que trata los efluentes líquidos de una industria productora de extractos de levadura y
bio-ingredientes para la nutrición, ubicada en la ciudad de Tuluá y 2) 50 mL de inóculo de suelo
de uso agrícola en la zona de Candelaria (RS). Los inóculos fueron llevados al laboratorio a
temperatura ambiente (27°C ± 2) para el montaje de los reactores biológicos.

5.2 FASE 1: Reactivación del crecimiento de inóculos.

Se montaron reactores tipo SBR en botellas de vidrio de 1 L. Las botellas tenían un volumen de
trabajo de 750 mL con una proporción v/v de sustrato: inóculo de 2:1 Las condiciones de
operación y etapas del ciclo de los reactores se muestran en la Tabla 3. El proceso de la fase de
reactivación del crecimiento de los inóculos se muestra en la Figura 3.

Tabla 3. Condiciones de operación de los reactores en la Fase 1.

Parámetro Valor Unidad

Tiempo de reacción aerobia 4 Horas
Tiempo de sedimentación 45 min
Volumen Inóculo 250 mL
Volumen sustrato 500 mL
Volumen útil 750 mL
Régimen de flujo Mezcla completa --
Tipo de aireación Difusores --
 Aireación 1,5 LPM
48 horas

Sedimentación
Llenado 45 min
500 mL de sustrato
fresco

Sobrenadante
500 mL
Inoculo 250 mL

Figura 3. Etapas de un ciclo de operación de los reactores que fueron inoculados con suelo y
lodo.

El medio de cultivo utilizado para alimentar los reactores fue un medio selectivo para
microorganismos fijadores de nitrógeno, RBA (DSMZ, 2007).La composición de este medio se
muestra en la Tabla 4.

Tabla 4. Composición del medio RBA para los reactores

Compuesto Cantidad Unidad

Solución A
KH2PO4 0,1 g
K2HPO4 0,9 g
NaCL 0,1 g
CaCl2.2H2O 0,1 g
Mg2SO4.7H2O 0,1 g
Na2MoO4. 2H2O 0,005 g
MnSO4.H2O 0,005 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
Elementos traza SL- 6 3 mL
Solución B 50 mL
Agua destilada 950 mL
 Solución B
Sacarosa 1 g
D- glucosa 2 g
Piruvato de sodio 1 g
D-Manitol 2 g
Agua destilada 50 mL

Los reactores, se colocaron de forma inclinada a 45 grados para favorecer la mezcla completa
por medio de la aireación durante todo el tiempo de reacción. El montaje de esta fase se muestra
en la Figura 4. Cada tipo de inóculo tuvo su reactor replica.

Figura 4. Montaje de reactores con sus réplicas.

5.3 FASE 2: Adaptación a condiciones salinas

Una vez renovado el crecimiento de los inóculos, los reactores fueron expuestos a diferentes
concentraciones de sales de amonio. La sal utilizada fue sulfato de amonio que corresponde a un
fertilizante ampliamente utilizado en el Valle del Cauca, este fertilizante es acidificante y provoca
aumentos de la CE (Alarcón, 2002). Las concentraciones de amonio y CE utilizadas durante esta
fase experimental se muestran en la Tabla 5.
 Tabla 5. Concentraciones de amonio y conductividad eléctrica del sulfato de amonio utilizadas
en la segunda fase de experimentación.

Sulfato de Amonio
Semana Concentración mg/L N
Conductividad (Ds/m)
1 50 1,59
2 100 2,33
3 250 5,24
4 450 12,78

Se montaron reactores tipo SBR, que consistieron en botellas vidrio de 500 mL, con un volumen
útil de 300 mL, la proporción en volumen de sustrato: inóculo fue de 2:1. Los reactores
estuvieron a temperatura ambiente, mezcla completa y aireación. Las condiciones de operación
de los reactores durante esta fase se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Condiciones de operación para los reactores en la fase 2.

Parámetro Valor Unidad

Tiempo de reacción aerobia 48 Horas
Tiempo de sedimentación 45 min
Volumen Inóculo 100 mL
Volumen sustrato 200 mL
Volumen útil 300 mL
Régimen de flujo Mezcla completa --
Tipo de aireación Difusores --

El medio de cultivo utilizado fue el mismo que en la fase de enriquecimiento (Tabla 4, Medio
RBA). Al inicio de cada semana de operación se aumentó la concentración de sulfato de amonio
a los reactores, conforme lo mostrado en la Tabla 6. En esta fase experimental cada reactor tuvo
su réplica y blanco (control) que consistía en un reactor sin la adición de la sal.
5.4 SEGUIMIENTO DEL PROCESO

Una vez por semana se realizó la cuantificación de Amonio (NH4+) y nitratos (NO3). Estas
variables físico químicas siguieron el protocolo establecido en el Standard Methods (2012). Se
realizó también la medición de pH, Oxígeno Disuelto (OD) y Conductividad Eléctrica. La
densidad poblacional (Biomasa) se realizó mediante el método de peso seco y técnicas
dependientes de cultivo.

Se realizó recuento en placa al final de cada semana, con el objetivo de seguir el cambio en las
poblaciones microbianas. Los medios utilizados fueron, agar nutritivo, Eosin Methylene Blue
Agar (EMB) y Medio selectivo para diazótrofos, (RBA).

Se realizaron pruebas bioquímicas para la identificación de los géneros asociados a la fijación de

nitrógeno. Las pruebas bioquímicas realizadas fueron TSI, LIA, SIM, citrato, catalasa y oxidasa.
Adicionalmente se realizó la detección de microorganismos por medio de la técnica molecular de
Hibridación In Situ con Fluorescencia (FISH), que permitió observar la morfología y agrupación
de otros grupos de bacterias.

5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Debido a que los resultados corresponden a una observación, se utilizó estadística descriptiva
para el análisis del presente trabajo. Diagramas de barra para la Fase experimental 1 y 2, así como
para el recuento en placa realizado en ambas fases del experimento.
 6. RESULTADOS Y ANÁLISIS

6.1 FASE 1. REACTIVACION DEL CRECIMIENTO DE INOCULOS

Se montaron reactores tipo SBR para seleccionar y reactivar el crecimiento de microorganismos

fijadores de nitrógeno presentes en los inóculos. Se realizaron las mediciones de la concentración
biomasa al inicio y final del ciclo de operación de los reactores, con el objetivo de observar si
existían cambios entre las concentraciones. En la Figura 5 se muestran los diagramas de barra con
la concentración de biomasa en RL y RS al inicio y final de los ciclos de operación.
2,5

2,0

1,5

1,0
Biomasa g/L

0,5

0,0

-0,5

-1,0 Media
Media ± DE
-1,5 Min-Max
Puntos Atipicos
-2,0 Extremos
Lodo Suelo
Inoculos

Figura 5. Promedio del cambio entre las concentraciones de biomasa en los reactores (RL y RS) al
inicio y final de los ciclos de la fase de renovación del crecimiento de inóculos
*DE: Desviación Estándar, Min: Mínimo, Max: Máximo

La Figura 5 muestra que ambos inóculos (Suelo y lodo) presentan la misma tendencia al inicio y
final del ciclo del reactor SBR (4,0 – 5,0 g/L). Según Cerón et al 2012, la fijación de nitrógeno
está relacionada con el aumento de la biomasa, lo que a su vez favorece la presencia de otros
grupos metabólicos involucrados en el ciclo del nitrógeno, debido a la disponibilidad de otras
formas de nitrógeno. La fijación de nitrógeno y la concentración de biomasa están relacionados
de acuerdo a la estequiometria de los procesos metabólicos presentados a continuación.

Ecuación 3

( ) Ecuación 4

La FBN es un proceso metabólico que demanda altas cantidades de energía, para la fijación de
una molécula de N2 se necesitan 16 moléculas de ATP y con ella se obtienen 2 moléculas de
amonio utilizadas por la célula, por ello el crecimiento celular no es tan rápido si se compara con
otras fuentes de nitrógeno. Eso refleja que, si la única fuente de nitrógeno para los
microorganismos es el atmosférico, requerirá mayor energía para obtener el nitrógeno necesario y
su crecimiento será más lento.

Por otro lado, durante esta fase, las condiciones ambientales de OD y pH estuvieron dentro de los
rangos que permiten la nitrificación, es decir rangos de pH entre 6,5 -7,5 y OD mayor a 2mg/L
(Pacheco et al. 2002). Esto debido a que las BFN proporcionaron el nitrógeno necesario en el
medio, siendo la única fuente de nitrógeno disponible.

La Figura 6 y la Figura 7. Muestran las diferencias en las concentraciones de nitratos y amonio en

los reactores de lodo (RL) y suelo (RS) al inicio y final del ciclo.
 3,0

2,5

2,0
Amonio mg/L NH4
1,5

1,0

0,5

0,0
Media
Media ± DE
Min-Max
-0,5 Puntos Atipicos
Lodo Suelo Extremos
Inoculos

Figura 6. Promedio del cambio entre las concentraciones de Amonio de los dos reactores (RL y RS) al
inicio y final de los ciclos de la fase de renovación de los inóculos
*DE: Desviación Estándar, Min: Mínimo, Mx: Máximo

0
Nitratos mg/L NO3

-2

-4

-6

-8
Media
Media ± DE
Min-Max
-10 Puntos Atipicos
Lodo Suelo Extremos
Inoculos

Figura 7. Promedio del cambio entre las concentraciones de nitratos de los dos reactores (RL y RS) al
inicio y final de los ciclos de la fase de renovación de los inóculos
*DE: Desviación Estándar, Min: Mínimo, Mx: Máximo
De la Figura 6 y 7 se puede evidenciar la variación de la concentración tanto para el inoculo de
suelo como para el inoculo de lodo a lo largo de los ciclos del reactor SBR, esto sugiere la
presencia de otros grupos de microorganismos, como por ejemplo los microorganismos
nitrificantes encargados de transformar el amonio a nitrato en condiciones aeróbicas. Las
reacciones de la nitrificación (Aveñado, 2011) se muestran a continuación.

Ecuación 5

Ecuación 6

La nitrificación es un proceso clave en el ciclo del nitrógeno en muchos ecosistemas. Por

ejemplo, en los ecosistemas terrestres este proceso es de crucial importancia debido a que a la
larga regula directa o indirectamente el balance del nitrógeno inorgánico en los suelos. Así como
se muestra en las Figuras 6 y 7 donde las concentraciones de nitratos disminuyen a medida que el
ciclo en el reactor avanza y al final del ciclo las concentraciones de amonio son más elevadas,
evidenciando crecimiento celular y con ello la fijación de nitrógeno al inicio del ciclo de los
reactores.

Por otro lado, en la Figura 8 se muestra la densidad poblacional en unidades formadoras de

colonia según el medio de cultivo en el que fueron sembradas las bacterias, pertenecientes a RL
Y RS al inicio y final de la fase experimental 1.
 1,0,E+08

1,0,E+07
Densidad bacteriana en UFC/mL
1,0,E+06

1,0,E+05

1,0,E+04

1,0,E+03

1,0,E+02

1,0,E+01

1,0,E+00
Inicio Final Inicio Final
Lodo Suelo

RBA EMB NUTRITIVO

Figura 8. Densidad poblacional de los reactores RL y RS presente en tres medios de cultivos al

inicio y al final de la fase de reactivación de inóculos
*UFC: Unidades Formadoras de Colonias, RBA: Medio selectivo para diazótrofos, EMB:
Methylene Blue Agar

Debido a que esta fase experimental, corresponde a una fase de reactivación del crecimiento de
los inóculos, no se puede apreciar el aumento significativo de una u otra especie entre el inicio y
final de la fase. Sin embargo se observa el incremento en la concentración de bacterias del medio
de cultivo RBA en el inóculo del suelo correspondiente a BFN. Es importante anotar que al no
tener una fuente de Nitrógeno en el medio, durante cuatro semanas de operación el crecimiento al
final de esta fase se explica a partir de la fijación de Nitrógeno.

La Fase experimental 1 mantuvo a los reactores RL y RS en condiciones que le suministraron al

sistema el nitrógeno necesario para su crecimiento celular, permitieron activar su capacidad
fijadora de nitrógeno y además garantizar la presencia de microorganismos nitrificantes y otros
asociados al ciclo del nitrógeno, como se describe en el ciclo global del nitrógeno de la Figura 9.
Una vez suministrado el nitrógeno, era asimilado por las BFN, obteniendo concentraciones de
amonio de hasta 3 mg.L-1. La fijación de nitrógeno era nuevamente activada una vez las
concentraciones de amonio en el medio fueran consumidas.
 Figura 9. Ciclo del nitrógeno
(1) Fijación de nitrógeno. (2) Oxidación aeróbica de amoníaco a nitrito por bacterias.
(3) Oxidación aeróbica de nitrito a nitrato por bacterias. (4) Desnitrificación clásica.
(5)Desnitrificación de la oxidación anaeróbica de amoníaco (Anammox). (6) Amonificación
respiratoria. (7) Amonificación asimilatoria. (8) Oxidación aeróbica de amoníaco a nitrito por
arqueas Los puntos indican oxidación aerobia de hidroxilamina y nitrito desasimilatorio vías de
reducción de la desnitrificación aeróbica de nitrificadores. Fuente. Klotz yStein (2010).

6.2 FASE EXPERIMENTAL 2: CONDICIONES DE ESTRÉS SALINO

Las condiciones de estrés salino a las que fueron expuestos RL y RS superan las características
de suelos degradados por salinidad que se han reportado como inhibidores de BFN. (CVC, 2015).

Los reactores RL y RS fueron operados con las mismas condiciones ambientales que en la Fase
experimental 1, pero cada semana se aumentó la concentración de sal en el medio (150 mg.L-1).
La forma de amonio utilizada fue sulfato de amonio (NH4+) debido a los aumentos de su
Conductividad Eléctrica (CE). La Figura 10 presenta los cambios de la concentración de amonio
al inicio y final de los ciclos de operación de la fase experimental 2 en los reactores RL y RS.
 350
Concentración Amonio (mg/L)
300
250
200
150
100
50
0
0 100 250 400 0 100 250 400
Inoculo Lodo Inoculo Suelo
mg/L NH4

Inicio del ciclo Final del ciclo

Figura 10. Cambio entre las concentraciones de amonio al inicio y final de los ciclos de
operación de los reactores RL y RS de la Fase de condiciones de estrés salino
Eje horizontal: Concentraciones de amonio añadidas al medio cada semana

El aumento de la cantidad de amonio adicionado en cada tratamiento, tuvo un efecto significativo

desde la primera concentración. Esta situación, muestra que una vez adicionada la primera
concentración de sal, no existe diferencia entre la concentración de amonio al inicio y al final del
ciclo en los reactores. Por lo tanto, el amonio adicionado no fue utilizado como fuente de
nitrógeno, quedando en exceso en el medio. Esto es resultado del desbalance de la relación C: N
que tienen los microorganismos en el medio. Al aumentar la cantidad de nitrógeno, sin aumentar
la cantidad de fuentes de carbono la relación C: N disminuye, lo que limita el crecimiento celular
y el consumo de nitrógeno, mientras se presenta una acumulación de nitrógeno en el medio.

La situación es diferente si se observan las diferencias entre las concentraciones de nitratos al

inicio y final de los ciclos del reactor SBR como se muestra en la Figura 11. La diferencia entre
las concentraciones de nitratos evidencia que las bacterias nitrificantes presentes en los reactores
continuaron el proceso de nitrificación, aun con las condiciones de estrés salino presente en los
reactores. Para este proceso, los microorganismos podían usar tanto el nitrógeno suministrado,
como el de la FBN.
 14,0
13,0
Concentración Nitratos (mg/L)

12,0
11,0
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0 100 250 400 0 100 250 400
Inoculo Lodo Inoculo Suelo
mg/L NH4
Inicio del ciclo Final del ciclo

Figura 11. Concentraciones de nitratos al inicio y final de los ciclos de operación en RL y RS de

la Fase de condiciones de estrés salino
Eje horizontal: Concentraciones de amonio añadidas al medio cada semana

La Figura 12. Muestra las concentraciones de biomasa al inicio y final de los ciclos de operación
de los reactores RL y RS.
 5,2
4,8
Concentración de Biomasa (g/L) 4,4
4,0
3,6
3,2
2,8
2,4
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0 100 250 400 0 100 250 400
Inoculo Lodo Inoculo Suelo
mg/L NH4

Inicio del ciclo Final del ciclo

Figura 12. Concentración de biomasa al inicio y final de los ciclos de operación de los reactores
RL y RS de la fase de condiciones de estrés salino
Eje horizontal: Concentraciones de amonio añadidas al medio cada semana

La Figura 12 muestra que, una vez adicionada la primera concentración de amonio, la biomasa no
presento diferencias significativas en su concentración, a pesar de que las concentraciones
disminuyeron durante los primeros ciclos con niveles de estrés salino, principalmente en RL. Lo
que indica que la biomasa al igual que en el caso del nitrato no utilizo la fuente de nitrógeno
suministrada para su crecimiento celular, pero este pudo inhibir su crecimiento dentro del reactor
en los primeros ciclos de operación de la fase experimental 2. Los resultados mostrados
anteriormente señalan que los inóculos provenientes de un sistema de tratamiento de aguas
residuales industriales y de suelo con vocación agrícola en la zona de Candelaria son capaces fijar
nitrógeno en condiciones normales y asimilar el nitrógeno en condiciones de estrés salino. La
cantidad de microorganismos presentes según las diferentes concentraciones de amonio, se
presentan en la Figura 13.
 1,00E+08

Densidad bacteriana en UFC/mL

1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
Medio de
1,00E+03
1,00E+02 RBA
1,00E+01 EMB
1,00E+00
0 100 250 400 0 100 250 400
Lodo Suelo
mg/L de NH4

Figura 13. Densidad bacteriana de los reactores RL y RS presente en dos medios de cultivo al
final de los ciclos de la Fase de condiciones de estrés salino
*RBA: Medio selectivo para diazótrofos, EMB: Methylene Blue Agar
Eje horizontal: Concentraciones de amonio añadidas al medio cada semana

Los resultados muestran que la cantidad de BFN estimadas fue alta, tomando como línea base los
resultados obtenidos en la fase experimental I. Durante esta fase las BFN lograron adaptarse a las
diferentes concentraciones de salinidad adicionadas a los reactores e incluso incrementar sus
concentraciones. En la Figura 13 se evidencia que el RL presentó incremento mayor en la
concentración de bacterias que RS, lo que sugiere que las bacterias presentes en el sistema de
tratamiento de aguas residuales podrían ser halotolerantes, pues según estudios realizados por
Ramadoss et al (2013) sobre microorganismos halófilos y halotolerantes, señala que son un grupo
capaz de crecer bien en los medios que contienen un rango de NaCl entre 1% – 33% (p/v) es
decir una CE mayor a 17 Ds.m-1.

Los resultados anteriores demuestran que los inóculos obtenidos de los Sistemas de Tratamiento
de Aguas Residuales enriquecidos en reactores SBR son capaces de asimilar y adaptarse al
amonio en condiciones de estrés salino, además de fijar nitrógeno si el amonio no se encuentra
presente en el medio.
6.3 PRUEBAS DE DETECCIÓN BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA

De los dos inóculos se obtuvieron 5 aislamientos (3 del lodo y 2 del suelo) a los cuales se le
hicieron pruebas bioquímicas de acuerdo con el Bergey’s manual of determinate bacteriology
editado por Holt et al., (1994). Los aislamientos de lodos correspondían a bacterias Gram
negativas y los suelos a bacterias Gram positivas. En la Tabla 7 Se muestran los resultados
obtenidos de las pruebas para el suelo y el lodo.

Tabla 7. Pruebas bioquímicas aplicadas a colonias aisladas de lodo y de suelo

Resultado
Prueba Lodo Suelo
Colonia 1 Colonia Colonia 3 Colonia 1 Colonia 2
TSI K/A K/A K/A K/A K/A
LIA K/A K/A K/A K/A K/A
UREA - - - - -
CITRATO + + + + +
Catalasa - - - - -
Oxidasa + + - - -
Sulfuro - - - - -
Indol - - - - -
SIM
Motilid
+ + + + +
ad

Como se puede observar en la Tabla 7. Se utilizaron dos pruebas para identificación preliminar
con lectura inmediata (Catalasa y oxidasa) La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los
microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso que se libera en forma de burbujas.
La prueba bioquímica oxidasa permite determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción
de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que activa la oxidación del
citocromo el cual es reducido por el oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de
hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de
electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromo oxidasa
se encuentra en las bacterias aerobias y algunas anaerobias facultativas. La oxidasa positiva
sugiere la presencia de bacterias nitrificantes, pues es la enzima encargada de realizar
transformaciones en la nitrificación dentro del ciclo del nitrógeno (Kuypers, Marchant, & Kartal,
2018). Además, los géneros de interés como Azospirillum y Burkholderia o Pseudomonas, son
oxidasa positivos, lo que permitió seleccionar esta técnica para identificar y seleccionar los
aislamientos reduciendo el número de bacterias a evaluar. De la misma forma géneros como
Azotobacter, Klebsiella y Enterobacter de igual interés son oxidasa negativa. (Velandia, 2016).

Mediante la técnica FISH, se realizó la detección de grupos microbiológicos diferentes a las

BFN, como lo son las bacterianas nitrificantes. Se tomaron muestras al inicio, mitad y final de
todo el estudio. Esta técnica utiliza fragmentos de secuencias de ADN, sonda marcada con
fluorescencia, con el fin de localizar una secuencia complementaria en el ADN (Lavaut et al,
2016). Existen varios tipos de sondas, pero para el caso de gen nif (involucrado en la FBN) no
hay descrita una sonda. Por lo tanto, en este experimento se utilizaron diferentes sondas de
bacterias nitrificantes, con el fin de determinar si las diferentes concentraciones de amonio
agregadas durante la fase experimental II afectaron los procesos del ciclo del nitrógeno llevados a
cabo en los reactores, esto debido a que todas las bacterias nitrificantes son de crecimiento lento y
sensibles a cambios en las condiciones de crecimientos (Aveñado et al, 2011). En la Figura 14 y
15 se presentan las micrografías de la técnica FISH, para RL y RS respectivamente, lo que
permitió corroborar la existencia de bacterias presentes en los reactores diferentes a las fijadoras
de nitrógeno.
 A B C

Figura 14. Micrografía de FISH tomada con microscopio Nikon 90i de (A) Microorganismos
nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3 (Rojo) al inicio de la fase
experimental I del reactor de lodo, (B) Microorganismos nitrificantes hibridados con mezcla de
sondas NITB y NIT3 (Rojo) con concentraciones de 250mg/L N en el reactor y (C)
Microorganismos nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3 (Rojo) al final de
la fase experimental II, ADN restante con DAPI (azul).

A B C

Figura 15. Micrografía de FISH tomada con microscopio Nikon 90i para reactor de suelo (A)
Microorganismos nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3 (Rojo) al inicio de
la fase experimental I (B) Microorganismos nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB
y NIT3 (Rojo) con concentraciones de 250mg/L N en el reactor (C) Microorganismos
nitrificantes hibridados con mezcla de sondas NITB y NIT3 (Rojo) al final de la fase
experimental II, ADN restante con DAPI (azul).
En la Figura 14 y 15 Se observa el aumento de las zonas hibridadas con la mezcla de sondas
NITB y NIT3. El género Nitrococcus mobilis pertenece al grupo de las bacterias nitrificantes
subclase b de las proteobacterias (NITB). Estas bacterias parecen estar presentes en reactores con
altas concentraciones de amonio y con concentraciones de sales elevadas (Aveñado et al, 2010).
Por lo que es de esperarse que este género prevaleciera al final de la fase experimental II en
comparación con otros géneros de bacterias oxidadoras de nitritos.
 7. CONCLUSIONES

Las bacterias provenientes del sistema de tratamiento de aguas residuales industriales (ARI) y del
suelo de vocación agrícola fueron capaces de utilizar la fijación biológica de nitrógeno como
mecanismo para incorporar el nitrógeno necesario y transfórmalo a amonio durante la fase de
enriquecimiento y consumir el suministrado en la segunda fase experimental para su crecimiento
celular.

Las BFN pertenecientes al inoculo del sistema de tratamiento de aguas residuales industriales y al
inoculo de suelo de vocación agrícola mostraron resistencia y adaptabilidad a las concentraciones
de sales adicionadas durante la segunda fase experimental. Los resultados de este experimento
sugieren aplicabilidad biotecnológica y son importantes al momento de definir las condiciones de
producción de biofertilizantes

Los inóculos evaluados podrían ser un potencial biofertilizante, como alternativa de recuperación
de suelos degradados por salinidad. Debido a su exitosa adaptabilidad a las condiciones de estrés
salino a las que estuvo expuesto durante la segunda fase experimental, en la que se evidencio que
las poblaciones de BFN se conservaron en el tiempo.

La adaptabilidad a las condiciones de estrés salino de grupos de bacterias diferentes a las

fijadoras de nitrógeno permitió que se llevarán a cabo los diferentes procesos relacionados con el
ciclo del nitrógeno dentro de los reactores durante las fases experimentales, como se puedo
observar con métodos como FISH.
 8. RECOMENDACIONES

Es necesaria la implementación de técnicas directas y estandarizadas para la estimación de la

cantidad de nitrógeno fijado en futuras investigaciones.

En posteriores investigaciones, es importante llevar a los reactores a concentraciones de estrés

salino más altas (extremas) para conocer la concentración límite en la que el sistema llegaría a
desestabilizarse y lograr determinar si las bacterias presentes en los reactores son consideradas
halófitas.

Llevar los inóculos seleccionados y adaptados a concentraciones de estrés salino a diferentes

ambientes, para ser probados y verificar la posibilidad que tienen de ser usados como un
biofertilizante para la recuperación de suelos degradados por salinidad.
 9. BIBLIOGRAFÍA

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