Temario Proteómica

Tema 1: Introducción a la proteómica Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA PROTEÓMICA
Observamos en la tabla la composición general en macromoléculas y otros elementos de E. coli. El porcentaje de agua es
significativo, y como en todos los seres vivos, supera el 70%. Las proteínas son componente en peso muy importante de
las células (15%) y son muy abundantes y heterogéneas, una bacteria como E. coli contiene más de 3000 proteínas
distintas; también los ácidos nucleicos (ADN y ARN) correspondientes a 1% y 6% respectivamente. Pero las proteínas
son las más abundantes y variadas porque intervienen en todos los procesos celulares. Están compuestas por una serie de
monómeros muy variadas, en los ácidos nucleicos hay cuatro diferentes.
Las proteínas:
 Intervienen en prácticamente todos los procesos celulares

 Son las macromoléculas biológicas más abundantes
 Están presentes en todas las células y en todas sus partes
 Presentan una gran variedad de estructuras y funciones
ESTRUCTURA
Hay 20 aminoácidos que se utilizan para construir las proteínas. Los aminoácidos tienen que ser muy diferentes para dar
lugar a 3000 proteínas distintas, como vimos en E. coli. Los 20 aminoácidos estándar encontrados en las proteínas son α-
aminoácidos. Tienen todos un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo átomo de carbono (el carbono α).
Difieren unos de otros en sus cadenas laterales, o grupos R, que varían en estructura, tamaño y carga eléctrica y que
influyen en su solubilidad en agua.
En todos los aminoácidos, a excepción de la glicina, el carbono α (asimétrico, anomérico) está unido a cuatro grupos
diferentes (un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo R y un átomo de hidrógeno; en la glicina el grupo R es otro
átomo de hidrógeno). El átomo de carbono α es, por tanto, un centro quiral. Debido al ordenamiento tetraédrico de los
orbitales de enlace alrededor del átomo de carbono α, los cuatro grupos diferentes pueden ocupar dos ordenamientos
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Acuicultura
diferentes en el espacio, por lo que los aminoácidos pueden aparecer en forma de dos estereoisómeros (p.ej: L-alanina, D-
alanina).
1.1. GRUPOS R APOLARES
Los grupos R de esta clase son apolares e hidrofóbicos. Las cadenas laterales de la alanina, la valina, la leucina y la
isoleucina tienden a agruparse entre sí en las proteínas, estabilizando las estructuras proteicas a través de interacciones
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Acuicultura
hidrofóbicas. La glicina tiene la estructura más simple y, aunque es apolar, su cadena lateral no tiene una contribución real
a las interacciones hidrofóbicas. La metionina, uno de los dos aminoácidos que contienen azufre, tiene un grupo tioéter
apolar en su cadena lateral. La prolina tiene una cadena lateral alifática con una estructura cíclica especial, con un grupo
amino secundario que reduce su flexibilidad.
1.2. GRUPOS R AROMÁTICOS
La fenilalanina, la tirosina y el triptófano, con sus cadenas laterales aromáticas, son relativamente apolares (hidrofóbicos).
Todos ellos pueden participar en interacciones hidrofóbicas. El grupo hidroxilo de la tirosina puede formar puentes de
hidrógeno y constituye un grupo funcional importante en algunos enzimas. La tirosina y el triptófano son
significativamente más polares que la fenilalanina debido al grupo hidroxilo de la tirosina y al nitrógeno del anillo
indólico del triptófano (el más complejo).
1.3. GRUPOS R POLARES SIN CARGA
Sus cadenas laterales no tienen carga, pero sí cierta polaridad. Los grupos R de estos aminoácidos son más solubles en
agua, o más hidrofílicos, que los de los aminoácidos polares, debido a que contienen grupos funcionales que forman
puentes de hidrógeno en el agua. En esta clase de aminoácidos se incluyen la serina, la treonina, la cisteína, la asparagina
y la glutamina. La polaridad de la serina y treonina proviene de sus grupos hidroxilo, en el caso de la cisteína de su grupo
sulfhidrilo, que es un ácido débil y puede establecer enlaces de hidrógeno débiles con el oxígeno o el nitrógeno, y en el de
la asparagina y de la glutamina de sus grupos amido.
1.4. GRUPOS R CARGADOS POSITIVAMENTE (BÁSICOS)
Dictamina algunas propiedades de las proteínas, como es su carga neutra (carga positiva a pH neutro). Los grupos R más
hidrofílicos son aquellos que están cargados, ya sea positiva o negativamente. Los aminoácidos en los que los grupos R
tienen una carga neta positiva a pH=7 son la lisina, que tiene un grupo amino primario adicional en su cadena alifática; la
arginina, que tiene un grupo guanidinio cargado positivamente y la histidina, que contiene un grupo imidazol. La histidina
puede estar cargada positivamente como no tener carga a pH=7 debido a su pk a próximo a la neutralidad.
1.5. GRUPOS R CARGADOS NEGATIVAMENTE (ÁCIDOS)
Los dos aminoácidos que tienen grupos R cargados negativamente a pH=7 son el aspartato y el glutamato, cada uno de los
cuales tiene un segundo grupo carboxilo.
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Estos últimos aa, dependiendo del pH del medio, sus cadenas están cargadas o no, y son los responsables que las proteínas
tengan carga neta positiva o negativa, debido a estas cadenas.
Enlaces tipo amida (extremo amino y extremo carboxilo)  enlace peptídico. Todas proteínas tienen al principio un grupo
amino libre y al final un grupo carboxilo libre. El pentapéptido (DEKRH) tendría carga +1 a pH neutro. A ph ácido los
grupos ácido carboxílico aceptan el protón y se neutralizan cargas negativas obteniendo un péptido con carga mucho más
positiva. Todas las proteínas deben tener un grupo amino libre y otro ácido carboxílico libre (terminal) porque no hay otro
aa a continuación  NH3+ libre y COOP- libre. El pentapéptido que vemos contiene desde su extremo amino un ácido
aspártico, ácido glutámico (tienen carga negativa), luego tiene lisina, arginina e histidina (carga positiva a pH neutro). Dos
cargas negativas y tres positivas sería positvo: +1.
Cuando hay más H+ en disolución, los grupos ácidos carboxílicos absorben el protón y tenemos un péptido con más carga
positiva (pH acido). A Ph básico  los grupos COO- ceden sus protones y tendríamos carga neta negativa.
TAMAÑO DE LA PROTEÍNA
A partir de 50 aa se llamaría proteína, menos es un polipéptido. Una proteína pequeña sería la citocromo c. La titina es una
proteína del sarcómero, es la proteína más grande conocida, casi 27000 aa. No son habituales proteínas de más de 2000
a.a, hay excepciones como la apolipoproteína B humana (4000 aa).
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Acuicultura
Péptidos y proteínas biológicamente activos existen en un amplísimo rango de tamaños y composiciones. No obstante, la
inmensa mayoría de las proteínas suelen contener menos de 2.000 residuos aminoacídicos. Algunas proteínas poseen una
única cadena polipeptídica pero otras tienen dos o más subunidades asociadas no covalentemente. Si las subunidades son
idénticas la proteína es oligomérica y éstas se denominan protómeros.
Dividiendo masa molecular entre 110 nos da una aproximación del número de aminoácidos que tiene una proteína.
DIFERENTE COMPOSICIÓN EN AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS
 La composición de aa en una proteína es muy variable.

 Los 20 aa comunes casi nunca se encuentran en igual cantidad en diferentes proteínas.
 Proteínas con funciones distintas difieren significativamente en el número relativo de cada residuo aminoacídico.
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Acuicultura
Proteínas con funciones muy diferentes difieren mucho en el nº relativo de cada residuo aminoacídico. Existen proteínas
formadas únicamente por aa, llamadas proteínas simples (p. ej.: ribonucleasa y quimiotripsina). Generalmente suelen tener
un elemento no proteico (proteínas conjugadas).
Algunas proteínas contienen grupos químicos diferentes de los aminoácidos. Ribonucleasa A y quimiotripsina contienen
solo aminoácidos en sus estructuras y son consideradas proteínas simples. Otras proteínas contienen grupos químicos
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Acuicultura
asociados permanentemente y se denominan proteínas conjugadas. La parte no aminoacídica suele llamarse grupo
prostético. Las proteínas conjugadas se clasifican por la naturaleza química de sus grupos prostéticos.
TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
5.1. Tres MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS utilizados en purificación de proteínas
1. Cromatografía de intercambio iónico, que explota diferencias en el signo y la

magnitud de las cargas eléctricas netas de las proteínas a un valor de pH
determinado. Se añade la mezcla de proteínas a la columna que contiene los
intercambiadores catiónicos. Las proteínas se mueven a través de la columna a tasas
determinadas por su carga meta al pH que se emplea. Con intercambiadores
catiónicos, las proteínas con cargas netas más negativas se mueven más rápido y
salen antes.
Se basa en las propiedades que tienen las proteínas para tener carga positiva o
negativa dependiendo del pH del medio. Podemos tener una matriz (resina) cargada -,
y esta matriz se une a cationes (matriz es intercambiador catiónico, porque está unido
a cargas negativas), si queremos separar las proteínas, las ponemos en disolución y
aquellas que tienen cargas + se unen a la resina y así las proteínas cargadas – son
repelidas y salen primero en las primeras fracciones porque son repelidas y las que
son menos negativas tardan más en salir, las que son ligeramente positivas tienen
unión más débil de esta manera las proteínas se van separando. Si introducimos sal
limpiamos la columna. Vamos cogiendo fracciones y vamos teniendo las distintas
fracciones en diferentes tubos. En proteómica se utiliza mucho esta técnica. Aquí se
separan por su carga.
2. Cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel), funciona bien

con proteínas globulares (colágeno). Se van a diferenciar por su tamaño,
se inyectan en una matriz porosa (hay muchas con distintos tamaños de
poros). Cuando añadimos muestra de distintos tamaños unas van a ser
excluidas pasando por fuera, no interaccionan con la matriz por ser muy
grandes, otras viajan plenamente pasando por los poros. Las de tamaño
intermedio unas pasan y otras no. Si pasamos un líquido vamos a ir
teniendo gradación en el tamaño de proteína, pasando primero las
grandes, después las que interaccionaron más con la matriz y por
último las más pequeñas. Cuanto más pequeñas más se retienen
(concepto análogo a la electroforesis).
3. Cromatografía de afinidad, que separa las proteínas por sus

especificidades de unión. De una mezcla compleja se recupera una
sola proteína. Las perlas de la matriz llevan algún tipo de ligando
(sustrato de alguna enzima, ligando de recepetor, etc). Introducimos
mezcla de proteínas y aquella que interacciona con el ligando se queda
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unida y el resto son eluídas. La que queda retenida en la columna es aquella que queremos separar. Para recuperar la
proteína se añade sal o más cantidad de proteína para arrastrar la que está pegada a la matriz. También se pueden
emplear anticuerpos que reconocen a esa proteína concreta.
5.2. ELECTROFORESIS
Migración de molécula cargada a través de campo eléctrico. La fuerza que impulsa migración es producto de campo por
carga en dirección al campo y la fricción se opone al avance.
Movilidad electroforética depende de la carga y la fricción. De
cátodo a ánodo. Se cargan diferentes muestras en los pocillos
en la parte superior de un gel de poliacrilamida. Las proteínas
se trasladan a través del gel cuando se aplica un campo
eléctrico. El gel mantiene al mínimo las corrientes de
convección producidas por pequeños gradientes de temperatura,
y también minimiza los movimientos de proteínas que no sean
los producidos por el campo eléctrico. Después de la
electroforesis se pueden visualizar las proteínas tratando el gel
con un colorante. Cada banda del gel representa una proteína
diferente. Las proteínas más pequeñas se desplazan más
rápidamente a través del gel que las grandes, por lo que se
encuentran cerca del extremo inferior del gel.
Este procedimiento no se utiliza, por lo general, para purificar

proteínas en grandes cantidades puesto que existen otros métodos alternativos y los métodos electroforéticos afectan a la
estructura y, por tanto, a la función de las proteínas. Sin embargo, es muy útil como método analítico. Su ventaja es que
las proteínas pueden visualizarse además de separarse, lo que permite realizar una estimación rápida del número de
proteínas en un gel. Además, permite la determinación de propiedades cruciales como su punto isoeléctrico y su masa
molecular aproximada.
ESTIMACIÓN DEL Pm DE UNA PROTEÍNA
La movilidad electroforética de una proteína en electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) está
relacionada con su peso molecular o masa molecular relativa (M r).
SDS desnaturaliza la estructura de las proteínas y las aplana, todas tendrán la misma forma, por lo que en la migración no
influye ni la carga intrínseca, ni la forma. Lo que separa a las proteínas es el tamaño, todas son empujadas con la misma
fuerza por el campo eléctrico. Proteína grande se fricciona más y migra menos. La migración es proporcional al logaritmo
de su masa molecular. Podemos deducir el Rf de la ecuación matemática, a partir de la masa molecular conocida de una
proteína, aquella masa molecular no conocida de otra proteína.
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Rf: relación entre la distancia de migración de la banda proteica y la longitud de corrida total del gel. Es decir, la distancia
desde el borde superior del gel hasta el frente de corrida.
ENFOQUE ISOELÉCTRICO
Proteínas se separan por sus puntos isoeléctricos.
Si se aplica campo eléctrico las proteínas se mueven y cada proteína migrará repelida por uno de los dos polos en
dirección contraria hasta que encuentre una zona de la tira donde el pH sea igual a su punto isoeléctrico, donde proteína
iguala sus cargas y ya no puede migrar más. Útil para separar mezclas proteicas complejas. Se puede combinar con otras.
ESTRUCTURA PROTEÍNA
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Acuicultura
Estructura primaria: secuencia de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Estructura secundaria, series alfa y hojas plegadas beta.
Estructura terciaria, estas series alfas y betas forman
dominios, son varias estructuras secundarias con función
específica, una porción de la proteína con una
funcionalidad específica, como dos hojas beta y tres
series alfas. Estos dominios se organizan en la proteína,
ya sea globular o fibrosa, tienen una forma dependiendo
de la interacción de sus dominios.
Estructura cuaternaria, las subunidades unidas por
uniones electrostáticas no covalentes forman estas
estructuras. Si tienen pocas unidades son oligómeros.
Las proteínas muy grandes son difíciles de analizar

enteras. Las proteínas tienen más de 200 aa entonces se fragmentan para analizarlas. Tenemos un reactivo (análogo
endonucleasas de restricción), son las proteasas, como las que producen páncreas. Estas proteasas tienen distintos orígenes
(bacterias, estómago, páncreas, etc). La tripsina es importante, con puntos de corte específicos. Cortan en el extremo C
terminal, en puntos donde haya residuos de lisina y arginina (básicos). La quimiotripsina también es muy importante. El
bromuro de cianógeno no es enzimático, corta en puntos con metionina. Muchas veces para analizar misma proteína se
digiere con distintas proteasas, así tenemos colecciones de proteínas distintas.
*A excepción del bromuro de cianógeno todos son proteasas.
**Residuos que aportan el punto de reconocimiento primario para la proteasa o el reactivo; la rotura del enlace peptídico
tiene lugar en el lado carboxilo (C) o amino (N) del residuo aminoacídico indicado.
DEGRADACIÓN DE EDMAN
Fenilisotiocianato (PITC), la digerimos y tenemos proteínas más pequeñas, más lejos estarán los residuos de Arg y Lys. La
condición es que el extremo aminoterminal del péptido esté libre o que sea por donde reacciona el péptido, pues muchas
proteínas en la naturaleza tienen este extremo modificado (protección), lo que complicaría la digestión. El extremo amino
reacciona con el fenilsotiocianato, se forma un derivado llamado feniltiocarbamilio. Despues con calor y medio acido este
primer aa se separa del polipéptido y queda unido al PITC y otro derivado llamado feniltiohidantoina. Cada proteína da un
PTH distinta debido a la cadena R1 que se puede distinguir por cromatografía y así se va a secuencias. Ante un pH más
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Acuicultura
ácido y aplicando calor se separan el derivado anilinotiazolinona y el péptido acortado en un aa, éste último vuelve a
purificarse y reciclarse en PITC para volver a hacer la ronda.
Un inconveniente es que con las sucesivas rondas pueden quedar impurezas en la columna, por lo que este método está
limitado a 50 residuos aminoacídicos. Este método puede ser automatizado.
CORRESPONDENCIA ENTRE LAS SECUENCIAS DE DNA Y AMINOÁCIDOS
Cada aminoácido es codificado por una secuencia específica de tres nucleótidos en el DNA. Esta es otra manera de
deducir la secuencia de aminoácidos de una proteína.
Los programas traducen con el código genético los tripletes obteniendo secuencias putativas (supuestas). Es la
correspondencia entre las secuencias de DNA y aminoácidos. Hay aprendizaje de los algoritmos para saber si son
codificantes o no las proteínas que se están traduciendo.
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Acuicultura
TEMA 2: INTRODUCCIÓN A LA PROTEÓMICA
Proteómica es el estudio del proteoma, el complemento proteico

del genoma. Estos términos fueron acuñados a mediados de la
década de1990 y son análogos a los términos “genómica” y
“genoma”, que describen la colección entera de genes en un
organismo y la disciplina que los estudia.
Una célula puede tener varios transcriptomas según el momento,

según la hora del día, si está bien alimentada o no, dependiendo de
la situación metabólica del entorno. Por este motivo, puede tener
diferentes proteomas.
PROCEDIMIENTOS PARA EL ESTUDIO DE LA

EXPRESIÓN GÉNICA
NORTHERN BLOT
INMUNOBLOT
En 1995 la bioinformática, la secuenciación automática del DNA, los

microarrays o las bases de datos de secuencias permitieron estudiar
simultáneamente mucha información. Es lo que se conoce como la
nueva biología.
Durante la década de 1990 ocurrió un gran crecimiento de las bases

de datos de secuencias de genes, ESTs y proteínas. Fueron muy útiles
como catálogos parciales de muchos organismos. El proyecto
genoma humano y otros similares en bacterias, levaduras, nematodos
y Drosophila incrementaron exponencialmente el tamaño de las bases
de datos.
MICROARRAY
Imagen ampliada de un microarray de DNA. Cada mancha que

resplandece en este microarray contiene DNA de uno de los 6200 genes
del genoma de la levadura (Saccharomyzes cerevisiae). El microarray
ha sido hibridado con ácido nucleico marcado fluorescentemente
derivado de mRNAs obtenidos cuando las células crecían normalmente
en cultivo (verde), y cinco horas después de que las células empezaran a
producir esporas (rojo). Las manchas amarillas representan genes que
no cambian sus niveles de expresión durante la esporulación. La
imagen está ampliada; el microarray mide realmente 1,8x1,8 cm. Te
aporta una gran cantidad de análisis.
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Acuicultura
Durante la década de1990 ocurrió un gran crecimiento de las bases de datos de
secuencias de genes, ESTs y proteínas
Fueron muy útiles como catálogos parciales de muchos organismos
El proyecto genoma humano y otros similares en bacterias, levaduras, nemátodos y

Drosophila incrementaron exponencialmente el tamaño de las bases de datos.
Imagen ampliada de un “microarray” de DNA. Cada mancha que resplandece en

este “microarray” contiene DNA de uno de los 6.200 genes del genoma de la levadura
(Saccharomyzes cerevisiae). El “microarray” ha sido hibridado con ácido nucleico
marcado fluorescentemente derivado de mRNAs obtenidos cuando las células crecían
normalmente en cultivo (verde), y cinco horas después de que las células empezaran a
producir esporas (rojo). Las manchas amarillas representan genes que no cambian sus
niveles de expresión durante la esporulación. La imagen está ampliada; el “microarray” mide realmente 1,8 x 1,8 cm.
CICLOS VITAL DE UNA PROTEÍNA
La proteína debe plegarse de forma adecuada, hay proteínas

que no sufren el proceso post-traduccional adecuado y no se
pliegan correctamente, estas proteínas dañadas se degradan
cuando se les une una molécula de ubiquitina (moléculas
pequeñas), así estará marcada para su destrucción. El
encargado de eliminar estas proteínas marcadas por ubiquitina
es el proteosoma. Algunas proteínas pueden necesitar
fosforilación, unión de un glúcido, etc. La vida media puede ser
variada (horas, días, meses….). Al finalizar su ciclo vital
estarán marcadas por ubiquitinas.
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Acuicultura
GENOMA HUMANO: GENES CODIFICANTES DE PROTEÍNAS
Solo el 2% codifica proteínas, una parte de este porcentaje es conocido. Las enzimas son las más abundantes, se unen
ácidos nucleicos para regular su expresión un 10%.
MODOS ALTERNATIVOS DE EXPRESIÓN GÉNICA
Los genes eucariotas están fragmentados en exones e intrones (los exones se traducen). Hay cinco variantes por gen, por
ejemplo, el gen de la calcitonina codifica esta calcitonina con acción hormonal. Es el responsable de la disminución de la
concentración de calcio, pues este gen produce calcitonina en la tiroides. Se unen los cuatro primeros exones, se traduce
a preproteína y, tras el procesamiento, tenemos la proteína funcional.
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Acuicultura
En el cerebro, el exón 4 se elimina y el
exón 5 es el que queda para dar otro
péptido que ejerce una función similar,
pero en las células cerebrales. Sus
secuencias de aminoácidos no se
parecen, pero provienen del mismo gen.
PREDICCIÓN DE PRODUCTOS
PROTEICOS EN CUATRO
ORGANISMOS
Genes ortólogos: genes o proteínas de

especies diferentes que poseen entre sí
una relación de secuencia y funcional
clara. Ejemplo: hexoquinasa en cuatro
organismos distintos, lleva a cabo la
misma función, la misma secuencia en
organismos distintos.
Genes parálogos: genes o proteínas

presentes en la misma especie, que
poseen una relación de secuencia y
función claras entre sí. Es lo mismo, pero en individuos distintos.
Hay muchos genes que dan lugar a proteínas parecidas, por lo que la identificación de una en concreto es compleja. Si
aumenta el número de genes, aumenta el número de genes parálogos.
PROTEÓMICA ANALÍTICA
El proteoma: 30 -80 % de los posibles productos génicos
Nivel de expresión de las proteínas por célula: 10 1-102 y 104-

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Proteínas en múltiples formas postraduccionales
Las células varían su composición proteica a lo largo de su

vida, por lo que el proteoma va cambiando. El nivel de
expresión de las proteínas por célula va de 101-102 y 104-
106. El proteoma es el 30-80% de los posibles productos
génicos. Las proteínas se pueden encontrar de en múltiples
formas postraduccionales.
APROXIMACIÓN TOP-DOWN
Extraemos la mezcla de proteínas de una célula o tejido,

obteniendo el proteoma de ese momento concreto. Primero
separamos las proteínas entre sí, las digerimos (con tripsina
por ejemplo) y generamos péptidos, que se puede analizar por espectrometría de masas (MS).
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Acuicultura
2D SDS PAGE: ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Inconvenientes de 2D SDS PAGE:
 Reproducibilidad dos electroforesis consecutivas

 Solubilidad marginal de algunas proteínas
 Serie isoeléctrica de una proteína por fosforilación, glicosilación
 Tinción variable de proteínas más o menos abundantes
La electroforesis en gel bidimensional es la técnica principal para el trabajo proteómico. Separa la mezcla compleja de
muestras utilizando dos propiedades diferentes de las proteínas. En la primera dimensión, las proteínas están separadas
según su punto isoeléctrico y en la segunda según su
peso molecular (tamaño). La proteína tratada con SDS
se carga negativamente. Las proteínas que se centran
en el PI, se separan según sus pesos moleculares. En
general se utilizan geles grandes 20x20 cm y se pueden
separa más de 10000 proteínas. Si la cantidad de
proteínas es de alrededor de 10 ng, se usa colorante
Coomassie y si la cantidad de proteína es de alrededor
de 0,5 ng, se pueden usar satines de proteína total de
plata o fluorescentes para la detección.
Debido a que algunas proteínas no solubilizan bien

puede ser que al repetir la técnica no obtengas los
mismos resultados, programas informáticos corrigen
estas deformaciones. También puede ser que tengas
series isoeléctricas y te encuentres proteínas iguales,
por lo que no se separan bien.
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Acuicultura
REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE UNA DIGESTIÓN EN GEL.
Se hace un agujero en gel, se

recupera, se elimina la poliacrilamida, se trata con tripsina y se eluyen los péptidos que ya podemos analizar en el
espectrómetro de masas.
*A excepción del bromuro de cianógeno todos son proteasas.
**Residuos que aportan el punto de reconocimiento primario para la proteasa o el reactivo; la rotura del enlace peptídico
tiene lugar en el lado carboxilo (C) o amino (N) del residuo aminoacídico indicado.
Tabla con las proteasas que se pueden emplear para fraccionar las proteínas que separamos en SDS-page.
RELACIÓN ENTRE EXPRESIÓN GÉNICA Y

NIVELES DE PROTEÍNA
Levadura (6000 genes)
 Expresión génica (microarray) 4000

 Niveles de proteína (2D-SDS-PAGE) 1000
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Acuicultura
APROXIMACIÓN BOTTOM-UP
En este caso, la mezcla de proteínas no se separa en

proteínas individuales. Llevamos a cabo la digestión
con proteasas sobre la mezcla. Se genera el conjunto
de péptidos de distintas proteínas, todas mezcladas y
se separan en péptidos individuales por
cromatografía. Cada péptido se inyecta en MS y
obtendremos muchos valores de masas distintos para
reconstruir las proteínas iniciales.
Tiene la ventaja de que no hay que usar electroforesis

bidimensional, pues es una técnica muy laboriosa,
mientras que la cromatografía en columna es más
reproducible y sencilla de aplicar.
¿Como separamos la mezcla de péptidos que hemos

obtenidos? Una técnica es la cromatografía liquida de alta resolución.
SEPARACIÓN DE PÉPTIDOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Para separar la mezcla de péptidos

y proteínas, una técnica clásica es
la cromatografía liquida de alta
resolución.
De esa manera en unas columnas

cromatográficas por ejemplo de
intercambio iónico (columnas
llenas de cargas negativas) pueden
separar los péptidos en fracciones.
Combinando por ejemplo con

varias cromatografías por ejemplo
con una de filtración molecular
(separa las proteínas por tamaño como por ejemplo la cromatografía de fase reversa: la columna está llena con algún
polímero que tiene cadenas alquiladas como ejemplo de hidrocarburo, y los péptidos van pasando por la columna en fase
reversa y unos interaccionan más que otros con los polímeros por lo que algunos se retrasan más que otros = se separan
por hidrofobicidad: los menos hidrofóbicos se adelantan y los más hidrofóbicos se retrasan).
En definitiva: combinando varias columnas primero separo los péptidos que he generado en esta digestión múltiple por
su grado de positividad y luego por su grado de hidrofobicidad y de esta manera puedo conseguir que en el
espectrómetro de masa lleguen uno por uno para que se obtenga una masa muy precisa de cada péptido. Esta es una
manera en la que podemos resolver una mezcla de péptidos.
“MUDPIT” (TÉCNICA MULTIDIMENSIONAL DE IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS)

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Acuicultura
 Se aplican los péptidos a un intercambiador catiónico
fuerte
 Los péptidos se eluyen en función del número de cargas
positivas
 Cada grupo se resuelve por RP-HPLC en función de la
hidrofobicidad de cada péptido
 Desde la columna los péptidos pasan directamente al
instrumento de MS para su análisis
Cromatografía en fase reserva: la columna cromatográfica está

rellena con algún tipo de polímero que tiene cadenas de
hidrocarburo. Los péptidos van pasando por la columna de fase
reversa e interaccionan de diferente manera con las cadenas de
hidrocarburo de manera que algunos se retrasan más con
respecto a otros y se separan por hidrofobicidad: los menos
hidrofóbicos se adelantan y los más hidrofóbicos se retrasan.
Combinando varias columnas primero separo los péptidos que

he separado en la digestión múltiple y luego los separo primero
por su grado de positividad y luego por su grado de
hidrofobicidad. De esta manera conseguimos que al
espectrómetro de masa lleguen uno por uno para obtener una masa muy precisa de cada péptido.
El MUDPIT: Tenemos unos péptidos con distintos grados de carga positiva que primero pasan por una cromatografía de
intercambio iónico y se van separando en función de su positividad. Primero salen los menos positivos a los que se le
aplica la columna cromatográfica de fase reversa y se obtienen los péptidos fraccionados.
RESEMEN: se pueden combinar distintas técnicas cromatográficas para obtener un resultado claro.
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Tema 3: Espectrómetros de masas Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
TEMA 3: ESPECTRÓMETROS DE MASAS
Los espectrómetros de masas son aparatos de

análisis que permiten describir con mucha precisión
la masa de los péptidos y las proteínas. Hasta los
años ’70 se usaban para moléculas orgánicas, pero
no para biomoléculas porque son moléculas mucho
más grandes. Gracias a las innovaciones del signo
pasada se pudo ampliar su aplicación a las
biomoléculas.
Las ventajas de los espectrómetros con respecto a

otros métodos analíticos son:
 Son muy sensibles: con cantidades de

picomoles (pmol) podemos llevar a cabo la
detección de una proteína o de un péptido
 Tienen una gran resolución: permiten
distinguir iones con masas muy similares
 Buena exactitud: la masa observada en el experimento se parece mucho a la masa esperada. Los resultados de
masa del espectrómetro siempre los comparamos con una base de datos por eso al exactitud de la técnica es muy
importante.
Partes de un espectrómetro de masas:
1. FUENTE DE IONES. El espectrómetro solo

puede resolver moléculas cargadas sometidas
a campos eléctricos y magnéticos. Para ello
la molécula debe ser cargada, debe ser un ion
y en fase gaseosa por ello la fuente de iones lo
que hace es vaporizar y ionizar el analito que
es la molécula que queremos analizar.
La vaporización se hace aplicando Tº PERO
esto no le sienta muy bien a las biomoleculas
(se desnaturalizan) PERO al final de los años
’80 se publican unos trabajos que hacen que
en los años ’90 se empiece a trabajar con las
tecnicas de MALDI y de ESI.
2. ANALIZADOS DE MASAS: es un
dispositivo que resuelve los iones, en sentido
químico o bioquímico, es decir que los ordena
en este caso según su masa
3. DETECTOR. Es donde impactan los iones y donde la señal eléctrica se convierte en el especto de masa donde en
la abscisa siempre tenemos el valor de carga/masa (m/z) y en ordenada la intensidad es decir el Nº de iones con
la misma m/z y que han impactado en el mismo lugar (iones con la misma m/z siempre deberían impactar en el
mismo lugar).
Los espectrómetros se van usando desde hace muchos años.
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1. FUENTES DE IONES. IONIZACIÓN DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS (EN FASE GASEOSA)
Son técnicas para convertir los partidos en fase gaseosa y cargados.
A. MALDI: Desorción/ionización con láser asistida por matriz: Tanakaet al. Proteinand polymeranalysis up to
m/z 100.000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. MassSpectrom. 2:151, 1988
La energía proviene de un láser, pero la energía no se dispara directamente a la biomolécula, sino que sobre una
matriz.
B. ESI: Ionización por electroespray: Fennet al. Electrospray ionization for mass spectrometry of large molecules.
Science246:64, 1989
Este es un método en fase liquida: las proteínas y los péptidos se disuelven en agua o un disolvente orgánico
sencillo como el acetonitrilo y por un proceso de formación de espray se evaporan y se cargan al mismo tiempo.
A. MALDI
Cada circulito depositamos una mezcla en fase liquida de

una matriz con la muestra de péptido que queremos analizar.
La matriz puede llevar uno de estos ácidos orgánicos: son

moléculas capaces de recibir la energía del láser y por ello
sus electrones se excitan y parte de esta energía la
transfieren al analito que a su vez se ionizan positiva o
negativamente. Durante este proceso de transferencia de
energía también hay un fenómeno de evaporación: el disparo
del láser sobre una de estas celdillas levanta una pluma de
moléculas de matriz y de analito y de estas las que están
cargadas pueden desplazarse por el aparato porque este
genera una serie de campos electromagnéticos.
La mezcla de matriz debe estar hecha para que haya más matriz que analito para que el disparo del láser por
probabilidad caída sobre todo sobre la matriz y no sobre el analito que si no se destruiría.
Las matrices para MALDI convierten la energía del

láser incidente en energía electrónica molecular.
Las fuentes de MALDI a veces se acoplan a

analizadores de tiempo de vuelo.
MALDI-TOF MS
Los iones entran en el tubo de vuelo en donde los

más ligeros se desplazan más rápido que los más
pesados hacia el detector.
Este tiempo de vuelo (TOF) puede ser convertido en

masa.
21
Típicamente, unos cientos de pulsos de láser de nanosegundos de duración permiten que se acumule información
suficiente para construir un buen espectro.
Una vez que el ion está cargado, una serie de

campos electromagnéticos los impulsan hacia el
detector. Los iones que tienen una masa más
pequeña se adelantan con respecto a los que
tienen una masa más grande. Usando unos iones
de masa conocida se puede convertir el tiempo
que tarda en volar el ion en una relación
masa/carga. El TOF es un analizador que da
datos muy precisos.
Cuando se usa una fuente de MALDI, una ventaja que tiene, es que suelen producirse en mayor cantidad iones
monoprotonales es decir con una única carga positiva donde el valor de la carga/masa es igual a masa porque la carga
(z) es igual a 1.
En una fuente de MALDI asociada a un TOF se suele realizar una extracción retrasada para mejorar la precisión de las
mediciones.
RETRASADA EN MALDI-TOF
Si los iones son acelerados con el

mismo potencial en un punto y a un
tiempo inicial concretos, los iones se
separarán según sus razones m/z.
Consiste en que cuando se generan los

iones al disparar los iones sobre la
matriz, los iones monoprotonados se
dispersan en un espacio pequeño. Lo
que se hace es que NO se conecta
inmediatamente la corriente al tubo de
vuelo sino que se realizan varios
disparo del láser para realizar una
pluma de iones muy grande en la que
habrá pequeñas diferencias entre los
iones con respecto al electrodo que
tiene que atraerlos hacia el detector.
Esta espera hace que los que estén más cerca del electrodo se van a acelerar más que los que están más lejos y de esta
manera todos van a partir del mismo sitio. Esto es importante porque si se aplicara la corriente desde el principio,
algunos partirían con más ventajas que otros debido a la “dispersión por la explosión” resultante del impacto del láser
de manera que no llegarían todos al mismo momento al detector y no impactarían de la misma manera y no generarían
la misma señal (los que tengan la misma m/z).
22
EFECTO DEL REFLECTRÓN EN MALDI-TOF
Otra modificación del MALDI-TOF es

añadir un reflectrón.
Cuando se generan los iones por

MALDI, la transferencia de energía del
láser es muy potente y eso hace que
algunos iones tengan tanta energía
cuando ya están en fase gaseosa, que se
descompongan en una molécula más
pequeño (= fragmento): a este proceso
se le denomina descomposición iónica
post-fuente.
Estos fragmentos lo que hacen es

perturbar la detección ya que por inercia
los fragmentos también vuelan, aunque
de manera más lenta que los iones y
también llegan al detector generando un
ruido en el espectro (impurezas).
Para mejorar esto, lo que hacen es introducir unos electrodos adicionales al final del tiempo de vuelo que generasen
campos electromagnéticos que redirigen los iones cargados hacia un nuevo detector (el verdadero) mientras que los
fragmentos que no son cargados seguían en línea hacia otro detector (que no voy a usar).
B. IONIZACIÓN POR ELECTROESPRAY (ESI)
A valores de pH ácidos las cadenas

laterales de los aminoácidos ácidos
aspartato y glutamato están protonados y
las aminas de los aminoácidos básicos
lisina, arginina e histidina cargadas
positivamente.
En la ESI la muestra se encuentran en un

medio liquido de normal de naturaleza
acida para potenciar que los AA básicos
como la lisina, la arginina o la histidina
tengan cargas positivas.
La muestra, que puede que venga

directamente del cromatógrafo, en el ESI
pasa por una aguja muy fina que está
conectada a un alto voltaje (3000-4000V).
La disolución al pasar por la aguja se

genera un espray en el cual el analito tiene carga positiva (por el alto voltaje que le hemos aplicado). Estas gotas se
23
hacen pasar por una pantalla de nitrógeno inerte o calor para evaporar las moléculas de agua y ya tenemos nuestros
iones cargados positivamente que pueden ir al analizador de masas.
Espectro ESI de una proteína con envuelta multicarga: una misma proteína adquiere distintas numero de cargas
positivas (≠ MALDI donde cada ion adquiere una sola carga positiva).
El número de cargas depende de la secuencia de AA, de su tamaño,
etc.
Espectro de masas de una proteína grande. Cada pico es un ion de la

misma proteína, pero con distinto número de cargas. Los picos que
están más a la derecha son los de carga menor, mientras que los que
están más a la izquierda es la misma proteína, pero con más carga
positiva. Cada pico adyacente es la misma proteína pero que varía por
1 carga positiva.
Siempre hay una serie de valores de carga preferido por una proteína
que depende de su naturaleza.
A partir de estos espectros se puede calcular la masa molecular de la proteína con mucha precisión mediante un
algoritmo que se llama deconvolución de carga.
En contraste con proteínas intactas, los péptidos con

masas 250-2500 existen típicamente como una mezcla
de iones con cargas [M+H]+, [M+2H]2+y
[M+3H]3+dependiendo del tamaño y del número de
aminoácidos básicos presentes. El ion [M+2H]2+suele
ser el predominante.
Los péptidos pequeños de hasta 2500 de masa

molecular suelen dar una versión monoprotonada, diprotonada y como mucho la triprotonada por electrospray (en este
espectro ya no sale).
Si la un estado de carga monoprotonado significa que es la m/1 y con un protón de más podemos decir que la masa de
este péptido es 1566,9 (si el ion es 1567,9 y le restamos 1 que es lo que pesa el H). En el caso del diprotonada puedo
hacer lo mismo, pero con el algoritmo de deconvolución de carga.
24
2. ANALIZADORES DE MASAS
Es la componente que me ordena los iones.
A. EL CUADRUPOLO
A. Cuadrupolo analizador de masas

Son 4 electrodos que están conectado a corriente, pero con polaridades alternas. En el centro hay el canal de
paso por donde pasarán los iones. Aplicando corriente a los polos se generan campos electromagnéticos que se
alternan para que el ion se ve atraído por uno, luego rechazado y atraído por otro y por ello van migrando,
describiendo trayectorias helicoidales. Esto tiene lugar siempre u cuando el cuadrupolo se ajuste para dejar
pasar iones de un determinado valor de masa/carga. PERO esta configuración m/z puede que no sea adecuada
para otro ion con otra M7z que en ese caso acabará estrellándose contra uno de los electrodos. Si modifico los
parámetro del cuadrupolo determino que iones paso.
B. Trayectorias de un ion de valor m/z seleccionado y de iones con otros valores de m/z
Espectrometría de masas en tándem (MS-MS): Si colocamos varios cuadrupolos en serie unos de tras de otros
estamos hablando de espectrometría de masas en tándem.
Triple quad: tengo 3 cuadrupolos:
 Q1
 q2
 Q3
Es una disposición clásica.
El Triple quad puede actuar como un escáner

completo por lo que el Q1 ya ordena los iones y los
otros dos, q2 y Q3, no actúan y obtenemos el resultado
en el detector.
25
Otra opción en el Triple quad en modo MS-MS (tándem) donde el Q1 que selección un único ion eliminando los demás.
La q2 es la celda de colisión, en ella habrá un gas noble con moléculas gordas como el argón para que el ion colisione y
se fragmente en iones más pequeños que van a ser resueltos por el Q3 (= analiza los fragmentos y los identifica).
B. LA TRAMPA IÓNICA
Son dos electrodos uno circular y luego uno superior y otro inferior. Se pueden aplicar campos electromagnéticos
variables que pueden atraer los iones en cualquier orientación del plano: esta mezcla de campos electromagnéticos lo
que hacen es tener a los iones flotando en el medio de la trampa. Los iones se mantienen en suspensión hasta que se
modifican los campos y se seleccione solo uno. La trampa iónica es una manera muy fina de seleccionar iones, es más
precisa que el cuadrupolo.
En la trampa iónica también se pueden fragmentar iones: se inyecta argón en un momento dado.
Se pueden combinar distintos tipos de analizadores: Combinación de separación por cromatografía líquida y
analizadores con una fuente ESI (LC-MS-MS)
Fuente de iones > Hago por ejemplo primero un espectro en

modo scanner completo (donde solo funciona Q1) en modo
que nos diga cuántos picos correspondientes a iones
tenemos en la mezcla. Una vez que tenemos la m/z de los
picos podemos hacer una selección con una trampa iónica,
por ejemplo. Si todos los iones en modo scanner completo
vienen de la misma proteína, voy a ir conociendo la
estructura la estructura de los distintos iones de esta última
lo cual me sirve para caracterizarla.
A partir de estos esquemas básicos de fuentes de iones y

analizadores, podemos realizar distintos montajes.
Q-TOF MS: Q es el cuadrupolo con un analizados de tiempo de vuelo (es más preciso del cuadrupolo).
26
Es un analizador de masas con cuadrupolo y analizador de tiempo de vuelo. Funcionalmente es idéntico a un triple quad
pero con el Q3 remplazado por un analizador TOF. La mejora consiste en que el TOF es capaz de conseguir mayor
resolución de masas que el cuadrupolo.
La celda de colisión es para fragmentar los iones.
Para aumentar la resolución de los fragmentos

ponemos un analizador de tiempo de vuelo que
además tiene un reflector o reflectrón que aumenta
la precisión de la detección y permiten seleccionar
los iones.
 Bio TOF III: Tiene un analizador de tiempo

de vuelo
 ESI-Q-q-TOF: Fuente de iones por electrospray + Cuadrupolo como analizados + q celda de colisión + Tubo de
vuelo
 QSTAR (LC-MS-MS): Fuente de cromatografía liquida + Espectrofotometría de masa en tándem
 AXIMA MALDI QIT TOF: AXIMA es la marca. Ionizador de MALDI + Tubo de vuelo + Cuadrupolo + Trapa
iónica
Una tecnología más moderna de esta última y que casi todos los analizadores de hoy en día tienen son los aparatos que
analizan iones por resonancia ciclotrónica de iones.
Espectrometría de masas por resonancia ciclotrónica de iones con transformada de Fourier (FT-ICR MS)
Necesitan para interpretar los

resultados de una transformación
matemática que es la transformada de
Fourier.
Son parecidos a una trampa iónica: es

una especie de cubo con electrodo en
varias caras y detectores en otras. El
ion una vez que ingresa en la celda de
resonancia ciclotrónica es que hay un
campo magnético que digamos es
paralelo a la entra de los iones y esta
combinación de campos magnéticos
hace que el ion orbite ay que la
27
corriente va cambiando. Por ello en ion va moviéndose diseñado una órbita. Este movimiento circular del ion tiene una
frecuencia de giro. Como le movimiento de giro no es estrictamente puro, se vas a generar unas ondas de frecuencia que
tratadas matemáticamente por la transformación de Fourier se genera una ecuación matemática pura que nos permite
saber la amplitud de este movimiento. El valor de amplitud de giro del ion se puede transformar en una relación m/z del
ion.
Este aparato es mejor porque en la naturaleza la magnitud que se puede medir con mayor precisión es la frecuencia.
Los iones orbitan bajo la influencia de un campo magnético a una frecuencia proporcional a su masa
28
Tema 4: Espectrómetros de masas de proteínas Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
TEMA 4: ESPECTRÓMETROS DE MASAS DE PROTEÍNAS
La aplicación de estas técnicas es

identificar las proteínas, decir cual es.
Eso se consigue midiendo con precisión
su masa y comparándola con las masas
que tenemos en una base de datos.
Las proteínas se pueden identificar con 2

métodos esencialmente:
 Huella péptica
 Secuencia de AA
 Espectro de fragmentación. Es una variante de la secuenciación de AA
1. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR SU HUELLA PEPTÍDICA (PMF)
Es un procedimiento que también se denomina “peptide mass

finger printing” o PMF.
Concepto: tengo una proteína con su extremo amino-terminal

y carboxilo-terminal. SI la digiero con una proteasa como por
ejemplo la tripsina que corta en los AA lisina y arginina, lo
que obtengo es una serie de péptidos más pequeños que se
denominana péptidos trípticos (porque los he cortado con
tripsina).
Esto péptidos los ionizamos con una de las fuentes que hemos
visto y los hacemos pasar por el espectrómetro de masa para
obtener su valor de m/z que es un numero: cada proteína se
puede identificar con unos números.
Si digerimos varias proteínas con tripsina, los sitios de cortes

serán diferentes y por ello los números. El conjunto de número
es la huella peptídica de cada proteína y derivan de la relación m/z de la proteína digerida.
Se puede usar la proteasa que queramos, PERO siempre se deben comparar proteínas que se ha digerido con la misma
proteasa para que la secuencia de corte sea la misma.
29
Una vez que tengo la huella peptídica de la proteína la comparo con las huellas peptídicas de TODAS las proteínas de la
base de datos: hay software que digieren virtualmente las proteínas con la proteasa que queramos y comparan las huellas
peptídicas con la huella de la proteína que estamos estudiando.
Identificación de una proteína por su huella peptídica: El valor de masa obtenido se compara con la lista de los valores de
masa de los péptidos trípticos resultantes de la digestión virtual de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de una
base de datos.
Efecto de la precisión y tolerancia de masa en el resultado de búsquedas en procedimientos de PMF
PROBLEMA: con tantas proteinas es

posible que haya coincidencia de
números.
Si uso el valor de m/z sin decimales en la

base de datos me van a selir 478 proteina
con un peptido con ese valor m/z. Si
aumento al precision añadiendo
decimales reducimos las posibilidades.
En este caso, la hemoglobina es una proteina que está en muchos organismos y se parece mucho entre vertebrados y
otros organismos por evolución sobre todo si estamos analizando un fragmento esencial de esta proteina que se ha
consevado mucho en la evolución.
La estimaciona del valor m/z debe ser MUY preciso.
Una identificación proteica veraz y no ambigua mediante PMF requiere

medidas de masa muy precisas
La digestión tríptica de la cadena alfa de la hemoglobina humana produce 14

péptidos, de los cuales VGAHAGEYGAEALER tiene una masa de 1528,7348
Da. El ion de este péptido con una carga positiva tiene un valor de 1529,7348.
La tabla ilustra el resultado de la búsqueda de emparejamientos del valor de
masa de este péptido con todas las proteínas humanas y de ratón en la base de
datos SWISS-PROT
Coincidencias de proteínas analizadas por PMF del

péptido con m/z1529,73
En PMF, medidas más precisas proporcionan datos más

útiles. Los instrumentos MALDI-TOF modernos con
extracción retrasada y analizadores con reflector son
capaces de alcanzar estos rangos de precisión.
Todos estos péptidos tienen secuencias diferentes, pero

dan la misma m/z hasta el segundo decimal.
30
Efectos de múltiples masas peptídicas en la identificación de proteínas por PMFa
Si cogemos un único valor de la hemoglobina humana NO se

podría identificar a la proteína. Pero si cogemos más valores
de la huella peptídica si que podemos identificar a la
proteína también en el caso de la hemoglobina humana que
es muy conservada (en el caso de la hemoglobina humana
podemos obtener hasta 14 valores de huella pepitica porque
se divide en 14 péptidos). En resumen: Identificar una
proteína por huella pepitica requiere coincidencias múltiples.
Las identificaciones precisas de proteínas requieren coincidencias múltiples
Cualquier digestión tríptica real de una proteína producirá múltiples péptidos que proporcionarán varios valores m/zpara
buscar en las bases de datos. Tres de los 14 posibles péptidos trípticos de la globina alfa humana producen una única
coincidencia
COMPLICACIONES EN LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR SU HUELLA PEPTÍDICA
 Exactitud de los valores m/z esperados vs. observados: que se parezcan lo más posible al valor virtual (si es
posible hasta 4 decimales)
 Coincidencias al azar m/z: si aumenta el tamaño de la proteína aumenta la probabilidad de las coincidencias al
azar. Como hemos visto en el caso de la hemoglobina: cuanta más larga es la secuencia de AA, es más probable
que la misma secuencia se encuentre en varias proteínas.
 Una proteína de 50 kDa rinde 25-40 péptidos trípticos: cuanto más grandes es la proteína más lisina y
arginina habrá y por ello más probabilidad de péptidos trípticos. Las huellas peptídicas en estas serán
compuestas por muchos números.
 Una mancha en 2D puede contener 2-3 proteínas
 Señales de proteínas contaminantes: la espectrometría de masa es tan sensible que puede que detecte cosas que
no son la muestra de estudio, sino que contaminación como puede ser queratina de la piel del operador.
Que hacemos:
 Se intenta mantener las bases de datos bien

mantenidas: no sean redundantes y que las
identificaciones sean correctas. Algunas
muy buenas son SWISS-PROT, UniProt,
NCBInr.
 Software: se constituyen de varias bases de
datos y varios algoritmos que hacen análisis
estadísticos de que las coincidencias no se
deban al azar.
31
2. SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM (MS-MS)
Incluso usando el mejor algoritmo comparativo como

Mascot y la mejor base de datos comparada como
SWISS-PROT, puede darse que tengamos 2 péptidos
con la misma m/z PERO no tengan la misma
secuencia y no pertenezcan a la misma proteína.
Lo que puedo hacer es usar la espectrometría de

masa en tándem para obtener la secuencia del péptido y ver su estructura (los AA que lo componen).
Los instrumentos de MS miden valores de m/z de péptidos y sus fragmentos y, por ello, reducen estas estructuras a
patrones de números
Por ejemplo, en relación con el péptido AVAGLAGVR, se puede calcular su masa con ayuda de los valores de masa
residuales de los aminoácidos, añadiendo 1 uma al extremo N-terminal y 17 uma al extremo C-terminal
Se puede representar el péptido como una serie de números, que es como el instrumento “ve” este péptido y su secuencia
POLIPEPTIDO: 9 AA donde el extremo

amino-terminal es la alanina y el
carboxilo-terminal es la arginina.
Si fragmento el péptido en sus residuos

aminoacídico correspondientes, cada uno
de los residuos tiene un valor de unidades
masas atómica.
Si los fragmentamos en diferentes sitios el

espectrómetro no daría diferentes valores:
 Si lo fragmentamos por el primero nos daría 72

 Si lo fragmentamos por el cuarto nos daría 299
 Etc.
Es decir que los fragmentos de un polipéptido el espectrómetro de masa los lee como números que puedo podemos
transformar en una secuencia de AA.
Fragmentación de iones peptídicos en MS-MS
Cuando iones peptídicos chocan con átomos de un gas inerte en la celda de colisión de un analizador triple quad o Q-TOF
o una trampa iónica, la energía cinética que absorben induce fragmentación
32
La estructura de un polipéptido se repite

periódicamente: es el grupo carboxilo de
un AA que se une al grupo amino del
siguiente a la derecha.
Cuando un polipéptido entra en la celda

de colisión y se choca con el argón el polipéptido se puede romper por cualquiera de los enlaces covalentes.
Dependiendo por donde se rompa, tenemos distintas series de iones:
 Si se rompe el enlace entre el carbono alfa y el carbono carbonílico, cuando hay una rotura, la carga suele
quedar hacia el lado amino-terminal o hacia el lado carboxilo-terminal (nunca se quedan las dos partes
cargadas). Cuando se queda cargado el extremo amino-terminal tendremos una serie de iones a, mientras que si
la carga se queda en el lado carboxilo-terminal tendremos la serie z de iones.
 Lo mismo pasa con el enlace entre el grupo ánimo y el carbono alfa: cuando se queda cargado el extremo amino-
terminal tendremos una serie de iones c, mientras que si la carga se queda en el lado carboxilo-terminal
tendremos la serie x de iones.
Estas dos rupturas nos pueden dar informaciones sobre las secuencias de péptidos, pero la ruptura que más
informaciones nos va a dar es la que sigue porque nos da información directa de la secuencia de los AA.
 Ruptura que separa los AA entre sí y que genera la serie b de iones si la carga queda en el extremo amino-
terminal y la serie y de iones si la carga queda en el lado carboxilo-terminal. Esta es la más impórtate porque
son iones que se generan por ruptura de enlaces peptídicos.
No hay preferencia por algún sitio de

ruptura que otro, la probabilidad es la
misma.
En el detecto vamos a ver SOLO los que

quedan cargados.
En este ejemplo, si el péptido se rompe y

la carga queda en el lado amino vamos
a ver la secuencia b4 formada por los
aminoácidos AVAG mientras que el otor
lado no volará porque no tiene carga. Si
la carga se queda en el lago carboxilo
obtendremos el ion y5 formado por los
aminoácidos LAGVR.
33
Representación del espectro de

fragmentación del péptido de arriba.
Se han anotado la identidad de los picos

correspondiente a la serie b y la serie y.
Con este espectro es posible identifica la
secuencia de AA del péptido: si al ion b3 le
quito el valor del b2 me valor residual del
AA.
Posibles fragmentos iónicos “b” e “y” del ion [M+H]+del péptido AVAGLAGVR. Se muestran las estructuras de los iones
b4e y5 originadas de la rotura entre los residuos de glicina y cisteína
Cuando se fragmentan iones con una sola carga sólo uno de los dos productos estará cargado y será detectado por MS.
Espectro MS-MS anotado del ion [M+H]2+del péptido AVAGLAGVR mostrando los iones “b” e “y”. Desde el extremo
N-terminal las roturas producen una serie ascendente de valores m/z (serie “b”) y una serie de valores m/z
complementarios descendentes (serie “y”). Las series “b” e “y” de iones indican la secuencia del péptido.
Deducción de la secuencia de un péptido.
Hago las diferencias y si tengo una tabla con el valor residual de los
20 AA ya sé que AA corresponde a cada resta.
34
3. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE SUS ESPECTROS DE FRAGMENTACIÓN (PFF)
Pocas secuencias (mancha 2D)
 Interpretación de novo del espectro: con el espectro limpio y bien anotado me muevo de izquierda a derecha
restando y calculado los valores residuales.
 Obtención de la secuencia del péptido: es decir la secuencia de AA
 Búsqueda de coincidencias en bases de datos (BLAST): mediante una herramienta de alineamiento (ejemplo
BLAST que una herramienta de alineamiento local) voy a una base de datos y miro mi secuencia del péptido a
que proteína se corresponde.
¿Qué hago si tengo muchas secuencias de péptidos? Es decir, si tengo muchos espectro de secuenciación y tengo que
hacer todo esto para cada una.
Puedo usar una herramienta que se llama SEQUET que me permite comparar espectros de fragmentación sin tener que
deducir la secuencia de AA del espectro.
Muchas secuencias (LC-MS-MS): Algoritmo que identifica proteínas por coincidencia directa del espectro MS-MS con
secuencias en bases de datos (SEQUEST)
Representación esquemática del modo en que opera el algoritmo SEQUEST
35
Tengo el espectro de fragmentación de un péptido con un valor de m/z de 813,95 que ya he fragmentado y puedo deducir
su secuencia de AA, PERO en este caso tengo muchos espectros.
Lo que hago es considerar el valor de m/z del péptido y buscar en la base de datos péptidos con el mismo valor de m/z.
Luego genero los espectros de fragmentación virtuales de cada uno de ellos y los compara con el nuestro y me da una
puntuación según en número de picos coincidentes.
De esta manera deduce la secuencia: si el que más que se parece es el primero (AVAGLAGVR) entonces la secuencia de
AA de mi péptido debe ser esta.
RESUMEN: Se parte del valor de m/z, se generan los espectros de fragmentación virtuales de los péptidos con m/z
parecida, se comparan con el real hasta encontrar el coincide y este será el que me da la secuencia de AA.
Resultado de SEQUEST en el que varios espectros de fragmentación de la misma proteína se han comparado. A veces
con suerte se puede llegar a realizar toda la secuencia de una proteína.
En negrita está la secuencia de los espectros de fragmentación que SEQUEST dice que coinciden y vemos que se cubre el
38% de la identificación (es muy buen resultado).
Ventana de SEQUEST mostrando la cobertura de secuencia en una proteína coincidente obtenida por correlación entre
espectros MS-MS y secuencias peptídicas
Las identificaciones más fiables de una proteína son aquellas en las que distintas secuencias de la proteína identificada
proporcionan coincidencias de alta calidad con los espectros MS-MS.
36
Tema 5: Aplicaciones de la proteómica Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
TEMA 5: APLICACIONES DE LA PROTEÓMICA
Aplicaciones de la proteómica:
 Caracterización del proteoma “proteome mining”: Identificación de tantos componentes del proteoma como
sea posible. Intento de identificar tantos componentes del proteoma como sea posible en un tejido, en un tipo
celular, etc. Es digamos elaborar un catálogo de composición.
 Perfilado de la expresión de proteínas “protein profiling”: Comparación de la expresión de un conjunto de
proteínas en dos muestras distintas. Por ejemplo, la distinción entro tumoral/normal, con covid/sin covid, etc. es
decir identificar las proteínas que marcan la diferencia entre dos condiciones.
Estas dos primeras son las aplicaciones más importantes e interesantes en acuicultura. Las dos siguientes son más de
investigación.
 Interacciones entre proteínas: Identificación de los componentes de complejos proteicos. Estudiar la ruta que
expresa la expresión de genes, o en la ruta que regula comunicación de cualquier proceso entre célula para saber
que proteínas lo regulan. Esto se puede estudiar desde el punto de vista de la genómica, pero sin duda desde el
punto de vista de la proteómica (saber que proteína la regula) es mucho más interesante.
 Modificaciones de proteínas: Detección de modificaciones postraduccionales en la estructura de la proteína. En
qué forma está una proteína cuando está activa, es igual a cuando se sintetizó en el ribosoma, es diferentes, etc.
son cuestiones más relacionadas con la investigación.
1. CARACTERIZACIÓN DEL PROTEOMA
Técnicas para llevar a cabo el proteome mining.
A. MEDIANTE 2D-SDS-PAGE Y MALDI-TOF MS
A partir de las proteínas se elaboran geles

bidimensionales y después se caracterizan una
por una las manchas o spots.
Generalmente este proceso está robotizado:

hace un mapeado del gel en el cual identifica
los spots y le asigna coordenadas. Luego
dentro de cada mancha hace varias incisiones
(es decir se queda con un trocito de acrilamida
donde habrá proteínas) y los mete en pocillos
donde se lavan para eliminar la acrilamida y
se digieren con proteasas como la tripsina. Se
vuelan, normalmente con MALDI y un analizador de tiempo de vuelo. Todos los valores de m/z que obtenemos, es decir
las huellas péptidas, se meten en una base de datos para encontrar las coincidencias que nos relacionen un conjunto de
valores de m/z con la digestión virtual para identificar las proteínas de la muestra, es decir cuantas tiene y cuales son.
La obtención del proteoma por geles 2D acoplada a espectrometría de masas permite identificar más de la mitad de las
proteínas en las manchas seleccionadas (NO del proteoma, sino que SOLO de las manchas que se han identificado bien).
A favor
37
Acuicultura
 Identificación del 50-75% de las proteínas en las manchas seleccionadas
 Mayor número de identificaciones en organismos con proteomas pequeños (virus, bacterias, levaduras) que
grandes (menos genes parálogos). La proteómica por geles 2D acoplada a espectrometría de masas se usa sobre
todo para proteomas pequeños porque tienen menos genes que se parecen.
En contra
 Muchas manchas de los geles de 2D contienen 2-5 proteínas. En la primera dimensión estamos separando por
isoelectroenfoque y es fácil que en un mismo spot tengamos 4-5-6 proteínas con el mismo punto isoeléctrico y
luego cuando separamos por m/z también habrá algunas con el mismo valor por eso el análisis se debe hacer en
varios puntos de la misma mancha porque es bastante improbable que cada mancha tenga un solo tipo de
proteína.
 El rango de detección por 2D es limitado (tinción). Hay que teñir el gel, PERO el rango de detección de los
colorantes es limitado es decir que puede que haya proteínas que no se unan con suficiente colorante como para
relevarse y que por ello puede que pasemos de largo muchas proteínas.
 Organismos más complejos poseen muchos genes parálogos que pueden producir péptidos idénticos. En los
genomas muy complejos puede que tengamos muchas proteínas con péptidos con la misma secuencia (= genes
parados).
B. MEDIANTE CROMATOGRAFÍA MULTIDIMENSIONAL DE PÉPTIDOS Y ANÁLISIS POR

ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM CON FUENTE DE ELECTROESPRAY (LC-ESI-MS-MS)
En lugar de basarnos en la electroforesis

bidimensional, que sería una aproximación total,
haríamos una aproximación bottom-up (de abajo-
arriba): separamos las proteínas por algún método
cromatográfico o por electroforesis monodimensional,
luego las digerimos con proteasas y una vez que
obtengamos todos los péptidos mezclados de la
proteína aplicamos la cromatografía liquida para que
nos separe los péptidos por su carga o su
hidrofobicidad. La cromatografía separa los péptidos
por distintos grados de carga positiva (en medio acido
los péptidos tiene carga positiva).
Tras ello, los picos van entrando en un

espectrofotómetro que como es en un medio liquido será con fuente de electroespray. Una vez en el espectrómetro de
masas se fragmenta los péptidos (MS-MS: espectrofotometría en tándem). Como tenemos muchísimos espectros de
péptidos, no lo resolvemos nosotros de novo, sino que vamos a comparar el perfil de fragmentación con un software que
nos busque en la base de datos el péptido con el mismo espectro de fragmentación. Luego varios péptidos que coinciden
en la misma proteína nos permiten identificar la proteína.
El 2D con diferencia a este método, nos deja sin saber algunas proteínas, o bien porque no las ha detectado o porque
forman un amasijo y no se resuelven para que el robot pueda picarlas. En la cromatografía en principio no se pierde
ninguna.
38
Acuicultura
Separación de péptidos por cromatografía en fase reversa
 RP LC-MS: Cromatografía líquida en fase reversa y

espectrometría de masas
 SCX-RP LC-MS-MS: Cromatografía con
intercambiador catiónico fuerte seguida de fase reversa
y espectrometría de masas en tándem
Cromatografía de fase reversa: en lugar que en la

cromatografía normal donde la molécula interacciona con el
líquido que hay dentro de la columna, en la fase reversa la
molécula interacciona con el relleno de la matriz que suelen ser bolita de sílice a las que están unidas cadenas
carbonadas de 18 carbonos (18C) que lo que hacen es retrasar a los péptidos más hidrofóbicos (que tienen más afinidad
por los hidrocarburos de la columna) y dejar pasar más fácilmente a los péptidos más polares que no son tan atraído por
el relleno hidrofóbico de la columna. Si a esto se le aplica una presión muy grande se puede obtener una separación muy
buena.
Cromatografía multidimensional: Se ponen las columnas cromatográficas en tándem y así se consigue separa muy bien
la mezcla de péptidos para que entren uno a uno en el cromatógrafo.
2. PERFILADO DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS
Comparación de la expresión de un conjunto de proteínas en dos muestras distintas
A. GELES 2D
Se comparan el conjunto de proteínas de dos muestras distintas relacionas

por algún hecho como puede ser un estado de enfermedad, una
temperatura distinta, etc. y el objetivo es encontrar alguna proteína que
nos justifique la diferencia entre las dos situaciones.
Es muy complicado encontrar un marcador.
Se puede hacer con la aproximación en geles 2D o por cromatografía

liquida al igual que para el proteome mining.
En la imagen vemos los geles 2D que se pueden comparar entre sí ya que

se pueden digitalizar por escáner o cámaras digital. Luego se hacen pasar
por unos softwares como por ejemplo el MELANIE (un tradicional del
instituto suizo de bioinformática. Son los mismos del Swiss-Prot). Gracias a
estos softwares podemos ver la presencia/ausencia de un sport determinado
y la intensidad diferente de unos con respecto a otros. El software lo que
hace es detectar todas las manchas del gel y si está calibrado nos da la
masa moléculas, el punto isoeléctrico y la cantidad de proteína que hay en
cada mancha (por densidad óptica de la mancha: unas más oscuras y otras
más claras).
39
Acuicultura
Estos son los resultados de las ventanas del Melanie: compara situaciones diferentes en forma repetida de la misma
muestra para ver si el resultado es fiable.
De cada mancha me da la masa molécula, el punto isoeléctrico y además me da una representación tridimensional para
ver la intensidad.
Esta es una manera objetiva para comparar diferencias.
La ventaja de la digitalización es que puedo comparar muchos geles de la misma condición que luego comparo con el
término medio de muchos geles de otra condición. Esto si tenemos en cuenta la reproducibilidad relativa de los geles 2D,
nos permite realizar varios por cada condición y así comparar términos medio de una condición con el termino medio de
la otra.
Es un análisis muy laborioso y por ello no muy en uso.
B. CROMATOGRAFÍA
Proteómica comparativa con LC-MS y marcado isotópico
Desde hace unos años la gente prefiere la cromatografía liquida porque es menos laboriosa y más precisa.
¿Podemos comparar muestras usando cromatografía liquida combinada con espectrometría de masas? ¿Cómo
diferenciamos péptidos de una muestra y de otra cuando los mezclamos todos en un único evento cromatográfico?
Podemos marcar las proteínas con determinados reactivos que nos dé

una diferencia de espectrometría de masas. Para ello deberíamos
marcar las proteínas de una condición una con un reactivo y las
proteínas de la otra condición con otro, PERO ¿esto no alteraría el
comportamiento cromatográfico? Para ello usamos isótopos para
marcar. Son átomos donde el número de nucleones es diferente
debido a que tienen un Nº de neutrones diferente.
Si marcamos una de las dos condiciones con un átomo de deuterio (es

hidrogeno: químicamente no altera las condiciones de la
cromatografía) sin embargo el espectrómetro de masas es tan sensible que si va a detectar la diferencia, aunque sea solo
1 unidad de masa atómica. Una molécula marcada con deuterio tiene el mismo comportamiento que una marcada con
hidrogeno, pero el comportamiento en espectrometría de masas es diferente y se pueden distinguir.
De esta manera hace años se desarrollaron los reactivos ICAT.
Reactivos ICAT (“isotope-coded affinity tag”) que

reaccionan con tiol
Son marcas de afinidad codificas con isotopos.
Una marca tiene en uno de los extremos iodoacetamida.

Este átomo de yodo es un reactivo: cuando la marca se
pone en contacto con una proteína, se une a residuos de
cisteína (el AA que lleva azufre) y dan una reacción muy
40
Acuicultura
efectiva = podemos marcar una proteína por sus residuos de cisteína y acoplarle esta marca. La marca luego lleva un
conector que en algunos casos lleva hidrógenos (L: marca ligera) y en la otra muestra deuterio (D: marca pesada): esto
es lo que marca la diferencia entre los péptidos en la espectrometría de masa. Por último, el marcador lleva una molécula
de biotina (coenzima de las reacciones de descarboxilación) que se añade para marcar los péptidos marcados porque la
biotina es muy afín a la avidina (proteína). La interacción biotina-avidina es una reacción no covalente más fuerte que se
conoce en la naturaleza por eso se usa en estos
procedimientos de captura: capturamos las
moléculas haciéndolas pasar por una columna que
lleve avidina ya que la biotina del marcador se
unirá.
Ejemplo. Células de tipo A con 4 copias de la

proteína diana y las células de tipo B con 2 copias
de la proteína diana. Marcamos con el reactivo
ICAT ambas: la preparación A con el ICAT ligero y
la B con el ICAT pesado. Luego los mezclamos y los
digerimos y tenemos así una ensalada de péptidos
donde algunos serán marcados porque tenían
cisteína y otros no. Para no meterlos todos en el
espectrómetro, vamos a separar los marcados de los
que no están marcados pasándolos por una columna
de afinidad de avidina (cromatografía de afinidad).
Una vez que recupero los péptidos marcados llevo a
cabo la espectrometría de masa. Primero hago un
escáner completo (con el cuadrupolo o trampa
iónica) para que nos ordene los iones donde veremos la versión monoprotonada del péptido y la biprotonada (a veces
podría ver la triprotonada). La diferencia de la altura de picos refleja la diferencia de cantidad de las muestras: la que
lleva 4 copias (marcada como pesada) será el doble de alto que la que lleva 2 copias de la proteína (marcada como
ligera). Para saber ahora que proteínas son lo que hago es inyectar en un espectrofotómetro MS-MS (tándem) para
obtener los espectros de fragmentación para que luego podamos identificar del péptido y por ello de la proteína por
coincidencia con los espectros de una base de datos.
Análisis proteómico del tejido muscular de la dorada (Sparus aurata L) cultivada en jaulas flotantes
Addis et al. Aquaculture 309, 245-252
Es un trabajo intentaron elaborar el proteoma del tejido

muscular de la dorada.
41
Acuicultura
Seleccionaron animales de jaulas en mar cuatros sitios (A, B, C, D) y

luego otros animales de estado salvaje. Los muestreos se realizaron
durante varios meses. De todas las muestras de tejido muscular se realizó
electroforesis monodimensional para ver si las proteínas estaban intactas
o si había habido degradación del tejido por la manipulación.
Perfiles representativos de proteínas totales en 1D SDS-PAGE.
Pocas diferencias observadas en el perfil total (flechas). Las diferencias

no se observan de manera consistente en individuos del mismo tamaño o
lugar de cultivo.
Pocas diferencias: una dimensión es difícil que nos de mucha información.

Estos geles se usaron más bien para seleccionar unos extractos con los
cuales luego realizar mapas del tejido muscular.
MAPA PROTEÓMICO del tejido muscular de la dorada
16 peces de cultivo y 8 peces silvestres: 4 peces por localización.
 2D-SDS-PAGE donde el robot pica en 80 manchas de

proteína.
 Digestion con tripsina
 NanoHPLC-nanoESI-Q-TOF-MS: Se separaron los
péptidos por cromatografía de fase reversa. La fuente de
iones fue por electroespray (ESI) y se puso un primer
cuadrupolo para seleccionar y se acopló un tubo de vuelo
para aumentar la precisión y por último se hizo una
espectrofotometría de masas en tándem
 ID espectros de fragmentación (PFF)
Consiguieron caracterizar 33
proteínas de las 80.
No hay ninguna que se parezca

a la proteína de carpa en la
base de datos porque hasta hace
ese momento no se había
caracterizado aun el proteoma
del musculo de la carpa.
42
Acuicultura
Proteómica diferencial en músculo de dorada 600 µg de extracto, tinción con azul de Coomassie
Compararon la cultivada de la silvestres y aparecieron diferencias: en la silvestre por ejemplo hay menos parvaalbúmina
y otras proteínas del sarcómero, PERO hay que tener en cuenta que las cultivadas eran individuos más jóvenes.
Vemos proteínas del sarcómero y también proteínas enzimáticas que tienen a que ver con el metabolismo de la glucosa.
Además, vemos la parvaalbúmina que es una proteína pequeña que está en el sarcómero y que ha descripto como
responsable de muchas alergias al pescado.
Evaluación de la influencia de la longitud del pez y de la condición de cultivado/silvestre en la expresión de

proteínas musculares en cinco individuos
Vemos proteínas del sarcómero y también

proteínas enzimáticas que tienen a que ver
con el metabolismo de la glucosa. Además,
vemos la parvaalbúmina que es una
proteína pequeña que está en el sarcómero
y que ha descripto como responsable de
muchas alergias al pescado.
Algunas de las machas forman una serie

isoeléctricas: se distribuyen en horizontal
en la primera dimensión porque es la
misma proteína con distintos estratos de
carga.
43
Acuicultura
Mapas 2D de (A) proteínas de 5 doradas cultivadas de 26 cm de longitud y (B) proteínas de 5 doradas silvestres de
26 cm de longitud.
50 µg de extracto proteico. Tinción con plata
Patrones 2D similares cultivada vs silvestre
¿La calidad del musculo es la misma entre

cultivado y silvestre? Los autores dicen que sí.
En los geles deducen que la fibra muscular es

similar.
44

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Tema 1: Introducción a la proteómica Aplicaciones biotecnológicas en

TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA PROTEÓMICA

 Intervienen en prácticamente todos los procesos celulares

1.1. GRUPOS R APOLARES

1.2. GRUPOS R AROMÁTICOS

1.3. GRUPOS R POLARES SIN CARGA

1.4. GRUPOS R CARGADOS POSITIVAMENTE (BÁSICOS)

1.5. GRUPOS R CARGADOS NEGATIVAMENTE (ÁCIDOS)

DIFERENTE COMPOSICIÓN EN AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS

 La composición de aa en una proteína es muy variable.

TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

5.1. Tres MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS utilizados en purificación de proteínas

1. Cromatografía de intercambio iónico, que explota diferencias en el signo y la

2. Cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel), funciona bien

3. Cromatografía de afinidad, que separa las proteínas por sus

Este procedimiento no se utiliza, por lo general, para purificar

ESTIMACIÓN DEL Pm DE UNA PROTEÍNA

Proteínas se separan por sus puntos isoeléctricos.

Las proteínas muy grandes son difíciles de analizar

*A excepción del bromuro de cianógeno todos son proteasas.

CORRESPONDENCIA ENTRE LAS SECUENCIAS DE DNA Y AMINOÁCIDOS

TEMA 2: INTRODUCCIÓN A LA PROTEÓMICA

Proteómica es el estudio del proteoma, el complemento proteico

Una célula puede tener varios transcriptomas según el momento,

PROCEDIMIENTOS PARA EL ESTUDIO DE LA

En 1995 la bioinformática, la secuenciación automática del DNA, los

Durante la década de 1990 ocurrió un gran crecimiento de las bases

Imagen ampliada de un microarray de DNA. Cada mancha que

Fueron muy útiles como catálogos parciales de muchos organismos

El proyecto genoma humano y otros similares en bacterias, levaduras, nemátodos y

Imagen ampliada de un “microarray” de DNA. Cada mancha que resplandece en

CICLOS VITAL DE UNA PROTEÍNA

La proteína debe plegarse de forma adecuada, hay proteínas

MODOS ALTERNATIVOS DE EXPRESIÓN GÉNICA

Genes ortólogos: genes o proteínas de

Genes parálogos: genes o proteínas

El proteoma: 30 -80 % de los posibles productos génicos

Nivel de expresión de las proteínas por célula: 10 1-102 y 104-

Proteínas en múltiples formas postraduccionales

Las células varían su composición proteica a lo largo de su

Extraemos la mezcla de proteínas de una célula o tejido,

Inconvenientes de 2D SDS PAGE:

 Reproducibilidad dos electroforesis consecutivas

Debido a que algunas proteínas no solubilizan bien

REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE UNA DIGESTIÓN EN GEL.

Se hace un agujero en gel, se

*A excepción del bromuro de cianógeno todos son proteasas.

RELACIÓN ENTRE EXPRESIÓN GÉNICA Y

Levadura (6000 genes)

 Expresión génica (microarray) 4000

En este caso, la mezcla de proteínas no se separa en

Tiene la ventaja de que no hay que usar electroforesis

¿Como separamos la mezcla de péptidos que hemos

SEPARACIÓN DE PÉPTIDOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Para separar la mezcla de péptidos

De esa manera en unas columnas

Combinando por ejemplo con

“MUDPIT” (TÉCNICA MULTIDIMENSIONAL DE IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS)

Cromatografía en fase reserva: la columna cromatográfica está

Combinando varias columnas primero separo los péptidos que