Reporte 5 - EQ1 - 2BM1 - LTM

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería
Campus Guanajuato.
Instituto Politécnico Nacional.
Equipo Número: 1
Abúndez Hernández Demián Pio.

García Albarrán Miguel Ángel.
Integrantes: Hernández Cortés César Leonardo.
Kantun Negruunn Juan Gualberto.
Sosa García Mauricio.
Departamento: Formación Integral e Institucional.
Academia: Biología.
Laboratorio de Técnicas
Unidad de aprendizaje:
Microbiológicas.
Dra. Karla Lizbeth Macías Sánchez.

Docentes: Dr. Juan Manuel Salgado Román.
Dra. María del Rosario León Reyes.
Grupo: 2BM1.
Periodo escolar: 2023/2.
Pruebas bioquímicas para

Nombre de la práctica:
identificación de bacterias.
Número de la práctica: 5.
Fecha de entrega: Lunes 24/abril/2023.

Microbiológicas. Pruebas bioquímicas para
Equipo 1.
2BM1. Ingeniería Biotecnológica. identificación de bacterias.
Semestre 23/2.
1
Pruebas bioquímicas para identificación de bacterias.

Objetivos.
Objetivo general:
Identificar la actividad y reacciones de microorganismos por distintas pruebas bioquímicas.
Objetivos específicos:
• Realizar pruebas para detectar la actividad enzimática sobre carbohidratos, sales
orgánicas y ciertos sustratos, así como en procesos oxido-reducción por parte de los
organismos dados.
• Llevar a cabo pruebas para observar la hidrolización de aminoácidos y proteínas, para
identificar las enzimas y su actividad por parte de los organismos dados.
• Constatar la teoría acerca de las pruebas bioquímicas mediante experimentación.
Introducción.
Desde siempre, el ser humano y la naturaleza han mantenido una gran relación, satisfacer
nuestras necesidades a base de los productos generados por esta. Con el tiempo, fuimos
desarrollando tecnología, floreció la medicina, y tiempo después, la microbiología, fuimos
conociendo características de ciertas bacterias microscópicas, buscamos crear medicamentos
con compuestos capaces de ralentizar el crecimiento, inhibir e incluso matar a estos
microorganismos; hoy gracias a los grandes avances, tenemos medios de cultivos selectivos,
diferenciales, así como tinciones simples y diferenciales, un amplio acervo y conocimientos
acerca de morfología celular y colonial de los microorganismos, pero con todo eso, para
detectar una bacteria específica, requerimos de pruebas bioquímicas.
Las pruebas bioquímicas son una serie de procedimientos que se ejecutan a partir de
biomasa microbiana viable, se fundamenta en la demostración de reacciones bioquímicas
pertenecientes a diversas vías metabólicas sobre un sustrato o conjuntos de sustratos
particulares y condiciones ambientales definidas (Hernández, 2021).
El conocimiento de técnicas de laboratorio de microbiología es fundamental para la Ingeniería
Biotecnológica, en la presente práctica, se trabajaron las siguientes pruebas bioquímicas para
detección de bacterias:
Prueba de la catalasa: se ejecuta al colocar una gota de peróxido de hidrógeno en un
portaobjetos e inmediatamente una porción de crecimiento microbiano. Se determina la
presencia de catalasa, una enzima que degrada al peróxido de hidrógeno (H2 O2 ) en agua y
oxigeno gaseoso.
Catalasa positivo: hay burbujeo al combinarse la biomasa microbiana y el H2 O2 .
Catalasa negativo: no hay burbujeo al combinarse el H2 O2 y la biomasa microbiana.
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Prueba en medio de cultivo Agar TSI: se emplea para identificar los microorganismos
entéricos por su capacidad de usar azucares, liberando sulfuros. Contiene lactosa, sacarosa y
glucosa, más sulfato de amonio ferroso y tiosulfato sódico, se emplea para diferenciar
miembros de la familia Enterobacteriaceae.
A) Control sin inocular.
B) K/K no fermentador.
C) A/A con gas. Indica fermentación de lactosa o de

sacarosa.
D) K/A con producción de ácido sulfhídrico (H2 S).
A= Producción de ácido.
K= Medio se vuelve alcalino.

Figura I1. Resultados de prueba en agar TSI. Tomada del
documento Identificación de microorganismos, por UPIIG.
Prueba en medio de cultivo Agar Lisina-hierro (LIA): mide la capacidad enzimática de un
organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina, con la
consiguiente alcalinidad. El proceso de descarboxilación es irreversible, no oxidativo y requiere
una coenzima común, el fosfato de piridoxal. Contiene citrato de amonio para la detección de
H2 S. Se emplea para diferenciar bacterias entéricas.
Esta prueba nos puede dar positivo o negativo para la lisina descarboxilasa, y lisina
desaminasa.
Prueba de Agar de Citrato de Simmons: este medio se emplea
para diferenciar las bacterias entéricas basándose en la
utilización de citrato. Contiene citrato sódico como única fuente
de carbono y fosfato de amonio como fuente exclusiva de
nitrógeno que produce la alcalinización del medio.
La eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte
basificación del medio que será aparente por un cambio de color
del indicador de pH.
El metabolismo del citrato comprende una condensación de
acetilo con la coenzima A y oxalacetato. Figura I2. Prueba de citrato. Tomada
del documento Identificación de
Prueba de licuefacción de gelatina: algunos microorganismos microorganismos, por UPIIG.
poseen metaloproteasas con actividad endonucleasa capaces
de hidrolizar la gelatina y causar la licuefacción del medio, por medio de la enzima gelatinasa.
La prueba se monta en caldo nutritivo con gelatina 0.8 %, en este medio se agrega el inoculo
por picadura o bien agregando suspensión microbiana, se incuba en condiciones
convenientes, posteriormente se enfría y se verifica la consistencia del medio. Se emplea para
diferenciar diversas bacterias heterótrofas como los clostridios.

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Prueba bioquímica en Medio de Motilidad-Indol-Ornitina (MIO): medio de cultivo utilizado

para identificar miembros de la familia Enterobacteriacea. Mediante la motilidad,
descarboxilación de la ornitina y producción de indol.
En esencia su funcionamiento es similar a la medio LIA, pero en este caso la sustancia
peptídica es el extracto de levadura, peptona y tripteína, esta última representa una fuente rica
de triptófano y permite evaluar la producción de indol con la posterior aplicación del reactivo
de Erlich. Los resultados son los siguientes:
Movilidad (Motilidad). Ornitina descarboxilasa. Prueba de indol.
• Resultado positivo: presencia de • Resultado positivo: color púrpura. • Resultado positivo: color rojo.
turbidez o crecimiento más allá de • Resultado negativo: color • Resultado negativo: el color del
la línea de siembra. amarillo. A veces se puede reactivo revelador permanece
• Resultado negativo: crecimiento desarrollar un color violáceo en la (incoloro-amarillento).
solamente en la línea de siembra. superficie del medio.
Tabla I1. Resultados posibles de la prueba en Medio MIO.
Prueba de reacción de Rojo de Metilo (RMVP): esta prueba

se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo
de generar y mantener productos finales ácidos estables por
fermentación de la glucosa y para superar la capacidad
amortiguadora del sistema.
Fundamento: Permite detectar aquellas bacterias que siguen la
vía de fermentación de la glucosa a través de la vía ácida mixta,
produciendo la cantidad de ácido suficiente como para
mantener el pH por debajo de 4.4 (el valor crítico de color de
ácido del indicador rojo de metilo). Figura I3. Prueba de Rojo de Metilo.
Tomada del documento Identificación
Prueba de la ureasa: esta prueba pone de manifiesto la de microorganismos, por UPIIG.
actividad de ureasa de las bacterias, esta prueba puede ser
ejecutada en medio distintos, el medio Christensen es recomendado para microorganismo
que hidrolizan la urea lentamente, la glucosa o dextrosa presente en el medio es un sustrato
fermentable que sustenta el crecimiento microbiano y de forma secundaria por la acidificación
del medio de cultivo activa la expresión de la ureasa. El caldo urea es otra opción y es de uso
más general. En ambos casos el indicador de pH es el rojo de fenol que indica una prueba
positiva al virar a color rosado-rojizo por la alcalinización.
Prueba de la hidrólisis de Almidón en agar: el almidón es
un homopolisacárido, producto de condensación de
monómeros de un único tipo de monosacárido, α-D-glucosa,
que forma un polímero de muchas unidades unidas por
puentes α-glucosídicos. La enzima específica para la hidrólisis
del almidón en bacterias es la enzima α-amilasa.
Figura I4. Hidrólisis de Almidón. Tomada del documento Manual de Laboratorio de
Técnicas Microbiológicas, por Aza, C., Macías, K. L., Sánchez, J. F., Díaz, S.

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Fundamento: bajo la presencia de yodo lugol, la aparición de una halo claro alrededor de la
bacteria indica la degradación del almidón presente en el medio de cultivo, debido a la
presencia de la enzima responsable de la degradación de este polisacárido, la enzima α-
amilasa.
Positivo: Si se forma un halo claro alrededor del crecimiento (Figura 4A).
Negativo: No se forma un halo claro alrededor del crecimiento (Figura 4B).
Figura I5. Estructura del almidón. Tomada de Wikipedia:

https://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n
Las pruebas bioquímicas están sujetas a ciertos factores, así como de una correcta incubación,
para quienes lo requieran.
Resultados.
Tabla R1: Características coloniales y morfológicas.
Nombre del Características Características

Tinción Gram.
microorganismo. coloniales. celulares.
Puntiforme, convexa
Salmonella. Positiva.
con borde entero.
Circular, ondulado
E. coli. Negativa.
con borde elevado.
Tabla R3: Tubos sin inocular
1 2 3 4 5 6 7

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1. Medio TSI. 2. Medio LIA. 3. Citrato de Simmons.

4. Agar de gelatina. 5. Agar MIO. 6. Prueba de Rojo de metilo.
7. Prueba de ureasa.
Tabla R3: Resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas.
Observaciones con Imagen de la

Interpretación
Nombre de la cada muestra prueba para:
(Positivo o
prueba bioquímica. (Salmonella y E. A) Salmonella
negativo).
coli). B) E. coli
A) Salmonella.
A) Negativo.
No presentó halo.
Hidrólisis de
almidón. B) E. coli.
B) Positivo.
Se muestra de un
tono más claro en
los bordes.
A) Salmonella.
Prueba en agar
triple azúcar y A) Positivo.
Se dio un pico con
hierro (Medio TSI).
coloración roja y
fondo con color
amarillo. A)

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B) E. coli.
B) Positivo.
Se dio un pico de
coloración amarilla, y
fondo amarillo. B)
A) Salmonella.
A) Negativo.
Se solidificó.
Prueba de A)
licuefacción de
gelatina.
B) E. coli.
B) Positivo.
No se solidificó.
B)
A) Salmonella.
A) Positivo.
Descarboxilación de
la lisina y falta de la
Desaminación y fermentación dando
descarboxilación violeta/violeta. A)
de aminoácidos en
medio LIA (Lysine
Iron Agar). B) E. coli.
B) Positivo.
Coloracion
violeta/violeta (k/k).
B)
Prueba de catalasa. A) Salmonella. A) Positivo.

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Si hubo burbujas
pequeñas. B
B) E. coli.
A
B) Negativo.
No tuvo ninguna
reacción.
A) Salmonella.
A) Positivo.
Permanece de un
color azul con
crecimiento notable.
Prueba de Citrato A)
de Simmons.
B) E. coli.
B) Negativo.
No presento
crecimiento y
permaneció de color
verde. B)
A) Salmonella.
A) Positivo.
Permaneció de un
Prueba de rojo de
color rojo intenso en
metilo.
la superficie
A)
B) E. coli. B) Positivo débil.

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Se puede apreciar
de un color naranja
en la superficie.
B)
A) Salmonella.
A) Negativo
Se aprecia un tono
un poco más
obscuro, pero no
cambia a rojo-fucsia. A)
Prueba ureasa.
B) E. coli.
B) Negativo.
Mantiene el mismo
color.
B)
A) Salmonella.
A) Positivo.
Presenta crecimiento
sobre la línea de
Prueba de Agar siembra.
MIO: motilidad.
B) E. coli.
B) Positivo. A)
Se presenta
crecimiento sobre la
línea de siembra.
A) Salmonella.
Prueba de Agar
MIO:
A) Positivo.
descarboxilación Presenta coloración
de la ornitina. Purpura.
B)

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Prueba de Indol
B) E. coli. aplicando el
Se presenta un tono B) Negativo. reactivo Kovacs:
violáceo con un poco
de color amarillo.
A) Salmonella.
No desarrollo anillo A) Negativo.
de color rosado o
rojo oscuro.
B) E. coli. A)
Prueba de Agar
MIO: Indol.
No desarrollo anillo B) Negativo.

de color rosado o
rojo oscuro.
B)
Discusión.
Salmonella.
El género Salmonella pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae, cuya morfología
colonial esta descrita por colonias color crema, redondas con bordes definidos y lisos,
convexas, de aspecto húmedo y translúcidas, mientras que su morfología celular está definida
por bacilos Gram negativos, son anaerobios facultativos, no esporulados, generalmente
móviles por flagelos perítricos que utilizan citrato como única fuente de carbono y poseen
metabolismo de tipo oxidativo y fermentativo, no requieren cloruro de sodio para su crecimiento
pero crecen en medios con concentraciones de entre 0.4% y 4%.
La mayoría de las cepas de Salmonella crecen en un rango de temperatura que va desde 5°
C a los 47° C con una temperatura optima de un rango de 35° C – 37° C, existen algunas cepas
que han logrado crecer en rango de 2° C a 4° C y hasta los 54°C.
El pH de crecimiento rango de entre 4 y 9 con un pH óptimo de entre 6.5 – 7.5 y se desarrolla
bien en una actividad de agua (aw) de entre 0.99 y 0.94, pudiendo llegar a sobrevivir en
alimentos secos con aw < 0.2.
Los valores de inhibición de crecimiento estándares son:
• pH < 3.8
• T < 7° C
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• aw < 0.94
Siendo consistente la observación de la morfología colonial y la forma celular con nuestros

resultados exceptuando con la clasificación de la tinción Gram ya que se observaron como
Gram positivos en lugar de Gram negativos como se esperaban ver.
Prueba de Hidrólisis de almidón.
Ya que la Salmonella utiliza citrato como fuente de carbono y con metabolismo oxidativo y
fermentativo, esta no es capaz de degradar el almidón, por lo que el resultado esperado es
consistente con el obtenido siendo este que no degradó el almidón, notándolo al momento de
revelarlo adicionando el Lugol en la caja Petri con el medio de Agar almidón.
Prueba de agar triple azúcar y hierro (Medio TSI).
La Salmonella produce 𝐻2 𝑆 al metabolizar el citrato de amonio férrico, presente en el medio
TSI, lo que fue consistente con nuestros resultados produciendo la coloración negra en el fondo
del tubo por vía anaerobia y aunque esta vía acidifica el medio en el pico de flauta por vía
aerobia generó una alcalinización del medio ya que esta cepa puede metabolizar ciertos
azucares por vías anaerobias facultativas lo que conlleva a poder degradar el medio aún en
presencia de oxígeno de igual manera consistente con nuestros resultados obtenidos.
Prueba de licuefacción de la gelatina.
La Salmonella no es capaz de producir gelatinasas exocelulares lo que después de la
refrigeración del medio debería solidificarse, esto fue consistente con nuestros resultados
siendo así consistente con lo esperado, de esta manera podemos determinar que esta bacteria
no puede hacer uno de las proteínas naturales como la gelatina.
Desaminación y descarboxilación de aminoácidos en medio LIA (Lysine Iron Agar).
Este medio contiene citrato amónico férrico, el cual es el principal sustrato de la Salmonella,
siendo esta capaz de metabolizarlo por vía anaerobia y así producir 𝐻2 𝑆, esto se determinó al
momento de observar el fondo de color negro y de igual forma siendo consistente entre la
bibliografía y nuestros resultados.
Ya que la Salmonella tiene un metabolismo oxidativo y fermentativo, ésta puede llevar a cabo
la descarboxilación de la lisina y al no ser la glucosa su sustrato base evita la fermentación de
ésta, esto llevo como resultado a una superficie y profundidad alcalina pero acompañada del
fondo negro por el 𝐻2 𝑆.
Prueba de catalasa.
Al ser un microorganismo anaerobio facultativo, tiene catalasas, lo que permite la
descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, siendo este visible por la
formación de burbujas al momento de añadir el peróxido a una muestra en un portaobjetos, y

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notando estos resultados en nuestra prueba podemos decir que continua consistente con la
reacción esperada.
Prueba de citrato de Simmons.
Nuevamente, el citrato es la principal fuente de carbono de la Salmonella lo que se esperaría
dando como resultado positivo a la prueba, siendo esta una de las pruebas más claras que
obtuvimos cambiando la coloración del medio de verde a azul y obteniendo crecimiento de
biomasa.
Prueba de Rojo de Metilo.
Esta prueba conforme la bibliografía da como resultado positivo conforme las pruebas
establecidas por medio de la Galería API Staph, de igual forma en nuestra prueba nos dio un
positivo claro al momento de agregar las gotas del rojo de metilo para determinar que la
bacteria ha generado la fermentación de la glucosa y producido un medio ácido, y aunque no
es su fuente de carbono principal, al estar restringida ha logrado fermentarlo ya que es una de
las características de ésta.
Prueba de la ureasa.
La Salmonella es de la familia de las Enterobacteriaceae, siendo esta prueba la que ayudaría
a detectar ciertas especies de esta familia, sin embargo, la Salmonella es de las bacterias que
pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y que no dan positivo a esta prueba, ya que esta
no genera grandes cantidades de ureasa y no es capaz de degradar la urea en amoniaco y
dióxido de carbono.
En nuestros resultados se encontró negativa la prueba, lo que corresponde a un resultado
acorde con la literatura.
Prueba de motilidad-indol-ornitina (MIO).
Para la prueba de MIO en la Salmonella se encuentra positiva para la motilidad, negativa para
el indol y positiva para la ornitina, estos parámetros fueron totalmente consistentes a nuestros
resultados obtenidos, siendo así acorde a la bibliografía.
La prueba de motilidad se verifica observando el crecimiento y la difusión de la bacteria desde
el punto de inoculación hasta la parte superior del medio siendo este el mismo resultado
obtenido.
Mientras que la prueba de indol debe ser negativa ya que la Salmonella no puede producir
indol a partir de la desaminación del triptófano lo que al momento de agregar el reactivo Kovacs
no se observa el cambio de coloración a rojo.
Y por último la prueba de ornitina, debiendo dar positiva con la formación del dióxido de
carbono a partir de la ornitina, la literatura marca un positivo débil, mientras que a nosotros nos
dio un positivo claro y definido, por lo que consideramos correcta la prueba y acorde a lo
esperado conforme la literatura.
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E. coli.
La E. coli es un bacilo Gram negativo con forma de cocos, anaerobio facultativo de la familia
Enterobacteriaceae, cuya morfología colonial está formada por colonias circulares de tamaño
mediano a grande, de color blanco a crema, con una superficie brillosa, densidad opaca y de
elevación convexa, la E. coli productora de toxinas Shiga puede crecer a temperaturas de
entre los 7° C y los 50° C, con una temperatura optima de 37° C, algunas pueden proliferar en
medios ácidos con un pH < 4.4 y en alimentos con una actividad de agua (aw) > 0.95.
La morfología celular observada es correspondiente a la bibliografía consultada, mientras que
la morfología colonial difiere únicamente en la elevación observada, esto pudiendo notarse
como un error al momento de la observación de simple vista sin un estereoscopio.
Prueba de Hidrólisis de almidón.
La E. coli tiene la capacidad de degradar el almidón gracias a la producción de amilasas, lo
que facilitan la degradación del homopolisacárido, esto da como resultado un aclaramiento en
las zonas donde el almidón ha sido degradado al momento de entrar en contacto el Lugol con
el medio de Agar – almidón, siendo esto consistente con nuestros resultados podemos
comenzar con un pronóstico favorable.
Prueba de agar triple azúcar y hierro (Medio TSI).
Ya que es capaz de fermentar la glucosa y lactosa, pero no la sacarosa por medio de una
fermentación ácida, este resultado se verá reflejado con coloraciones amarillas en la parte
superior y fondo del tubo, por lo que denota el medio ácido en el que se realiza la fermentación
mencionada, estos, de igual forma, fueron los resultados obtenidos en nuestra prueba por lo
que son consistentes en contrate con la literatura.
Prueba de licuefacción de la gelatina.
La E. coli no es una bacteria que se caracterice normalmente por resultar positiva para la
prueba de licuefacción de gelatina, normalmente resulta en negativa y solo muy pocas cepas
han dado positivo a esta prueba, en nuestro caso resultó positiva, lo que nos puede dar un
indicio de que la cepa específica puede ser una cepa de las pocas que logran dar positivo a
dicha prueba.
Desaminación y descarboxilación de aminoácidos en medio LIA (Lysine Iron Agar).
Al poder producir lisina descarboxilasa forma cadaverina que neutralizan los ácidos orgánicos
formados por la fermentación de la glucosa lo que genera un color violeta dejando un estado
alcalino en el medio, en la pronta incubación de alrededor de 24 hrs se debería observar una
coloración amarilla denotando la fermentación ácida de la glucosa en la parte superior y un
color como rojizo en la inferior sin formación de 𝐻2 𝑆.

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Ya que nuestra observación fue hasta las 48 hrs, notamos la prueba en el estado alcalino, lo
que mantiene consistente como correcto a pesar de no haber contrastado con el cultivo en las
primeras 24 hrs.
Prueba de catalasa.
La prueba de la catalasa da positiva para la E. coli ya que esta bacteria sí tiene catalasas que
descompongan el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
Nuestros resultados resultaron negativos a la prueba de catalasa siendo inconsistente nuestro
resultado con lo reportado en la bibliografía.
Prueba de citrato de Simmons.
La mayoría de las cepas de E. coli son negativas a la prueba de Citrato de Simmons, esto es
porque son muy pocas cepas las que pueden utilizar el Citrato como única fuente de carbono,
en nuestros resultados los obtenidos fueron negativos, por lo que es consistente con la
literatura consultada.
Prueba de Rojo de Metilo.
En la literatura se considera el resultado positivo a la producción de ácidos mixtos por medio
de fermentación ácida de la glucosa, lo que causaría que el reactivo rojo de metilo hiciera el
vire a color amarillo, estos resultados fueron consistentes a los obtenidos, sin embargo, para
nomenclatura del manual este se considera negativo para el contraste entre la coloración roja
y la amarilla.
Prueba de la ureasa.
La E. coli es de la familia de las Enterobacteriaceae, siendo esta prueba la que ayudaría a
detectar ciertas especies de esta familia, pero al igual que la Salmonella, esta es de las
bacterias que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y que no dan positivo a esta prueba,
ya que esta no genera ureasa y no es capaz de degradar la urea en amoniaco y dióxido de
carbono, aunque sí existen algunas cepas de E. coli, capaces de producir ureasa, no es común
encontrarlas y que estas den positivo a dicha prueba.
En nuestros resultados se encontró negativa la prueba, lo que corresponde a un resultado
acorde con la generalidad en la literatura.
Prueba de motilidad-indol-ornitina (MIO).
Para la prueba de MIO se toma positiva para la motilidad, positivo para la producción de indol,
exceptuando casos muy específicos donde da negativo, y un grado de 65% de positividad para
la ornitina descarboxilasa.
La prueba de motilidad se verifico como positiva observando el crecimiento y la difusión de la
bacteria desde el punto de inoculación hasta la parte superior del medio, siendo consistente
con la literatura.
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Mientras que la prueba de indol debe ser en general positiva ya que la E. coli si generalmente
produce indol a partir de la desaminación del triptófano lo que al momento de agregar el
reactivo Kovacs debería observarse el cambio de coloración a rojo, siendo 98% el índice de
positividad de esta prueba, sin embargo, en nuestro caso no fue así y la prueba resultó negativa
para el indol.
Y por último la prueba de ornitina, si la cepa produce la enzima ornitina – desaminasa, entonces
el medio se volverá violeta por la acidificación del medio, teniendo un índice de positividad de
un 65%. En el caso de nuestros resultados pudimos observar un positivo por la coloración del
medio obtenida, siendo esta concluyente como aceptable en contraste con la bibliografía.
Conclusión.
En lo que respecta a trabajo en equipo, una mayor comunicación.
Respecto a las tinciones y morfología, la pared celular de salmonella no coincide con la
obtenida experimentalmente, lo que puede denotar un error en los procesos de tinción,
específicamente en la cantidad de tinte y en cómo se deslavó el cristal violeta; con morfología
tuvimos una discrepancia respecto a la bibliografía con la elevación, atribuyéndose a un error
de vista de nuestra parte.
Para finalizar, en lo que corresponde a pruebas bioquímicas, logramos emparejar la
mayoría de nuestros resultados con los de las fuentes consultadas, que fueron muy
diversas por la complejidad de la cepa de Salmonella trabajada. El cultivo de Escherichia coli
fue el que dejó en visto varias diferencias entre lo experimental y lo teórico, especialmente en
las pruebas de indol y catalasa, así como la de licuefacción de gelatina, pero en esta se deduce
que puede ser una de las cepas que sí logran dar positivo a la prueba. Por lo anterior, de
forma general podemos indicar que la práctica fue llevada a cabo con un alto grado de certeza.
Cuestionario.
1. Explicar por qué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con
campana de Durham se emplea un indicador de pH, cuál es el indicador y cuál es
su intervalo de sensibilidad.
Muestra la respuesta.
Las campanas de tubo Durham son un tipo de tubo de laboratorio de vidrio que se caracteriza
por tener una boca recta y un fondo redondo de medidas 6x50 milímetros. Se suele usar para
la recuperación de gas en bacteriología.
Las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se utilizan para
determinar si una cepa bacteriana es capaz de fermentar un determinado tipo de azúcar, y en
caso afirmativo, qué productos de fermentación se producen. En estas pruebas, se utiliza un
tubo de ensayo que contiene un medio de cultivo con azúcar y una campana de Durham, que
es un pequeño tubo invertido dentro del tubo principal. Si la bacteria es capaz de fermentar el

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azúcar, se producirán gases como el dióxido de carbono, que se acumularán en la campana

de Durham.
El indicador de pH que se utiliza en estas pruebas es el rojo de fenol. Este indicador cambia
de color según el pH del medio de cultivo, lo que permite a los microbiólogos determinar si se
ha producido fermentación y si la bacteria ha producido ácidos como producto de la
fermentación. Si la bacteria fermenta el azúcar y produce ácidos, el pH del medio de cultivo
disminuirá y el rojo de fenol cambiará de amarillo a rojo. Si la bacteria no fermenta el azúcar,
el medio de cultivo permanecerá neutral y el rojo de fenol permanecerá amarillo.
El intervalo de sensibilidad del rojo de fenol es típicamente de pH 6.8 a 8.4, lo que significa
que cambia de color a pH 6.8 (amarillo) y a pH 8.4 (rojo). Este intervalo de sensibilidad es
adecuado para la detección de ácidos producidos por la fermentación de azúcares, ya que los
ácidos producidos por la mayoría de las bacterias fermentadoras de azúcares pueden bajar el
pH del medio de cultivo a menos de 6.8.
2. ¿Cómo se detectan los productos de la degradación de los aminoácidos: arginina,
lisina y ornitina?
Un aminoácido es la unidad base que actúa como estructura fundamental de las proteínas.
Una proteína tiene dos o más cadenas de aminoácidos (conocidas como polipéptidos) cuya
secuencia se codifica en un gen (en la transcripción del ARNm). Algunos aminoácidos pueden
ser sintetizados por el cuerpo en sí mismo, pero otros (los aminoácidos esenciales), no, y se
deben obtener de la dieta.
Degradación de la arginina: la ruta degradativa de la arginina que tiene lugar en el hígado de
muchos mamíferos es resumida en la Figura C1. En algunos microorganismos una ruta
alternativa conduce desde la arginina al ácido glutámico.
NH O
C CH2 CH2 C
La ornitina se forma a partir de la arginina por acción de
–
H2N NH CH2 CH O la arginasa (etapa común con el ciclo de la urea). La
NH3
+
ornitina, por transaminación con α-oxo-glutárico se
Arginina
convierte en el semialdehído glutámico, que es también
Arginasa un intermediario en la oxidación de la prolina. Este se
O
O oxida a ácido glutámico que se desamina
+ CH2 CH2 C
H2N
C
NH2 H2N CH2 CH O
–
oxidativamente, vía glutámico deshidrogenasa, a
+
NH3 amonio y α-oxoglutarato.
Urea Ornitina
Transaminación
¿Cómo detectar los productos de la degradación de
O la Arginina?
H CH2 CH2 C –
C CH2 CH
+
O La ornitina y citrulina, ambos productos de la
O NH3
degradación de la arginina, pueden ser detectados
γ-semialdehído del ácido glutámico mediante análisis cromatográfico, como los siguientes:
+
H2O.NAD
NADH O
HO CH2 CH2 C
–
C CH2 CH O
O
C
+ CH2 CH2 C
–
H2N NH2 H2N CH2 CH O
+
NH3
Urea Ornitina
Transaminación
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2BM1. Ingeniería OBiotecnológica. identificación de bacterias.
Semestre
H CH2 23/2.
CH2 C –
C CH2 CH O
O NH3
+ 16
γ-semialdehído del ácido glutámico • Cromatografía líquida de alta resolución

H2O.NAD
+ (HPLC).
• Cromatografía en capa fina (TLC).
NADH O
¿Cómo? En ambos métodos se separan los
HO CH2 CH2 C
–
diferentes compuestos de la muestra, y se miden
C CH2 CH O
sus concentraciones en plasma, para lo que es
O
+
NH3 necesario comparar con valores de referencia
Ácido glutámico
normales.
+
H2O.NAD
HPLC detecta también otros aminoácidos.
+
NADH + H O
NH4 TLC: La cromatografía en capa fina es una técnica
HO CH2 CH2 C utilizada para aislar mezclas no volátiles. El
–
C CH2 C O experimento se lleva a cabo en una lámina de papel
de aluminio, plástico o vidrio recubierta con una fina
O O
capa de material adsorbente. El material que suele
Ácido α-oxo-glutárico
utilizarse es el óxido de aluminio, la celulosa o el
Figura C1. Vía metabólica para la degradación de gel de sílice.
arginina en mamíferos.
Análisis colorimétrico de la ureasa: es capaz de medir la producción de amoniaco a partir

de la urea, uno de los productos conseguidos. Incluso, se comparó un análisis colorimétrico,
de alta eficiencia, para determinar la actividad de la ureasa, con el método de Nessler y el
nuevo método emplea el rojo de fenol para determinarla, por parte de científicos de la
Universidad de Houston, llegando a concluir la eficiencia del método, en un artículo publicado
en el 2013.
Para la ornitina, también podemos emplear el agar MIO, como ensayo para encontrar la
ornitina descarboxilasa, a partir de la producción de la ornitina, se mide la producción de CO2,
mostrando un color púrpura como resultado positivo, y un color amarillo o violáceo en la
superficie del medio, como un resultado negativo a la descarboxilación de la ornitina.
–
O Degradación de la lisina: La ruta degradativa, por la cual cuatro de los seis
O C átomos de carbono de la lisina se convierten en acetil-CoA, es bastante
H
C compleja. Los otros dos átomos de carbono se pierden en reacciones de
+
H3N descarboxilación. Uno de los metabolitos de esta vía, el ácido pipecólico y otros
CH2
productos de oxidación formados en el catabolismo de la lisina, son precursores
H2C
de la síntesis de algunos alcaloides vegetales, sustancias nitrogenadas que con
CH2 frecuencia son muy tóxicas.
+
H3N CH2
¿Cómo detectar los productos de la degradación de la Lisina?
Lisina
Detección de Lisina descarboxilasa: con esta podemos detectar la
Figura C2. descarboxilación de la lisina, lo que se traduce en detectar la generación de
Aminoácido Lisina.
cadaverina, producto de la acción de la lisina descarboxilasa, con un medio de
cultivo LIA (Lisyne Iron Agar).
Equipo 1.
Semestre 23/2.
17
Salmonella spp., es uno de los microorganismos principales que se pueden detectar. Los
resultados de la prueba a la lisina descarboxilasa (producción de cadaverina) pueden ser:
• Resultado positivo: superficie alcalina, profundidad alcalina [K/K].
• Resultado negativo: superficie alcalina, profundidad ácida [K/A].
La cadaverina es capaz de reducir el pH del medio, por ello, lo alcaliniza y cambia el color de
este.
Prueba de la oxidasa de la lisina: detecta la producción de ácido pipecólico a partir de la
degradación de la lisina. Se utiliza un medio de cultivo que contiene lisina y un indicador de
pH. Si el microorganismo es capaz de oxidar la lisina en ácido pipecólico, la producción de este
compuesto disminuye el pH del medio y se produce un cambio de color en el indicador.
El medio “Moeller descarboxylase Broth Base” (Caldo de base descarboxilasa Moeller)
suplementado con Lisina sirve para la detección de lisina descarboxilasa, sin embargo, por su
composición de lisina, clorhidrato de α-naftilamina, y un indicador de pH, también podemos
detectar la presencia del ácido pipecólico.
O
NH –
O
H2N NH2
Cadaverina Ácido pipecólico
Figura C3. Estructura de la cadaverina y ácido pipecólico, productos de la degradación del

aminoácido lisina.
Degradación de la Ornitina: La enzima ornitina descarboxilasa (ODC) participa en el ciclo de
la urea y en el metabolismo del glutatión y de grupos aminos. En los seres humanos, esta
proteína tiene 461 aminoácidos y la forma un homodímero. Cataliza la descarboxilación de la
ornitina produciendo, como resultado, diamina putrescina y una molécula de CO2.
“La síntesis de poliaminas inicia con la descarboxilación de la ornitina por la Ornitina
descarboxilasa formando putrescina, seguida de la adición de grupos aminopropilo para formar
espermidina y espermina por la espermidina y espermina sintasas, respectivamente” (Filosola,
2019).
O
CH2 CH2 C – CH2 CH2 NH2

H2N CH2 CH O
Actuación de la ornitina descarboxilasa
H2N CH2 CH2 + O C O
+
NH3
Dióxido de
Putrescina Carbono
Ornitina
Figura C4. Degradación de la Ornitina a Putrescina a CO2 por la enzima ornitina descarboxilasa.
¿Cómo se detectan los productos de la degradación de la ornitina?

Equipo 1.
Semestre 23/2.
18
Para la generación de putrescina, es necesaria la existencia de la ornitina descarboxilasa (en

este contexto), así que, la manera de “detectar putrescina” es detectando la enzima que
descarboxila al aminoácido en cuestión, para ello, conocemos dos pruebas muy usuales y
que antes se han tocado en este documento.
Prueba de Agar MIO: esta prueba bioquímica, además de dejar en evidencia si un
microorganismo presenta motilidad, o si forma indol (adicionando un reactivo), puede dejar en
visto si actúa la ornitina descarboxilasa, midiendo la producción de CO2, mostrando un color
púrpura como resultado positivo, y un color amarillo o violáceo en la superficie del medio, como
un resultado negativo a la descarboxilación de la ornitina, como se vio en la detección de
productos degradados de la arginina, esto debido a que, la ornitina es por sí misma, un
producto derivado de la arginasa.
“Moeller descarboxylase Broth Base” (Caldo de base
descarboxilasa Moeller): es el mismo con el que se puede
detectar la presencia de oxidasa de lisina, sin embargo, para
detectar la ornitina descarboxilasa, en lugar de suplementarse
con lisina, se hace con ornitina, eso es muy evidente. Por la
alcalinización del medio por organismos que descarboxilan la
ornitina, cambiarán la coloración de amarillo a púrpura o violeta.
Es importante inocular también un testigo de Figura C5. Posibles resultados obtenidos en el
medio descarboxilasa de Moeller. Testigo,
crecimiento para descartar que el microorganismo en positivo (nótese la turbidez) y negativo. Extraído
cuestión pueda utilizar las peptonas a razón suficiente de: Identificación de Bacterias para Pruebas
para causar la alcalinización del medio. Bioquímicas por Cervantes Hernández, A.
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Politécnico Nacional Unidad Zacatenco.

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Departamento: Formación Integral e Institucional.

Dra. Karla Lizbeth Macías Sánchez.

Periodo escolar: 2023/2.

Pruebas bioquímicas para

Fecha de entrega: Lunes 24/abril/2023.

Pruebas bioquímicas para identificación de bacterias.

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C) A/A con gas. Indica fermentación de lactosa o de

D) K/A con producción de ácido sulfhídrico (H2 S).

K= Medio se vuelve alcalino.

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Prueba bioquímica en Medio de Motilidad-Indol-Ornitina (MIO): medio de cultivo utilizado

Prueba de reacción de Rojo de Metilo (RMVP): esta prueba

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Tabla R3: Tubos sin inocular

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