Guía Microbiologia General

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS DE
MICROBIOLOGÍA
BIOL-256
Profesores:
Osvaldo Inostroza, Coordinador de Laboratorio (osv.inostroza.t@gmail.com)
Sección 3: Osvaldo Inostroza / Francisco Parra

Sección 4: Andrés Silva / Matías Jofré
Sección 5: Cynthia Briceño / Almendra Ramos
Sección 6: Camila Miranda / Sarita Soto
Sección 7: Nicolás Garrido / María J. Barros
TRABAJO PRÁCTICO N°1
PROCEDIMIENTO BÁSICOS
OBJETIVOS
1. Conocer los objetivos de un laboratorio de microbiología y la metodología usada para el

diagnóstico de agentes bacterianos.
2. Conocer la forma de trabajar en un laboratorio de microbiología, con énfasis en bioseguridad y
técnicas asépticas de trabajo.
3. Conocer los medios de cultivo y sus utilidades.
4. Conocer y practicar las técnicas de siembra microbiológica.
5. Conocer el material usado en un laboratorio de microbiología y adquirir destreza en su uso
correcto.
6. Observar y describir las características macroscópicas de las colonias desarrolladas en los
distintos medios de cultivo.
7. Conocer las tinciones más frecuentemente utilizadas en microbiología (Gram y Ziehl Neelsen),
sus fundamentos y su utilidad.
8. Realizar la observación microscópica de los frotis teñidos. Distinguir morfología (cocáceas y
bacilos, Gram positivos y negativos) y agrupación (cadenas, racimos, diplococos).
MARCO TEÓRICO
El objetivo del laboratorio de microbiología es la identificación del agente causal de la

infección a partir de una muestra clínica.
Para lograr este objetivo se debe realizar:

a. Examen microscópico de la muestra (tinción de Gram) que otorga una orientación rápida al
clínico.
b. Siembra de la muestra en medios de cultivos, seleccionando los medios de cultivo adecuados
según el microorganismo que se sospeche y el origen de la muestra.
c. Incubación de los medios de cultivos sembrados a 37°C por 16 a 24 horas, para obtener
desarrollo de colonias bacterianas.
d. Diagnóstico microscópico de las colonias con tinciones y diagnóstico macroscópico de las
colonias que permite una orientación para la identificación bacteriana.
e. Pruebas bioquímicas y estudio de sensibilidad (antibiograma) a partir de las colonias desarrolladas en
el cultivo. En otras 16-24 horas se leen los resultados de estas pruebas llegándose a la identificación del
microorganismo.
Para trabajar correctamente en el laboratorio de microbiología es necesario conocer los riesgos a

los que se está expuesto. Para minimizar y controlar estos riesgos deben observarse estrictas medidas
de seguridad, tanto para proteger al operador como para evitar la contaminación de las muestras
clínicas y cultivos.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
A. Bioseguridad:
Se define bioseguridad como un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud

de las personas que trabajan en el laboratorio frente a riesgos por agentes biológicos, físicos o químicos,
así como también la protección indirecta del ambiente.
Situaciones de Riesgo:
• Riesgo por agentes biológicos: El riesgo de infección por microorganismos se produce por
inhalación, ingestión o contacto directo a través de la piel, mucosas erosionadas y/o sanas y a través de
la conjuntiva.
• Riesgo por agentes químicos: Se produce por ingestión, inhalación y/o contacto con la piel, tejidos,
mucosas o conjuntiva, de sustancias tóxicas, irritantes, corrosivas y/o nocivas.
• Riesgo por agentes físicos: Se está expuesto cuando se manipulan gases o sustancias radioactivas,
radiaciones ionizantes y no ionizantes, exposición a ruidos, vibraciones, fuego y electricidad.
Medidas mínimas de bioseguridad en el laboratorio:
1. Uso obligatorio del delantal abotonado. No se puede ingresar al área del laboratorio sin
2. delantal
3. Pelo largo tomado.
4. No colocar bolsos y ropa en el área de trabajo. 4.- No comer, fumar ni beber en el laboratorio.
5. En caso de derrame de material contaminado en las superficies de trabajo, avisar al ayudante.
6. No pipetear con la boca.
7. En caso de que la piel o mucosas tomen contacto con material contaminado, se debe lavar
profusamente con agua y jabón en el caso de la piel y sólo con agua en el caso de mucosas.
8. Desechar el material contaminado en recipientes adecuados.
9. Uso cuidadoso de los mecheros.
10. Lavar las manos con agua y jabón al finalizar el paso práctico.
B. Control de la contaminación en el laboratorio:
Dada la relevancia del diagnóstico etiológico que otorga el laboratorio, es de la mayor

importancia evitar la contaminación de las muestras, ya sea desde el operador como desde otras
muestras procesadas sucesivamente (contaminación cruzada). Para ello, es necesario que el operador
trabaje con técnica aséptica y que el material utilizado sea estéril.
1. Esterilización:
Proceso que lleva a la eliminación absoluta de microorganismos: bacterias (formas vegetativas

y esporuladas), virus y hongos en las superficies inanimadas.
Métodos de esterilización:
• Físicos:
o Calor seco:
§ Incineración (mechero)
§ Horno Pasteur
o Calor húmedo:
§ Ebullición
§ Autoclave
§ Pasteurización
• Luz ultravioleta
• Radiaciones ionizantes
• Ondas sónicas y ultrasónicas
• Filtración
• Químicos:
o Óxido de etileno
2. Técnica aséptica:
En el laboratorio de microbiología es esencial trabajar con técnicas estériles que eviten la

contaminación de las muestras clínicas.
Dado que los medios de cultivo están diseñados para favorecer el crecimiento microbiano, las bacterias
y los hongos del ambiente (provenientes de los materiales, manos y faringe del operador, etc.)
depositados sobre el medio crecerán y contaminarán los cultivos. Esto debe ser evitado para tener la
certeza que los microorganismos desarrollados correspondan a los de la muestra.
Por lo tanto, los medios de cultivo se esterilizan antes de su uso y se manipulan con técnica aséptica
3. Técnicas de siembra microbiológica:
El objetivo de la siembra microbiológica es obtener desarrollo de colonias aisladas para poder

lograr la identificación de las bacterias.
Existen distintos tipos de siembras, las más usadas son la siembra en cuadrantes y la siembra
cuantitativa.
• Siembra en cuadrantes:
Pretende obtener colonias aisladas, para lo cual en la primera parte del cuadrante (1), se siembra
la muestra directamente (tórula con la que se obtiene la muestra). Para diseminar en la segunda zona
(2), se esteriliza por incineración (mechero) una pipeta Pasteur o asa de siembra, que se enfría y se
arrastra muestra desde la zona 1 a la 2. Se esteriliza nuevamente el asa, se enfría y se disemina en la
zona 3 de igual forma. Por último, en la zona 4 se realiza una diseminación en estría.
• Siembra cuantitativa:
El objetivo de este tipo de siembra es cuantificar el número de bacterias presentes en la muestra,

para lo cual se debe sembrar una cantidad conocida y exacta de muestra. En el caso de una muestra de
orina, se siembra con un asa calibrada de 1 microlitro (0.001 ml) en la zona 1 de inoculación primaria.
Posteriormente se disemina con estrías perpendiculares a la inoculación primaria (2). Se incuba, se
realiza el recuento de colonias, se multiplica por 1000 y se informa en Unidades Formadoras de Colonias
(ufc) por ml. de muestra.
MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA DE LAS COLONIAS (Diagnóstico macroscópico)
Permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos, que poseen

características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen y color de la
colonia.
La orientación sobre las pruebas bioquímicas para la identificación definitiva depende en gran parte del
aspecto macroscópico de las colonias.
Figura Nº1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia

MICROSCOPIA Y TINCIONES:
La observación microscópica de una colonia extendida sobre un portaobjetos permite distinguir
la forma microscópica de las bacterias.
• Microscopía directa al fresco:

Esta técnica no utiliza tinciones, sino que consiste en observar entre lámina y laminilla una gota
de muestra clínica o una gota de cultivo líquido. Su principal utilidad es la observación de la motilidad
bacteriana.
• Microscopía con tinciones:

La observación microscópica de bacterias utiliza variadas técnicas tintoriales que se basan en
ciertas características estructurales de los agentes, de las cuales la más importante es la tinción de Gram.
La siguiente tabla menciona algunas tinciones utilizadas en el laboratorio para el diagnóstico de
infecciones bacterianas.
TINCION REACTIVOS PRINCIPIO UTILIDAD

Gram Cristal violeta, lugol, Gram positivos retienenClasificación
acetona, safranina cristal violeta (azul)bacteriana clásica:
Gram negativos se tiñenGram (+) y (-)
con contraste (rojo)
Tinción de Verde de malaquita, Tiñe la espora (verde) Esporas de bacilos

esporas safranina Gram (+)
Kinyoun Fucsina, ácido sulfúrico, Unión ácido resistente Nocardia (BAA
azul de metileno de fucsina a escasos lábiles)
ácidos micólicos de
pared (fucsia)
Naranja de Naranja de acridina Tiñe DNA bacteriano Bacterias Gramlábiles
acridina (fluorescencia) (fluorescencia naranja)
Giménez Fucsina, verde de Tiñe la pared de Bartonella spp,

malaquita Bartonella (fucsia) corpúsculo elemental
de Chlamydia
Ziehl Neelsen Fucsina, alcohol-ácido, Unión ácido-alcohol Micobacterias

azul de metileno resistente de fucsina a (BAAR*)
ácidos micólicos de
pared (fucsia)
Auramina- Auramina-rodamina, Unión de auramina- Micobacterias (mayor
rodamina permanganato de potasio rodamina al ácido sensibilidad que Ziehl
micólico de pared Neelsen)
(fluorescencia amarilla)
Tabla Nº1. Tinciones de uso en el diagnóstico de agentes bacterianos.

BAAR* bacilos ácido-alcohol resistentes
1. Tinción de Gram:
La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología es la tinción de Gram, pues

divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram negativo. Además, permite
diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición bacteriana (diplos, cadenas, racimos).
La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luego tratarlas con
una solución mordiente (fijadora) de Iodo y Ioduro. Todas las bacterias se tiñen en estas condiciones.
Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el colorante al tratarlas con un agente decolorante
como etanol o una solución decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son
Gram positivo; las que se decoloran son las Gram negativo y para observarlas deberán teñirse con
un colorante de contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color azul y las
Gram negativo de color rojo o rosado.
La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la diferencia en la composición
química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram positivo tienen una capa
gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram negativo tienen menor cantidad de
peptidoglicán y tienen una membrana externa (además de la membrana citoplasmática). La
explicación más aceptada es que, luego de la acción de la solución decolorante, las bacterias Gram
positivo son capaces de retener el colorante gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram
negativo, pierden parte de los lípidos de su membrana externa por acción del decolorante (un
solvente orgánico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicán,
hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crítica en la tinción es la de decoloración,
por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada. Esta tinción es la más
importante en microbiología pues permite diferenciar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram (+)
y Gram (-).
La tinción de Gram:
1. Revela la afinidad tintorial de las bacterias:

-Gram positivo -Gram negativo
2. Permite conocer la forma bacteriana:

-Cocáceas -Bacilos
-Cocobacilos -Vibrios
-Espirilos -Espiroquetas
TÉCNICA
Gram (-)
Gram (+)
3. Permite conocer la disposición bacteriana:

Cocáceas en pares: Diplococcus
Cocáceas en cadena: Streptococcus
Cocáceas en tétrada: Micrococcus
Cocáceas en octógena: Sarcina
Cocáceas en racimo: Staphylococcus
Utilidad clínica de la tinción de Gram:
Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de la infección, que muchas veces
sirve de base para el inicio de terapia antibiótica.
La sensibilidad analítica (número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar) es de 100.000
bacterias /ml de muestra.
La sensibilidad clínica (probabilidad que un paciente que tenga una infección tenga una prueba positiva)
varía según tipo de muestra:
Líquido cefalorraquídeo (meningitis) : 75 %
Líquido pleural (empiema pleural) : 50-80%
Líquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%
Líquido articular (artritis séptica) : 50%
Se debe solicitar en toda muestra clínica

De gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues si bien los
anaerobios no crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de Gram.
2. Tinción de Cápsula:
Utiliza tinta china para evidenciar la presencia de la cápsula microbiana, pues tiñe de color negro
todo el frotis, salvo la cápsula (queda un espacio blanco, sin teñir). El resto del microorganismo se tiñe
de color rojo con el colorante de contraste (safranina). Se observa con objetivo de inmersión (100x). Ej.
Tinción de cápsula (Enterobacter sp. y Streptococcus pneumoniae).
3. Tinción de esporas:
Utiliza el colorante verde de malaquita que tiñe esta forma de resistencia de algunas bacterias.
El resto de la bacteria se tiñe de color rojo con el colorante de contraste (safranina). Se observa con
objetivo de inmersión (100x).
Las esporas pueden ser terminales, subterminales, endoesporas centralmente puestos o pueden
encontrarse libres de la célula bacteriana. Ej.Clostridium, Bacillus.
USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE LUZ (ACEITE DE INMERSIÓN):
Para observar las bacterias con tinción de Gram, tinción de cápsula y tinción de esporas es
necesario utilizar el objetivo de inmersión (100x). Para ello una vez realizado el extendido y la tinción
se debe:
1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio.

2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de inmersión
requiere mucha más luz que los objetivos secos.
3. Enfocar primero con el objetivo 40x (seco), eligiendo la zona de interés.
4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión (100x, línea negra)
EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL
ACEITEDE INMERSIÓN.
5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberá estar
prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá ocupar este pequeño espacio.
7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico.
8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE EL
OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL TISSUE.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS (PRIMERA SESIÓN)
SIEMBRAS
1. De medios sólidos a medios sólidos (técnica de aislamiento en cuadrantes).

1.1. Desde placa Petri a placa Petri:
a. Rotular la placa de Petri con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo,
Grupo y Fecha).
b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilización.
c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no exista
crecimiento bacteriano.
d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio, la muestra
se tomará una sola vez (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria
suficiente para poder sembrar).
e. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero.
f. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:
i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la placa.
Flamear el asa.
ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario
de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa.
iii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la
placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.
iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de
que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la
placa.
g. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.
Figura N°2: Siembra desde medio sólido a medio sólido (placa de Petri)
2. De medios Sólidos a medios Líquidos.
2.1. Desde placa Petri a tubo con medio líquido:
a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo, Grupo,
Fecha).
c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan crecimiento bacteriano.
d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con solo
tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).
e. Destapar el tubo tomando el tapón desde la parte superior, sin tocas la parte que va dentro
del tubo (no dejar el tapón sobre el mesón).
f. Flamear la boca del tubo con medio líquido.
g. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente.
h. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización.
i. Tapar el tubo.
18 – 24
Figura Nº3: Siembra desde agar en placa Petri al tubo con medio de cultivo.
3. De medios Líquidos a medios Sólidos
3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:
a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos
correspondientes.
c. En la placa Petri donde se va a sembrar la muestra, enfriar el asa.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e introducir el
asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla.
e. Flamear la boca del tubo y taparlo.
f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero.
g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:
h. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la placa.
Flamear el asa y enfriar en una zona del agar que no haya sido sembrada.
i. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la
placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa y enfriar en una zona del agar
que no haya sido sembrada.
ii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la
placa en forma de zig-zag. Flamear el asa y enfriar en una zona del agar que no haya
sido sembrada.
iii. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que
cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa.
i. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.
18 – 24
Figura Nº4: Siembra desde cultivo bacteriano líquido en placa de Petri.

3.2 Desde tubo de cultivo bacteriano líquido a tubo con Agar tendido (Zig-zag superficie):
a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo
y Fecha).
b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación.
c. Flamear el asa en loop para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa
en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego
retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.
g. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento, deslizar el asa con
movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo.
h. Flamear y tapar la boca del tubo.
i. Flamear el asa para su esterilización.
Figura Nº5: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar tendido.
3.3 Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar blando (Por pinchadura):
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.

c. Flamear el asa en punta para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa
en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego
retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estéril; para ello:
g. Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de
cultivo al centro sin llegar al fondo de este.
h. Retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible.
i. Flamear la boca del tubo y tápelo.
j. Flamear el asa para su esterilización.
Figura Nº6: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar blando.
3.4 Desde tubo con cultivo bacteriano líquido al tubo con agar semi tendido (pinchadura en el fondo
y zig-zag en la superficie).
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.

c. Flamear el asa en punta para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el
asa en las paredes de este.
e. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla.
f. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
g. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estéril; para ello:
h. Destapar el tubo estéril, flamear la boca del tubo e introducir el asa cargada sin tocar las
paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo de este.
i. Al retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible, en la superficie
tendida pasar el asa en forma de zig-zag.
j. Flamear la boca del tubo y tápelo.
k. Flamear el asa para su esterilización.
Figura Nº7: Siembra desde cultivo bacteriano líquido al tubo con agar semi tendido.
TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN
1. Esterilización
1.1. Flameado
a. Dividir una placa por la mitad.
b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por una mitad del
agar. Cerrar la placa.
c. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente por la otra
mitad del agar.
d. Cerrar la placa.
e. Incubar la placa a 37ºC.
2. Desinfección y Asepsia
2.1. Cloro
a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos.
b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico.
c. Deslizarla rápidamente por un sector del mesón de trabajo, alejado del mechero (más
de 30 cm).
d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag).
e. Humedecer la misma tórula con la solución de cloro, espere tres minutos.
f. Ahora pasar la tórula por la otra mitad del agar (Zig-Zag).
g. Incubar la placa a 37ºC por 24hr.
2.2. Yodo
a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar.
b. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere unos
segundos.
c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.
d. Incubar la placa a 37ºC.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS (SEGUNDA SESIÓN)
1. Realizar análisis Macroscópico de la placa agar nutritivo sembradas la sesión anterior.

2. Realizar análisis Microscópico mediante tinción de Gram de las placas de Agar nutritivo
TINCIONES
Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.

a. Flamear el asa para su esterilización.
b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de diámetro).
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
e. Obtener una pequeña muestra desde la placa.
f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto.
g. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.
Tinción Gram
a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.
b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 2 min.
c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de Lugol. Dejar con
Lugol por 1 min.
d. Lavar el lugol alternadamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente, hasta
que se decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-acetona y
luego con agua)
e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.
f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.
g. Observar en el microscopio óptico con aumento de 100X y aceite de inmersión. Caracterizar
según criterios microscópicos (afinidad tintorial, morfología y agrupación) los
microorganismos.
Tinción de cápsula.
a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de tinta china del tamaño de una arveja.
b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.
c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 ó 4 veces (sólo agregar la
bacteria).
d. La tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es
necesario mezclar con suficiente cultivo.
e. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con tinta china.
f. Asegúrese de esterilizar el asa previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo.
g. Realizar un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa delgada.
h. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto
que contiene la mezcla tinta china-bacteria. Ver Figura 8.
i. Fijar suavemente en el mechero.
j. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste (Fucsina).
k. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.
B)
A)
C) D)
E) F)
Fucsina
Cápsula
Figura N°8: Esquema de la tinción de cápsula.

Tinción de esporas.
a. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel absorbente.
b. Ponga una gota de agua del tamaño de una arveja en el portaobjetos.
c. Tome una muestra de Bacillus spp. con el asa, mezcle con la gota de agua y fije en el mechero
hasta que se seque completamente (sin hervir).
d. No olvide esterilizar el asa después de usarla. No la deje contaminada sobre el mesón.
e. Corte papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis con bacteria.
f. Ponga 4 capas de papel sobre el frotis y a continuación agregue solución colorante verde de
malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en
contacto con el frotis bacteriano.
g. Esta tinción se realiza en caliente: para ello con unas pinzas de madera debe colocar la muestra
encima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 5 min. No sobrecaliente
para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto, mueva la muestra por sobre la
llama del mechero para evitar que se quiebre el portaobjetos y se queme la muestra.
h. Una vez que se detenga la emisión de vapor desde la muestra, hay que reponer el colorante
nuevamente. Debe repetir 4 veces este proceso.
i. Lave con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante verde de malaquita.
j. Posteriormente cubra el frotis con el colorante de contraste, safranina durante 1 min.
k. Lave con agua, sin dejar que el agua llegue de manera brusca sobre su muestra.
l. Seque cuidadosamente con papel absorbente y observe con inmersión.
C) D)
Papel absorbente
E) F) G)
Verde malaquita
Safranina
Figura N°9: Esquema de la tinción de esporas.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2:
MICROBIOTA Y FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM

POSITIVO
Como en la mayoría de los animales, en el organismo humano hay lugares que

normalmente se mantienen estériles y otros donde cohabitan, también normalmente, una gran
diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aun en las personas más sanas.
La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores (bronquios
y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los mecanismos de defensa
que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, oídos, piel, nariz o conjuntivas residen
diversos microorganismos que conforman la microbiota del ser humano. Algunos de los
microorganismos más frecuentemente encontrados en los cultivos de las diferentes regiones del
cuerpo y que se consideran integrantes de la microbiota, son: Staphylococcus epidermidis, S.
aureus, Streptococcus mitis, S. salivarius, S. mutans, S. faecalis, S. pneumoniae, S. pyogenes,
bacterias coliformes como Escerichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,
Haemophilus influenzae, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos, clostridios como Clostridium
tetani.
La microbiota transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias
Gram positivo, como Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y del género Neisseria,
microbiota fúngica como Candida albicans, la cual se considera patógena siempre que se aísla
desde la piel.
Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a través
de la nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos microorganismos son atrapados
en las secreciones mucosas. Así, los senos nasales, la tráquea, los bronquios y los pulmones son
habitualmente estériles. La nasofaringe es el hábitat natural de bacterias y virus patógenos
comunes que causan infecciones en la nariz, garganta, bronquios y pulmones.
Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos y
descargan estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.
Las bacterias con las que convivimos diariamente pueden representar un riesgo para
nuestra salud cuando el ecosistema en el cual conviven simbióticamente cuerpo humano- bacteria
se ve afectado, ya sea por alteración del ecosistema bacteriano o por factores del huésped que
favorecen la disminución de la inmunidad (defensas) y que permiten que las bacterias normales
invadan y ataquen a su huésped humano.
Es en estos casos que el diagnóstico de los organismos responsables es de suma
importancia para poder elaborar tratamientos adecuados. Por este motivo, el Laboratorio de
Microbiología cumple un rol fundamental en la identificación de bacterias en una muestra
determinada.
El análisis microbiológico de una muestra, por lo general sigue la siguiente secuencia:

a. Observación directa al microscopio
b. Cultivo
c. Identificación fisiotaxonómica (batería bioquímica)
d. Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos
La observación directa de la muestra teñida con tinción de Gram entrega información sobre
su contenido bacteriano. Los cultivos permiten observar la morfología de las colonias bacterianas
en un medio determinado. Ambos estudios orientativos se complementan con análisis de
identificación como baterías bioquímicas y de sensibilidad a agentes antimicrobianos.
La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través de las
alteraciones que producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitido establecer
diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en diferentes géneros y
especies.
Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y especies
bacterianos en base a la detección de:
a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol,
Citrato.
b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano: Indol,
CO2, Ácido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol, etc.
c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa, etc.
d. Sensibilidad a algunos compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina, Optoquína,
Novobiocina, etc.
En general, para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos últimos
métodos, en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros. Estas pruebas
se pueden realizar mediante baterías en tubos convencionales o mediante sistemas comerciales
más fáciles de manipular (API).
En este trabajo se analizarán dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más
importantes, como son las Micrococcaceae y Streptococcaceae.
La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus y

Planococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Son catalasa
positivo, reacción que se usa para diferenciar la Familia Micrococcaceae de otros cocos Gram
positivos como por ejemplo Streptococcus.
Figura Nº10: Agrupación de algunas cocáceas Gram positivo

Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran habitualmente en la
piel de mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia
de las especies del género Staphylococcus que son aerobios anaerobios facultativos.
Otra característica que diferencia ambos géneros es la propiedad de Staphylococcus de
fermentar glucosa en anaerobiosis, no así los Micrococcus que no tienen esta propiedad.
Las principales especies del género Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una
variedad de factores responsables de su patogenicidad, algunos de estos se describen en las Tablas
Nº 2 y 3.
Tabla Nº 2: Algunas enzimas producidos por Staphylococcus aureus.

Enzimas Acción en la célula blanco
Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los
Hialuronidasa
tejidos por las bacterias.
Fibrinolisina Disgrega coágulos de fibrina.
Coagulan el plasma y, se pueden encontrar secretadas al
Coagulasa
medio extracelular y otras que están unidas a membranas.
Nucleasas Hidrolizan DNA.
Tabla Nº 3: Algunas toxinas producidos por Staphylococcus aureus.

Toxinas Acción en la célula blanco
Es una hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una
Alfa toxina
proteína antigénica de peso molecular 30.000 D.
Leucocidina* Causa degranulación de los leucocitos y macrófagos.
Algunas cepas producen esta toxina, la que causa el síndrome de piel
Exfoliatina
quemada.
Algunas cepas producen estas toxinas que causan intoxicaciones
Enterotoxinas
alimentarías.
* También es conocida como toxina de Panton - Valentine.
Las toxinas producidas por Staphylococcus aureus son causantes de los síntomas de las
enfermedades estafilocócicas.
Aislamiento y Caracterización:
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus dependerá si la muestra es
un alimento o si es una muestra clínica.
Para el aislamiento de S. aureus en muestras CLÍNICAS como pus, heridas, secreciones,
etc. se utilizan:
AGAR SANGRE. Éste es un medio enriquecido que contiene sangre desfibrinada de cordero o de
conejo. Permite el desarrollo abundante de las especies de Staphylococcus y además permite visualizar la
producción de hemolisinas por lisis de los glóbulos rojos alrededor de las colonias.
• S. aureus: produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias, producida por
la alfa toxina.
• S. epidermidis: no produce hemólisis o lo hace débilmente.
• Micrococcus: no produce hemólisis.
Figura N°11: Tipos de Hemólisis
AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN. Es un medio selectivo que

contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus y Staphylococcus
son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentración de NaCl. En este medio
además se evidencia la fermentación de manitol, la que se observa por el viraje del indicador a
amarillo.
• aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la
fermentación)
• epidermidis: generalmente no fermenta el manitol
• Micrococcus: no fermenta el manitol.
En los dos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante
tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar
colonias semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos Gram positivo en racimo se
realizan pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico.
Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en medios
selectivos se realizan las pruebas bioquímicas. Si se sospecha que la colonia corresponde a
Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de la COAGULASA. Esta es una prueba de
PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas:
• Técnica en tubo: consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo líquido de
Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la aparición de un coágulo a las 4
horas. Esta técnica detecta la coagulasa libre.
• Técnica en portaobjeto: a partir de un cultivo de Staphylococcus en medio sólido, se hace
una suspensión abundante sobre una gota de agua. Esta suspensión debe ser lo más
homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos gotas de plasma de conejo y se
homogeniza. La reacción positiva se observa como aglutinación de las bacterias a los 20
segundos. Esta técnica detecta la coagulasa unida a membrana.
Partículas de latex con

Bacterias Aglutinación de las partículas
anticuerpo
Figura N°12: Anticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano. (Proteína A)
Familia Streptococcaceae
El Género Streptococcus corresponde a cocáceas Gram positivo, anaerobios facultativos
que se disponen en pares o en cadenas y son catalasa negativo, reacción que los diferencia de la
Familia Micrococcaceae. Bajo ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides o alargadas.
Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales como
cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en la industria lechera
para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yogurt (Streptococcus lactis).
Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo con:
ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser cultivadas en
placas de agar sangre.
a. Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las colonias.
b. Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso (viridans)
alrededor de las colonias.
c. Gama hemolíticos: no producen hemólisis
SEGÚN CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR: la clasificación de

Lancefield. Se basa en la composición química y antigénica de un hidrato de carbono presente en la
pared celular y permite clasificar a los estreptococos en grupos serológicos que van desde la A hasta la
U.
Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos
beta hemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que es el más virulento del
género.
Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder
patógeno. Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis,
etc. Además, provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y escarlatina.
Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este género,
agente causante de neumonía lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esférico, tiene
forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una cápsula.
Es habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas deben incubarse en
un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfa hemólisis y las colonias
son planas con formas de fichas de damas.
Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo, Enterococcus faecalis). Existenotras
especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les conoce con el
nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque generalmente son no
hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl 6,5%), pH básico (pH 9,6) y
presencia sales biliares en que otros estreptococos no pueden hacerlo. Su presencia en alimentos
o agua indica contaminación fecal.
Aislamiento y Caracterización:
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre una placa de
agar sangre. Los Streptococcus pyogenes presentan las siguientes características:
a. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las

colonias, las cuales son muy pequeñas. Se debe confirmar mediante tinción de Gram la
presencia de cocos Gram positivo en cadena ya que otras especies pueden dar colonias semejantes,
por ejemplo, Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se realizan pruebas adicionales
para confirmar el diagnóstico.
b. Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del grupo A
(Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina (se estudia como un antibiograma).
Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo, no son beta hemolítico.
c. Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar
mediante reacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno superficial.
d. Bilis/Esculina, NaCl 6,5%. Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%, toleran
las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para
distinguir los Enterococos de otros cocos Gram Positivo catalasa-negativo. En la prueba
positiva, el tubo donde está el medio se torna de color chocolate oscuro, característico al
desdoblar la bilis esculina.
Figura Nº13: Prueba de Bilis/Esculina

Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos: Método de difusión en agar o Kirby-Bauer
Una metodología común para el estudio de la sensibilidad a antimicrobianos es la difusión
en agar. Este método cualitativo se basa en la inoculación del microorganismo sobre una placa
de agar donde se colocan discos de papel filtro estériles impregnados con una concentración
conocida de antibiótico. El antibiótico en los discos difunde radialmente durante el tiempo de
incubación de tal manera que a medida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un
punto determinado, la concentración del antibiótico no podrá inhibir el crecimiento del
microorganismo, produciéndose entonces una zona circular de inhibición (o halo de inhibición)
alrededor del disco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías
de “susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo con las tablas publicadas por el
“National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.
Figura Nº14: Antibiograma mediante la técnica de difusión con discos
Bacitracina: Es un antibiótico que interfiere con la síntesis de las subunidades del

peptidoglicano. Se debe diseminar en una placa de agar sangre una colonia con la precaución de
una siembra homogénea y total de la placa. Luego se coloca un disco de bacitracina, se incuba 16-
24 horas y después se mide el tamaño del halo.
• Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥ 10 mm de diámetro.
• Se considera resistente cuando el halo de resistencia es de < 10 mm de diámetro.
a. Micrococcus son sensibles a bacitracina.

b. Staphylococcus, son resistentes a bacitracina.
Optoquina: es un compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la membrana

celular de la bacteria y que a bajas concentraciones (5µg/ml) permite diferenciar Streptococcus
pneumoniae que es sensible de otros Streptococcus α hemolíticos. Se utiliza un disco de optoquina
que se deposita en una placa de agar sangre cordero luego de haber diseminado la colonia
sospechosa. Se incuba la placa a 37°C por 24 horas y después se mide el halo de inhibición. Si el
halo es de 14 mm, corresponde a Streptococcus pneumoniae
Novobiocina: es un antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de
infecciones por S.aureus y para el tratamiento de infecciones urinarias resistentes a otros
fármacos. La novobiocina es bacteriostática e interfiere con la síntesis de la pared bacteriana. Este
fármaco se utiliza muy poco debido que su uso está asociado a una alta incidencia de reacciones
adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes
Amoxicilina / Ácido Clavulánico: La asociación amoxicilina/ácido clavulánico está

indicado para el tratamiento a corto plazo de las infecciones bacterianas en las siguientes
localizaciones cuando se sospecha que estén causadas por cepas resistentes a amoxicilina
productoras de beta-lactamasas. En otras situaciones, debería considerarse la amoxicilina sola.
• Infecciones del tracto respiratorio superior, en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis
recurrente: estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pyogenes.
• Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas de
bronquitis crónicas (especialmente si se consideran graves), bronconeumonía. Estas
infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae y Moraxella catarrhalis.
• Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis
(especialmente cuando sea recurrente o complicada excluyendo prostatitis), aborto
séptico, sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal, las cuales son a menudo
producidas por Enterobacterias (principalmente Escherichia coli, Staphylococcus
saprophyticus spp. y Enterococcus spp.)
• Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales y
abscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo producidas por
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides spp. Algunas cepas de estos
gérmenes producen beta-lactamasas, lo cual hace que no sean sensibles a amoxicilinasola.
NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar.

RECUERDE EN TODO MOMENTO TRABAJAR CON TÉCNICA DE
ESTERILIZACIÓN PARA EVITAR LA CONTAMINACIÓN QUE CONDUCIRÁ A
RESULTADOS ERRÓNEOS.
RECUERDE QUE ESTÁ TRABAJANDO CON MUESTRAS BIOLÓGICAS Y
MICROORGANISMOS PATÓGENOS, POR LO QUE DEBE APLICAR LAS
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD APRENDIDAS CON ANTERIORIDAD.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS (Primera sesión)
Objetivos
a. Conocer la importancia de una buena toma de muestra
b. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de cocáceas Gram positivo aisladas a
partir de muestras clínicas, así como de la microbiota.
c. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo
d. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clínicas.
e. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.
Muestras clínicas
a. Observe la placa sembrada con su muestra clínica. Describa macroscópicamente las

colonias bacterianas. Observe si se trata de cultivos puros.
b. Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe al
microscopio con aumento 100X oil.
c. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación de
bacterias Gram positivo.
Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2 en H2O y O2.
La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo. La excepción es
Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciar Staphylococcus,
Micrococcus y Listeria, todos ellos catalasa +, de Streptococcus, catalasa –
Procedimiento Prueba de la catalasa

a. Ponga sobre el portaobjeto una gota de H2O2
b. Con un palillo desechable tome la colonia en estudio y agréguela a la gota en el portaobjeto.
La aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+).
c. Precauciones: no tocar ni sacar agar sangre al tomar la colonia ni usar asa de platino, ya
que estas sustancias dan falsos positivos.
d. Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.
e. Elimine el portaobjeto y el palillo en los recipientes respectivos
Figura Nº15: reacción de la enzima Catalasa en presencia de Peróxido de hidrógeno.
32
Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcus
aureus.
Procedimiento Prueba de la Coagulasa:

a. Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.
b. Con un palillo plástico tome varias colonias desde el agar.
c. Mezcle con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de conejo).
d. Espere unos minutos agitando constantemente con el palillo.
e. Si existe la presencia de coágulos (apariencia de “leche cortada”), la reacción es positiva.
Si se ve siempre homogéneo, la reacción es negativa.
f. Anote lo observado e identifique al patógeno presente en su muestra.
Test de CAMP para Streptococcus

Permite confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la producción de una zona de
hemólisis característica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se
denomina “punta de lanza” (Ver figura adjunta)
Figura 16: Test de CAMP positivo
Procedimiento Test de CAMP:

a. Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro a partir de
un cultivo de Staphylococcus aureus.
b. Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con su muestra clínica.
c. Incubar a 37ºC por 24 horas.
33
Identificación de Streptococcus β hemolítico por aglutinación con látex:
Consiste en la identificación de los distintos grupos de Streptococcus β hemolítico grupo
A, B, C, D, F y G.
Procedimiento prueba de aglutinación con látex:

a. Agregue 1 gota de cada reactivo de látex en cada uno de los 6 pocillos de la tarjeta de
aglutinación.
b. Tome dos a tres colonias β hemolíticas que quiera identificar. Recuerde que deben
pertenecer a un cultivo puro y al Gram ser cocáceas Gram (+) en cadenas.
c. Mezcle y agite circularmente las colonias en cada pocillo de la tarjeta durante UN
MINUTO.
Procedimiento del Test de difusión por Sensidiscos (Kirby-Bauer).

a. Con el asa tome una colonia aislada desde la placa de Agar sangre y siémbrela en el tubo
de suero fisiológico estéril hasta que quede turbio. Compare con el standard 0,5 Mac
Farland.
b. Tome la tórula estéril y (sin flamearla) sumérjala en el caldo recién inoculado. Flamee la
boca del tubo y cierre.
c. Deslice la tórula sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton (Staphylococcus) o agar
Müller-Hinton Sangre (Streptococcus). Al terminar elimine la tórula en el recipiente
apropiado.
d. Tome la pinza estéril y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos
(5 en total) y distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden
demasiado cerca del borde de ella ni demasiado cerca entre sí.
e. Incubar a 37ºC por 24 horas.
RECUERDE que la elección de los sensidiscos dependerá del patógeno que haya identificado en
su muestre clínica.
Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en la tapa de la
placa antes de sacar uno. NO FLAMEE los frascos con los sensidiscos.
Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y presiónelos suavemente
contra el agar con la pinza (sin hundirlos).
Muestras de la microbiota
Para el estudio de flora normal tómese una muestra bucofaríngea o nasal (ambos integrantes
deben tomarse la muestra, Ustedes eligen quien se toma cada una)
a. Tome una tórula estéril y sumérjala en suero fisiológico.
b. Introduzca la tórula en la zona de interés y recolecte la muestra
c. Siembre en agar sangre. Sólo el primer cuadrante se siembra con la tórula y el resto con asa
previamente flameada para poder obtener colonias aisladas.
34
ACTIVIDADES PRÁCTICAS (Segunda Sesión)
Resultados de la siembra de la microbiota
Escoja la colonia aislada más representativa de su cultivo de flora

normal. Descríbala macroscópica y microscópicamente.
Lectura e interpretación del Test de Sensidiscos

a. Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la bacteria
es “susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los antibióticos dispuestos en
el agar. Compare con la Tabla adjunta, según corresponda.
b. Anote sus observaciones.
Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller –Hinton)
DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE Observaciones
DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)
Oxacilina 1 µg ≥ 13 11-12 ≤ 10 Para S. aureus
Eritromicina 15 µg ≥ 23 14-22 ≤ 13
Clindamicina 2 µg ≥ 21 15-20 ≤ 14
Vancomicina 30 µg ≥ 15 - -
Bacitracina 0,05 unidades ≥ 10 - < 10
Novobiocina 5 µg ≥ 16 - ≤ 16
Amoxicilina / 20 / 10 µg ≥ 20 - ≤ 19
A. Clavulánico
Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus β-hemolíticos y Enterococcus

(Mueller- Hinton con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE
Penicilina 10 unidades ≥ 28 20-27 ≤ 19
Optoquina 5 µg ≥ 14 - -
35
Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hinton
con sangre de cordero)
Penicilina 1 µg de oxacilina ≥ 20 - -
Trimet/sulfame 1.25/25.75µg ≥ 19 16-18 ≤ 15
Vancomicina 30µg ≥ 17 - -
Optoquina 5 µg ≥ 14 - -
Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus spp. del grupo Viridans α-hemolítico
(Mueller-Hinton con sangre de cordero)

Tetraciclina 30 µg ≥ 23 19-22 ≤ 18
Cefotaxima 30 µg ≥ 28 26-27 ≤ 25
Cloranfenicol 30 µg ≥ 21 18-20 ≤ 17
36
TRABAJO PRÁCTICO Nº3:
FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO
El grupo de las Enterobacterias, nombre común utilizado para referirse a la Familia

Enterobacteriaceae, incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayoría de
ellos móviles mediante flagelos perítricos, que como característica microbiológica fenotípica
común tienen la capacidad de fermentar la glucosa y reducir los nitratos a nitritos.
Tienen como hábitat el intestino de animales inferiores y del hombre. Tienen además una
amplia distribución en el ambiente, se encuentran en el suelo, agua, plantas y algunas especies de
esta familia, como Proteus spp., cumplen una función ecológica importante: inician en el ambiente
la degradación de la materia orgánica y por este comportamiento se relaciona con un ciclo de vida
netamente ambiental, son saprófitos.
Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que
en su relación con el hospedero humano son comensales, como es el caso de Escherichia coli, un
constituyente importante de la microbiota intestinal normal aerobia, especialmente a nivel de la
porción distal del intestino delgado y fundamentalmente a nivel del intestino grueso. En esta
localización la presencia de E. coli resulta en un beneficio para el hospedero, pues como parte de
su metabolismo se sintetizan vitaminas y también participa en la degradación de ácidos y sales
biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli a nivel intestinal, su detección se utiliza como
marcador de contaminación fecal, por ejemplo, se ha establecido un “Índice coli” para evaluar la
calidad microbiológica del agua potable o de alimentos. Si el índice coli sobrepasa la norma
considerada aceptable significa que existe contaminación fecal e indirectamente se deduce que el
agua o el alimento, según sea el caso, puede contener patógenos intestinales.
Otros integrantes de este grupo en cambio son patógenos intestinales como son géneros
Salmonella, Shigella, Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia específicos que
afectan el intestino y por ello se denominan E. coli diarreogénicos. Estos grupos o géneros
bacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clínicamente como diarrea
acuosa, diarrea con sangre (también denominada diarrea enterocólica o síndrome disentérico) y en
algunos casos a partir de la infección intestinal estas bacterias pasan al torrente sanguíneo y se
puede producir una infección sistémica o bacteremia, como por ejemplo la fiebre tifoidea
(Salmonella enterica serovar Typhi).
37
En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra clínica o ambiental sigue, por lo general,
la siguiente secuencia:
a) Toma de muestra
b) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)
c) Observación de morfología macroscópica
d) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.
e) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas) con batería
bioquímica convencional y Sistema estandarizado API 10S
f) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.
La fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a
distintos medios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios.
Estas alteraciones, son producidas por enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya que
no todos los microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales y las mismas
rutas metabólicas. De este modo esta técnica taxonómica se basa principalmente en la
detección de:
a) Utilización de distintas fuentes de carbono.
b) Formación de productos finales.
c) Presencia de enzimas.
d) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.
La identificación de una cepa bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayos
bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de
reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la
bacteria al crecer transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioquímicos son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una característica bioquímica como la presencia o ausencia de una
determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o vía metabólica, crecimiento a una
determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de
ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se puede utilizar diversos sistemas de trabajo (medio de cultivo,
indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de
38
distintos microorganismos. Por ejemplo, se debe suplir con factores de crecimiento el medio
de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el
microorganismo en estudio es exigente.
A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de
identificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las
pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro
impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En
todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.
I. Batería bioquímica convencional para diagnóstico microbiológico
1. Agar tendido corriente: medio sólido nutritivo, que permite observar posible pigmentación
en las colonias.
2. Agar Urea de Christensen: medio sólido en el que se puede observar la presencia de la

enzima Ureasa, ya que contiene además de nutrientes básicos:
• Triptona.
• Urea.
• Indicador de pH fenolftaleina.
Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa, de
degradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente evidenciable, porque el pH varía
hacia alcalino debido al efecto del amoníaco. Este cambio se observa por viraje del indicador
de pH como Fenolftaleína (Figura 17)
39
Figura N° 17: Resultados medio Urea
3.- Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene, además de sales minerales:
• Fosfato de amonio.
• Citrato de sodio, como única fuente de carbono.
• Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).
En este medio sólo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima Citrato
Permeasa, la que les permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática.
Una vez en el interior de la célula, el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los
ácidos tricarboxílicos (Figura Nº 18)
Figura Nº 18: Resultados medio Citrato
40
4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de varias
rutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de cada bacteria, del
azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos productos serán ácidos (fórmico,
pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen muchos medios de cultivo que se han
diseñado con el objeto de detectar la producción de ácido y gas a partir de distintos azúcares.
El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios para
el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización de azúcares. Contiene
además de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc:
• Glucosa al 0,1%
• Lactosa al 1,0%
• Sacarosa al 1,0%
• Citrato de amonio.
• Hierro.
• Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).
a. Si la bacteria inoculada es fermentadora sólo de glucosa usará ésta y se obtiene sólo una
pequeña cantidad de ácido, la que en las primeras 8 a 12 horas de incubación es suficiente para
convertir ambas porciones (tendido y profundo) a un color amarillo. Dentro de las próximas
horas, sin embargo, la glucosa sobrante es completamente agotada y la bacteria comienza la
degradación oxidativa de los aminoácidos en el tendido del tubo, donde hay oxígeno, lo que
lleva a la liberación de aminas que neutralizan las pequeñas cantidades de ácido presente en
el tendido, y en 18 a 24 horas este tendido cambia a pH alcalino y vuelve acolor rojo. En la
porción profunda (anaeróbica) del tubo, la degradación de aminoácidos es insuficiente para
neutralizar el ácido formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI es inoculado con un
organismo fermentador de glucosa y lactosa o sacarosa, aún cuando la glucosa se agota en
las primeras 8 a 12 horas, la fermentación continúa ya que el organismo es capaz de usar
lactosa o sacarosa. Así, a las 18 a 24 horas, ambas porciones están amarillas.
41
b. Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la columna de
agar del fondo del tubo.
c. Para la detección de H2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El tiosulfato

de sodio es la fuente de átomos azufre en la mayoría de los medios usados para la producción
de H2S. Sales de fierro (Sulfato ferroso y citrato férrico amoniacal) incorporadas en el medio
de cultivo reaccionan con sulfuro de hidrógeno para producir un precipitado negro insoluble
(sulfuro ferroso) este reacciona con la sal de hierro dando sulfato ferroso, un compuesto
insoluble de color negro. (Figura 19)
Figura Nº 19: Resultados medio TSI

C: Control negativo
1: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-).
2: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-).
3: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (+).
4: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (-).
5: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (+).
5. Agar LIA: Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre
algunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas reacciones
enzimáticas son: decarboxilación de Lisina y desaminación de Lisina.
Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del grupo -hSH2,
produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).
Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de levadura:
• Aminoácido lisina
42
• Aminoácidos azufrados
43
• Glucosa
• Citrato de hierro y amonio
• Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, morado a pH
alcalino).
a. La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y el indicador
vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendrá esta
coloración amarilla (reacción K/A, negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina
decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando como producto CO2 y una
diamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte
el viraje de amarillo a morado (reacción K/K, positivo). Si la bacteria es capaz de desaminar
a la lisina, la superficie se verá roja y el fondo amarillo (reacción R/A).
b. Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso
(negro). (Figura 20)
Figura Nº 20: Resultados medio LIA
6. Medio MIO: Permite observar motilidad, presencia de la enzima ornitina descarboxilasa y

producción de indol.
a. Si el crecimiento bacteriano se observa como el enturbamiento completo del medio, la
reacción es positiva. Si sólo se limita al pinchazo, es negativa.
44
b. La enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios aminoácidos
en algunas bacterias. La reacción positiva se observa por el color morado del tubo; en cambio,
si la reacción es negativa el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo).
c. La presencia de indol se evalúa agregando una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la
reacción positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio (Figura Nº 21).
Figura Nº 21: Resultados medio MIO (Los pares están organizados sin y con reactivos de
Kovacs)
1: Motilidad (-), ornitina descarboxilasa (-), indol (+) (anillo fucsia)
2: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (-) (anillo amarillo)
3: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (+).
2. Sistemas comerciales usados en la identificación de Enterobacterias
2.1- API 10S: Sistema de identificación estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos
Gram negativo, como algunos no fermentadores (Pseudomonas, Acinetobacter) que utiliza 11
pruebas bioquímicas que usan sustratos deshidratados.
2.2- SensIdent: Es un sistema semiautomatizados que permite identificar bacilos Gram

negativo fermentadores y no fermentadores de glucosa. La identificación se hace mediante
45
pruebas bioquímicas las que vienen liofilizadas en placas de microtitulación y se rehidratan
con la suspensión bacteriana.
2.3 VITEK: Es un sistema automatizado (Bio-Merieux). La identificación de los bacilos

Gram negativo fermentadores y no fermentadores de glucosa se hace a través de pruebas
bioquímicas que vienen incluidas en tarjetas de identificación. Los tiempos de incubación
varían entre 2 y 15 horas. El sistema vitek determina si cada pocillo es positivo o negativo
midiendo la turbidez mediante un lector óptico. Cuando finaliza el periodo de incubación, las
reacciones son analizadas automáticamente y la identificación es impresa.
3. Oxidasa
Busca la presencia de la enzima citocromo oxidasa y consiste en colocar directamente la
colonia sospechosa en el extremo de una varilla que contiene un reactivo oxidable. La reacción
es positiva cuando aparece un color púrpura después de 1 min.
Esta prueba es positiva para Neisseria spp. y para bacilos Gram negativo no fermentadores, y
es negativa para Enterobacterias.
4. Susceptibilidad a Antibióticos
Los antibióticos son agentes terapéuticos producidos por organismos vivos, que inhiben o
destruyen a los agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad están indicados para
apoyar la terapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las
que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su
susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el organismo
causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos
más comúnmente usados.
Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos que determinan
in vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo
condiciones específicas y estandarizadas.
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ACTIVIDADES PRÁCTICAS
Objetivos
1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias Gram
negativo.
2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos

intermediarios o finales, debido a la acción bacteriana.
3. Realizar test comercial API 10S, para la identificación de bacterias Gram negativo.
4. Identificar el agente etiológico (Género y especie) presente en una muestraclínica.
Primera sesión práctica
Actividades
1. Observe las placas de Agar Mc Conkey sembradas y describa las colonias bacterianas.
Verifique si se trata de cultivos puros.
2. Realice una tinción de Gram a su muestra. Observe al microscopio y describa.
3. Siembra de Batería Bioquímica Convencional y sistema de identificación comercial API

10S. No olvide anotar el número de muestra.
3a. Pruebas bioquímicas convencionales
Cada grupo contará con una batería convencional compuesta por 6 tubos. Para sembrar la
batería se debe seguir las siguientes indicaciones:
a. Flamear el asa para su esterilización.
b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar Mc Conkey con la muestra a estudiar.
c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa con cuidado
y agitar. Repetir hasta una densidad igual a 0.5 Mc Farland.
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d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado como
inóculo para sembrar toda la batería.
e. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá para hacer
una comparación con el resultado final.
f. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las
paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.
Posteriormente siembre en los medios teniendo en cuenta que:

1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y en
superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por
la superficie.
2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran sólo en la
superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).
3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el medio.
4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa en punta,
pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.
3b. Siembra y Lectura de API 10 S

1. Prepare una suspensión bacteriana en 5 ml de suero fisiológico, hasta una medida de
densidad igual a 0.5 Mac Farland (estándar)
2. Con una pipeta Pasteur estéril, inocule cada una de las celdas de la galería hasta el menisco,
tal y como se muestra en la figura adjunta (línea azul). Evite la formación de burbujas en los
micropocillos, pues interfiere con sus resultados.
3. Llene la prueba CIT hasta la cúpula
4. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S, después de inocular, llene las cúpulas con aceite
mineral, para crea un ambiente microaerofílico.
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5. Coloque la galería en la cámara de incubación, a la que debe colocarle previamente agua
para crear un ambiente húmedo. Que NO quede un exceso
6. Cierre la cámara e incube 18 a 28 horas a 37°C.
4. Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, método de difusión en agar o Kirby-

Bauer
Se utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos
antimicrobianos. Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario
estandarizar algunas condiciones de laboratorio:
a) Concentración de las bacterias que se siembran: Requiere uso de estándares de turbidez:
Mac Farland 0.5
b) Medio de cultivo utilizado: Agar Mueller-Hinton
c) Concentración del antimicrobiano en el disco: varía para cada antimicrobiano.
d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en
O2 )
Una vez que se obtiene una colonia aislada (es absolutamente necesario que no exista mezcla
de bacterias), se prepara una suspensión bacteriana a una concentración conocida (1 a 2 x 108
UFC/mL) llevando a una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5.
a. Tome una tórula estéril y (¡¡sin flamearla!!) sumérjala en el caldo con el inoculo. Flamee
la boca del tubo y cierre.
b. Deslice la tórula mojada sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton. Una vez que
termine, elimine la tórula.
c. Deje secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta.
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d. Tome la pinza y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos y
distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del
borde de la placa ni demasiado cerca entre si.
e. Incube a 37ºC durante 16 hrs.
Segunda sesión práctica
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LA BATERÍA.

Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los microorganismos crezcan
y produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se “leen” y se
comparan con las Tablas de Resultados adjuntas.
Lectura Batería Bioquímica
Agar Urea
Reacción positiva: El agar se torna fucsia.
Reacción negativa: El agar no cambia de color.
Agar Citrato
Reacción positiva: Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).
Reacción negativa: El agar permanece de color verde (neutro).
Agar TSI
Utilización de glucosa: Superficie roja (pH alcalino). Se anota K
Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A
Utilización de lactosa: Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A
Reacción negativa: El tubo no varía de color. Se anota K/K.
Producción de gas: Ruptura de la columna de agar. Indica reacción positiva
Producción de H2S: Ennegrecimiento del agar. Indica reacción positiva
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Agar LIA
Decarboxilación de lisina positivo: todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K
Decarboxilación de lisina negativo: superficie morada (alcalina). Se anota como K
fondo amarillo (ácido). Se anota como A
Desaminación de lisina positivo: superficie roja. Se anota R
fondo amarillo. Se anota A
Desaminación de lisina negativo: no hay cambio. Se anota A/A
Producción de H2S: ennegrecimiento del agar. Indica reacción positiva
Medio MIO
Motilidad positiva: crecimiento bacteriano produce opalescencia del medio.
Motilidad negativa: crecimiento bacteriano limitado al pinchazo con el asa.
Presencia de indol: reacción positiva, aparición de un aro rojo en la superficie del medio, al
agregar el reactivo de Kovacs.
Presencia enzima ODC: el medio se observa de color morado, indicando reacción positiva
: el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo),
indicando reacción negativa.
Agar Corriente: reacción positiva si existe coloración de las colonias.
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Resultados más frecuentes de algunas pruebas bioquímicas para la familia Enterobacteriaceae
Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S Motilidad Indol V-P R-M Pigmento Urea
Escherichia coli AG + V + + - - - +/- + - + - -
Shigella flexneri A - V V - - - - - - - + - -
Shigella dispar - V - - - - - - - + - + - -
Salmonella typhi A - - + + - V + + - - + - -
Salmonella paratyphi A AG - - + + - - - + - - + - -
Salmonella paratyphi B AG - - + + - + + + - - + - -
Salmonella gallinarum A - - + + - + +/- - - - + - -
Citrobacter freundii AG + +/- + + - + +/- + - - + - -
Klebsiella pneumoniae AG + + + + - + - - - + - - +
Enterobacter aerogenes AG + + + + -/+ + - + - + - - -
Enterobacter hafniae AG V V + - - V - + - +/- -/+ - -
Serratia marcescens V - + + + + + - + - + -/+ + V
Serratia rubidae AV + + + - + + - +/- - + -/+ + V
Proteus vulgaris AV - + - - + V + + + - + - +
Proteus mirabilis AG - V - - + (+) + + - -/+ + - +
Pseudomonas
aeruginosa* - - - - - + + - + - - - + -
Alcaligenes faecalis* - - - - - - V - + - - - - -
* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
AG = Acido-Gas (utilización del substrato y producción de gas)

V = Variable
(+) = Positivo después de 3 ó 4 días
+/- = Generalmente positivo
-/+ = Generalmente negativo
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TABLA I
Fermentación de Glucosa Positivo

Fermentación de Lactosa Positivo
Lisina Desaminasa Negativo
Producción de H2S
Positivo Negativo
Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Positivob
Lisina Descarboxilasa
Indol
Positivo Negativo Positivo Negativo
Escherichia coli Enterobacter spp.

Salmonella Arizonaa Citrobacter freundii Klebsiella spp.
Nota : Todos producen gas de glucosa.
Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli
Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er día
a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente

b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.
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TABLA II
Fermentación de Glucosa Positivo

Fermentación de Lactosa Negativo
Lisina Desaminasa Positivo
Producción de H2S
Positiva Negativo
Lisina Descarboxilasa Negativo Lisina Descarboxilasa Negativo
Indol Indol Positivo
Citrato
Positivo Negativo
Negativo Positivo
Proteus vulgaris Proteus mirabilis
Proteus morganii Proteus rettgeri

Providencia spp.
Nota: P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato Todos producen

un poco de gas de Glucosa
Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia
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74
Interpretación API 10
Antes de realizar la interpretación del tes comercial API 10, debe agregar los siguientes
reactivos en sus correspondientes posillos:
• TDA (Triptofano-desaminasa): agregue una gota del reactivo TDA. Coloración
marrón oscura indica positivo.
• IND (Producción de indol): Agregue una gota del reactivo de James. Coloración
rosa indica positivo.
• NO2 (Producción de nitritos): Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el
tubo GLU. Espere 2 a 3 minutos. Una coloración roja indica positivo.
• Realice aparte el test de oxidasa.
• Registre todas las reacciones en la hoja de resultados que le entregará su profesor.
• Codifique el conjunto de reacciones obtenidas en un perfil numérico. Sume los
números de cada grupo si las reacciones son positivas Se obtienen 4 dígitos que
corresponden al perfil numérico. Busque el perfil numérico en el catálogo que
tendrá su profesor o en un software.
• Registre sus resultados en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe.
TEST REACCIONES POSITIVO NEGATIVO

ONPG Beta galactosidasa Amarillo Incoloro
GLU Fermentación /oxidación Amarillo,amarillo/ gris Azul, azul/verdoso
glucosa
ARA Fermentación/oxidación Amarillo Azul, azul/verdoso
arabinosa
LDC Enzima lisina Naranja Amarillo
descarboxilasa
ODC Enzima ornitina Rojo/naranja Amarillo
descarboxilasa
CIT Utilización del citrato Azul/verde, azul verde pálido/amarillo
H2S Producción de H2S Depósito/línea negra Incoloro/gris
URE Enzima ureasa Rojo/naranja Amarillo
PRÁCTICO N°4
HONGOS UNICELULARES Y FILAMENTOSOS
OBJETIVOS
1. Conocer y caracterizar la morfología macroscópica de las colonias de hongos unicelulares
(levaduras) y pluricelulares (filamentosos).
2. Conocer la morfología microscópica de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares
(filamentosos).
MARCO TEÓRICO
Los Hongos constituyen un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que se
alimentan mediante la absorción directa de nutrientes. Los alimentos se disuelven mediante enzimas que
secretan los hongos; después se absorben a través de la fina pared de la célula y se distribuyen por difusión
simple en el protoplasma.
Los hongos, junto con las bacterias heterótrofas y un reducido grupo de otros organismos
constituyen los descomponedores de la biosfera. Su actividad es esencial para el continuo funcionamiento
de la naturaleza. La descomposición libera dióxido de carbono y aporta compuestos nitrogenados y otros
minerales al suelo, en donde ellos pueden ser nuevamente utilizados por las plantas y eventualmente por
los animales. Los hongos, equipados con un poderoso arsenal de enzimas que degradan los compuestos
orgánicos, muchas veces constituyen organismos dañinos para el hombre. Atacan madera, ropa, pintura,
plumas, pelos, y de hecho casi cualquier sustancia. Pueden crecer sobre pan, fruta, vegetales, carne y otros
productos. Algunos producen toxinas altamente venenosas.
Por otra parte, muchos hongos son valiosos desde el punto de vista comercial. Por ejemplo, las
levaduras, que son útiles debido a su utilidad para producir sustancias como el etanol y el dióxido de
carbono. Otros son de interés como fuentes de antibióticos, como la penicilina, además de sus potenciales
usos como fuente de proteínas.
Adicionalmente es importante señalar su importancia en la asociación que presenta con otros
organismos. Por ejemplo, las asociaciones existentes entre los hongos y las raíces de las plantas
(micorrizas), las que juegan un rol fundamental en la nutrición y distribución de muchas especies
vegetales. Por otro lado, están los hongos patógenos, quienes constituyen la principal causa de las
enfermedades de las plantas.
Cerca de 5.000 especies de hongos atacan cultivos comerciales, además de a la mayoría de las
especies silvestres.
Aunque existe una importante discrepancia en la clasificación de este reino, generalmente se le
clasifica en tres órdenes: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Estos dos últimos son considerados
hongos superiores, mientras que el primero agrupa a los hongos inferiores. La clasificación se basa en las
diferencias en sus estructuras reproductivas. Los Zygomycota poseen zygoesporas como esporas de
reproducción sexual (cigotos con una gruesa pared celular y sin asociación a un oogonio), los Ascomycota
producen ascoesporas, dentro de una estructura especial denominada ascos. Mientras que los Basiomycota
producen basidioesporas en un basidio.
Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en Agar Dextrosa Sabouraud, es
un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras. El Agar de Dextrosa Sabouraud es una
modificación a la fórmula original del Agar de Dextrosa desarrollado por Raymand Sabouraud. Este medio
es utilizado para el cultivo de hongos patógenos, particularmente de aquellos asociados con infecciones
de piel. La alta concentración de dextrosa y la acidez del pH (5,6) hacen a este un medio selectivo para
hongos. Con la adición de cicloheximida, estreptomicina y penicilina, se obtiene un excelente medio para
el aislamiento primario de dermatofitos. Este medio es también utilizado para la determinación
microbiológica en cosméticos y para evaluar la presencia de hongos en alimentos. En este medio las
peptonas proveen la fuente de carbono y nitrógeno.
Para el crecimiento de los microorganismos, la dextrosa actúa como fuente de energía y el agares
agregado como agente solidificante. Generalmente se incuban a 25-30°C por un tiempo que depende de
la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 h aprox., hongos dermatofitos, 15-30 días).
HONGOS UNICELULARES (LEVADURAS)

Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducen asexualmente
por gemación. Normalmente prosperan en hábitats con abundante azúcar, tales como frutas,flores e incluso
la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con animales, especialmenteinsectos. Las
levaduras más importantes desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas del
género Sacharomiyces, ya que juegan un papel crucial en la preparación del pan, la cerveza,el vino, etc.
Candida spp: En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras, son parte de la
microbiota de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas de la cavidad oral, vagina,
tracto gastrointestinal y área rectal. Sin embargo, cuando se rompe la barrera mucosa, los microorganismos
pueden llegar a la sangre e invadir pulmones, bazo, riñones, hígado, corazón y cerebro. Este género se
caracteriza por un aspecto macroscópico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa
(Figura Nº 22).
Figura Nº 22: Observación microscópica de una muestra de esputo en que se ponen de manifiesto
las levaduras en yemación y las pseudohifas de las especies de Candida.
HONGOS FILAMENTOSOS:
Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son generalmente
multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con tabiques que son prolongaciones
de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus, Dermatophytos). Gran parte de este tipo de hongos se
consideran contaminantes de alimentos, sin embargo, Penicillium camemberti y Penicillium roqueforti
son ejemplos de aquellos que son utilizados en la empresa alimenticia, específicamente en la generación
de quesos especiales: el queso Camembert y el queso Roquefort.
Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium), como
patógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej. Dermatophytos).
Aspergillus spp: Los microorganismos que pertenecen a este género son extremadamente
frecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 h). En contraste con la mayoría de las
infecciones producidas por Candida, la aspergilosis se adquiere de fuentes exógenas. Estos
microorganismos se identifican por sus características morfológicas presentando colonias aterciopeladas,
algodonosas o polvorientas, coloreadas (crema, verde, café y negras). Microscópicamente presentan
hifas septadas de la que nace una prolongación no septada (conidióforo), el cual se dilata en su
extremo distal (vesículas) rodeándose allí de células conidiogénicas (fiálides). Las fiálides producen
conidios los que disponen en forma de cadenas. El conjunto vesícula, fiálide y conidios se conoce
como “cabeza aspergilar”. Ver Figura 23.
De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. Fumigatus y A. Flavus son las
que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son ubicuos en el ambiente y no forman parte
de la microbiota del ser humano, aunque pueden producirse colonizaciones transitorias. La aspergilosis
está asociada con problemas respiratorios como la dilatación crónica de la vía aérea hasta uncolapso de
un segmento pulmonar.
Figura N° 23: Estructura microscópica y macroscópica de especies de Aspergillus.
Penicillium: Estos microorganismo son ubicuos en el medio ambiente y suelen aislarse en

muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio, desarrollándose en 3-4 días. En
1929, Sir Alexander Fleming observó que una especie de Penicillium había contaminado su cultivo de
Staphylococcus aureus, matando las bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el
hongo. Esta observación casual llevó al descubrimiento de la penicilina.
P. marnefeii es la única especie patógena de Penicillium y es causa de infecciones espontáneas del
sistema retículo endotelial, afectando vasos linfáticos, pulmón, hígado, bazo y hueso
Figura N°24: Aspecto microscópico y macroscópico de Penicillium.

Hongos sifonados
Zigomicetos: Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en cuadros de

zigomicosis. Macroscópicamente presentan un micelio algodonoso. Microscópicamente, forman
hifas aseptadas y se reproducen asexualmente produciendo esporangios en los que se desarrollan
esporas (Ver figura 25). Las enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la
mucormicosis rinocerebral. Esta infección se origina en los senos paranasales y puede afectar órbita y el
paladar, extendiéndose hacia el cerebro. En pacientes inmunodeprimidos puede afectar el pulmón, el tracto
gastrointestinal y los tejidos subcutáneos.
Figura N°25: Aspecto microscópico y macroscópico de hongos sifonados.

Observación y descripción de cultivos de levadura.
Procedimientos
• Examen macroscópico: Describa, tal como lo hacía para colonias bacterianas, forma, color,
aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias. Anote lo que observe.
• Examen microscópico: Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice un frotis con la
colonia de levaduras en una gota de agua y continúe con el protocolo por usted. conocido. Observe
con inmersión y anote lo que observa.
Nota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son Gram + ni Gram -. Recuerde
que la característica de ser Gram+ o Gram- está relacionada con propiedades que pertenecen a las
membranas bacterianas.
Observación, y descripción de hongos filamentosos.
Procedimientos
• Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta, lanosa) en
anverso y reverso. Anote lo que observe.
• Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.
Examen al Fresco:
a. Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto.
b. Flamee un asa en punta, enfríe cerca del mechero y obtenga un pequeño trozo del hongo (sin sacar
agar). DEBE USAR MASCARILLA.
c. Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un cubreobjeto.
d. Observe con aumento de 40X (sin inmersión, ni aplastando la muestra).
e. Reconozca las estructuras microscópicas reproductivas de cada especie y dibuje.
Recuerde: el principal criterio para la identificación de estos microorganismos es el morfológico, por lo

tanto, es importante que trabaje con cuidado.
PRÁCTICO N°5
TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA
OBJETIVOS
1. Determinación del título de lisados de bacteriófagos a través de la cuantificación de placas de
lisis con la técnica del agar blando.
2. Utilizar la transducción generalizada mediada por el fago P22 como herramienta para la
transferencia de material genético entre distintas cepas bacterianas de la misma especie.
MARCO TEÓRICO
Algunos Bacteriófagos (virus que infectan bacterias) son capaces de movilizar genes bacterianos
desde una célula a otra por un proceso denominado transducción. La transducción, junto con la
conjugación y la transformación son mecanismos de transferencia lateral que originan variabilidad en las
poblaciones bacterianas. Estos mecanismos pueden ser explotados por los investigadores como
herramientas en genética bacteriana para transferir genes desde una bacteria a otra.
¿Cómo se producen los bacteriófagos transductores? En 1965, K. Ikeda y J. Tomizawa
comenzaron a responder esta pregunta con la ayuda de algunos experimentos con el fago temperado P1
de E.coli. Ellos encontraron que, cuando una bacteria dadora es lisada por P1, el cromosoma bacteriano
se rompe en muchos pequeños fragmentos. Ocasionalmente, los fagos en formación incorporan
erróneamente trozos del DNA bacteriano en la cabeza del fago. Este evento da origen a una partícula
transductora.
Entonces, hay que tener en cuenta que:

• Fago= cápside viral + DNA de fago
• Partícula transductora = cápside viral + DNA bacteriano
• Bacteria transductante = bacteria que incorporó el DNA de una partícula transductora.
Debido a que la cápside del fago es lo que determina la habilidad para reconocer y atacar a las
células bacterianas, las partículas transductoras pueden adherirse e inyectar el contenido de DNA de la
bacteria dadora. Cuando la partícula transductora inyecta su contenido en una célula receptora, se crea la
situación de merodiploide, en la cual los genes transducidos pueden ser incorporados al genoma de la
bacteria receptora mediante recombinación (Fig. 26).
Se diferencian dos tipos de transducción dependientes del mecanismo y exigencias de encapsidación del
DNA en el fago y de si existen sitios de integración como profago:
1. Especializada, solo se transfiere una región particular del genoma dador que involucra el sitio de
integración del profago (ej: λ)
2. Generalizada, la transferencia es al azar de cualquier fragmento del genoma dador e involucra la
capacidad de los fagos de encapsidar DNA inespecíficamente (ej.: T4, P1, P22)
El fago P22
P22 es un bacteriófago temperado que infecta a bacterias del género Salmonella. P22 presenta una
cápside icosahédrica que protege al genoma compuesto por DNA de doble hebra, y una cola corta que
reconoce al antígeno O del lipopolisacárido ubicado en la membrana externa bacteriana.
Figura N° 26: Mecanismo de transducción generalizado
En realidad, solo una minoría de la progenie del fago (1 en 10.000) son partículas transductantes.
En el caso de la transducción, ésta es mediada es por un bacteriófago que actúa como vehículo del DN
bacteriano. Mediante la infección de la cepa dadora con el fago, el DNA de la bacteria es encapsidado en
las partículas de fago durante el crecimiento lítico del mismo. El lisado así generado se usa para infectar
a la cepa receptora. En el citoplasma receptor se generará el fenómeno de recombinación entre el
fragmento de DN dador entrante y su homólogo cromosómico para reproducir un transductante
recombinante estable. Los transductantes se seleccionan utilizando el medio cultivo apropiado para el
marcador genético que se está estudiando.
Después de adherirse a la bacteria, el DNA del fago se transloca a través de la membrana hasta
alcanzar el citoplasma. Una vez en el citoplasma del hospedero, el genoma de P22 se circulariza e inicia
ciclos de replicación de tipo theta. Durante este período, se transcriben las proteínas de la cabeza y de la
cola a partir de los genes del fago. Después de que varias copias del genoma del fago han sido producidas,
P22 cambia su estrategia de replicación a circulo rodante. La replicación mediante circulo rodante produce
largos concatémeros de DNA de doble hebra constituidos por múltiples copias del genoma del fago unidas
entre sí. Estos concatemos son empacados en las cabezas vacías mediante el mecanismo de cabeza llena.
El empaquetamiento del DNA es iniciado en una secuencia especifica denominada pac y continua hasta
incorporar los 44 kpb que son suficientes para llenas la cápside de P22. Cuando la cabeza del fago está
llena, actúa una endonucleasa, la que corta el DNA que está siendo empacado. Puesto que el genoma de
P22 solo está constituido por 42kpb, los términos de este presentan repetidos directos de 850 pb a 2350
pb (redundancia terminal), los cuales son empleados para circularizar el genoma de un nuevo ciclo
infectivo.
Transducción:
Sesion 1:
1) Preparar placas agar nutriente (LB) con y sin antibióticos
Sesion 2:
2) Mezclar las bacterias y bacteriófagos según la siguiente tabla
3) Incubar 1 hora a 37º C
4) Sembrar 100 uL de cada mezcla fago-bacteria
5) Cuente las colonias obtenidas en cada placa
6) Discuta el resultado

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