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    Reacción en Cadena de La Polimerasa (PCR)

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    alejandra.pmc15
    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN mediante la amplificación enzimática usando la enzima Taq polimerasa. La PCR consiste en ciclos repetidos de desnaturalización del ADN, alineamiento de los cebadores y extensión mediante la polimerasa. Esto permite amplificar millones de copias de una secuencia de ADN específica a partir de una pequeña cantidad de molde. La PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en biolog

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    Reacción en Cadena de La Polimerasa (PCR)

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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN mediante la amplificación enzimática usando la enzima Taq polimerasa. La PCR consiste en ciclos repetidos de desnaturalización del ADN, alineamiento de los cebadores y extensión mediante la polimerasa. Esto permite amplificar millones de copias de una secuencia de ADN específica a partir de una pequeña cantidad de molde. La PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en biolog

    Descripción original:

    Fundamento de la PCR

    Título original

    PCR

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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN mediante la amplificación enzimática usando la enzima Taq polimerasa. La PCR consiste en ciclos repetidos de desnaturalización del ADN, alineamiento de los cebadores y extensión mediante la polimerasa. Esto permite amplificar millones de copias de una secuencia de ADN específica a partir de una pequeña cantidad de molde. La PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en biolog

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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN mediante la amplificación enzimática usando la enzima Taq polimerasa. La PCR consiste en ciclos repetidos de desnaturalización del ADN, alineamiento de los cebadores y extensión mediante la polimerasa. Esto permite amplificar millones de copias de una secuencia de ADN específica a partir de una pequeña cantidad de molde. La PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en biolog

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    Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

    Introducción

    La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que permite obtener múltiples


    copias de una molécula de DNA mediante la amplificación enzimática de una secuencia de
    DNA templado. La secuencia por amplificar es delimitada por una pareja de
    oligonucleótidos que hibridan con cada una de las cadenas de polinucleótidos de la doble
    hélice.

    La amplificación generalmente se lleva a cabo empleando la enzima DNA polimerasa I


    (Taq) de Thermus aquaticus. Este organismo habita aguas termales y la mayoría de sus
    enzimas son termoestables (resistentes a desnaturalización por calor).

    Una reacción de PCR contiene el DNA blanco, una pareja de oligonucleótidos,


    desoxinucleótidos trifosfato, cloruro de magnesio, Buffer [Tris-HCl (pH 8.4) y KCl] y la Taq
    DNA polimerasa. La reacción comienza al calentar la mezcla de reacción a 94°C, a esta
    temperatura los puentes de hidrógeno que mantienen unidas a las dos cadenas de
    polinucleótidos de la doble hélice se rompen, desnaturalizando al DNA en moléculas de
    cadena sencilla. Posteriormente, se baja la temperatura a 50-60°C, lo cual permite una
    cierta re-naturalización de las hebras de DNA y del apareamiento de los oligonucleótidos
    con su secuencia complementaria. La síntesis de DNA se lleva a cabo a 72°C. El ciclo de
    desnaturalización-alineamiento-extensión se repite aproximadamente 30 ciclos,
    obteniendo microgramos de un producto de PCR a partir de unos cuantos nanogramos de
    DNA templado.

    La temperatura de alineamiento empleada es de suma importancia ya que esta afecta la


    especificidad de la reacción. La hibridación DNA-DNA es dependiente de la temperatura. Si
    la temperatura es muy alta, no ocurre hibridación y si es muy baja puede haber
    apareamientos incorrectos, permitiendo que los oligonucleótidos se unan a más de un
    sitio y se amplifiquen otras regiones no deseadas.

    La temperatura de alineamiento ideal debe que permitir la hibridación del oligonucleótido


    y su templado, y evitar la formación de híbridos inespecíficos. Esta temperatura se puede
    estimar al determinar la Tm ó “melting temperature” del hibrido oligonucleótido-
    templado. La Tm es la temperatura a la cual un hibrido apareado correctamente se
    disocia. Una temperatura 1 a 2°C debajo de la Tm es lo suficientemente baja como para
    permitir la formación correcta de un hibrido oligonucleótido-templado, pero lo
    suficientemente alta como para evitar que híbridos con algún apareamiento incorrecto
    sean estables. La Tm puede ser determinada con la siguiente formula:

    Tm = (4 [G + C]) + (2 [A + T]) °C
    Donde [G + C] es el número de nucleótidos de guanina y citosina presentes en el
    oligonucleótido, y [A + T] el número de nucleótidos de adenina y timina. La temperatura
    de alineamiento empleada para una reacción de PCR se obtiene al calcular la Tm de cada
    oligonucleótido y experimentalmente se emplea una temperatura de 1 a 2°C por debajo la
    Tm.

    El primer paso crítico es la selección del ácido nucleico a partir del cual se amplificará la
    secuencia de interés; a este ácido nucleico suele llamarse molde o templado. Por lo
    general, la PCR está diseñada para permitir la amplificación selectiva de una secuencia
    específica de ADN blanco dentro de un conjunto heterogéneo de secuencias. El siguiente
    punto que considerar es la selección de primers, pues para amplificar selectivamente una
    secuencia de ADN, es necesaria cierta información previa de esa secuencia blanco para
    diseñar dos primers de unos 18 a 25 nucleótidos de largo, que son específicos
    complementarios a las secuencias que flanquean a la secuencia blanco. Para reducir la
    posibilidad de que los primers se enlacen en otros sitios del ADN que no sean los
    deseados, es necesario tomar en cuenta varias consideraciones en su diseño:

    • Composición de bases. El contenido de GC debe ser de 40 a 60% con una


    distribución uniforme de los 4 nucleótidos A, T, C y G.
    • Temperatura de fusión (Tm). Los valores de Tm calculados para los dos primers
    usados juntos no debe variar en más de 5 °C.
    • Secuencias terminales 3’. No deben ser secuencias complementarias a alguna
    región del otro primer utilizado en la misma reacción.
    • Secuencias auto complementarias. Deben evitarse repeticiones invertidas o
    cualquier secuencia auto complementaria de más de 3 pb de largo.

    La PCR estándar consiste en una serie de ciclos de 3 reacciones sucesivas:

    1. Desnaturalización. Se ajusta a una temperatura de 93 a 95 °C para el ADN


    genómico.
    2. Alineamiento (annealing). A temperatura variable (entre 45 a 65 °C) de acuerdo
    con la Tm de los primers (por lo regular la temperatura de alineamiento se ajusta a
    5 °C menos respecto a la Tm calculada). En esta fase los dos primers se hibridan
    con sus respectivas secuencias complementarias en el molde.
    3. Síntesis o polimerización. De manera característica alrededor de 70 a 75 °C
    (temperatura óptima a la cual trabaja la enzima). La ADN polimerasa empleada es
    termoestable, por lo que no se afecta por los pasos de desnaturalización.

    Las cadenas recién sintetizadas pueden servir a su vez como moldes para la síntesis del
    nuevo ADN, lo que da lugar a una reacción en cadena con un incremento exponencial del
    producto. Una desventaja evidente de la PCR es el tamaño limitado de los productos de la
    amplificación: es cada vez más difícil obtener una amplificación eficiente a medida que
    aumenta la longitud del producto deseado. Sin embargo, recientemente se comercializan
    ADN polimerasas capaces de amplificar fragmentos de hasta 30 kb.

    La PCR tuvo gran impacto en 4 áreas principales de la Biología Molecular: el mapeo de


    genes, la clonación, la secuenciación de ADN y la detección de genes. La PCR es ahora
    utilizada como una herramienta de diagnóstico médico de enfermedades infecciosas o
    para detectar mutaciones específicas que pueden causar enfermedades genéticas, en las
    investigaciones criminales para identificar a los sospechosos a nivel molecular, en pruebas
    de paternidad y en la secuenciación del genoma humano, por mencionar algunos usos.

    Referencias

    • Brown T. A. Gene Cloning & DNA Analysis. 6th Edition. Wiley-Blackwell


    • Sambrook, J. y Russel, D. (2001). Molecular Cloning. A Laboratory Manual (3 Ed).
    New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

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