Dr. Marcos M.

Kaplan

METODOS OPTICOS DE ANALISIS

Los métodos ópticos de análisis estudian la interacción entre la radiación

electromagnética y la materia. Estos métodos tienen como objeto la determinación de la
radiación que es emitida, absorbida o transmitida al interactuar con la materia, o bien la
radiación que es reflejada, refractada, difractada, polarizada o dispersada cuando ocurre
dicha interacción.
Los métodos ópticos se clasifican de acuerdo a la interacción en métodos
espectroscópicos y en métodos no espectroscópicos. Dentro de los métodos
espectroscópicos existen los métodos de emisión y los de absorción.

Radiación electromagnética
La radiación electromagnética es una clase de energía que se transmite por el espacio a muy
altas velocidades. Adopta muchas formas pero las más fácilmente reconocidas son el calor
y la luz.
La radiación electromagnética tiene carácter ondulatorio, con un componente eléctrico y
uno magnético que se encuentran en forma normal (90 ° uno respecto del otro) (figura 1).

Figura 1

La radiación electromagnética utiliza parámetros como longitud de onda (λ),

amplitud (A), frecuencia (ν) y velocidad (Figura 2)

Figura 2
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También puede describirse utilizando un modelo corpuscular, es decir considerando

que es un flujo de partículas discretas o paquetes ondulatorios de energía llamados fotones.
La energía de un fotón es proporcional a la frecuencia de la radiación:

Espectro Electromagnético
Abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y de frecuencias como se puede
observar en las figuras 3y 4.

Figura 3

Figura 4

Obsérvese que la porción del espectro visible, percibida por el ojo humano, es muy
pequeña con respecto a todo el espectro electromagnético
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Algunas consideraciones respecto al color

Los cuerpos luminosos, como el Sol o una lámpara, emiten radiaciones en un
amplio espectro que comprende muchas longitudes de onda. Aquellas longitudes de onda
que están comprendidas entre unos 400 y 700 nm son capaces de afectar la retina del ojo
humano y con ello dar origen a las impresiones subjetivas de la visión.
Cuando incide radiación electromagnética visible sobre la materia puede ser absorbida total o
parcialmente:
 si la absorción es total, el objeto aparece de color negro,
 si se reflejan todas las radiaciones, de color blanco.
Nosotros percibimos los objetos por medio de la luz emitida o reflejada, de forma que cuando
la luz blanca (conteniendo todas las longitudes de onda) pasa a través de un medio que es
transparente a ciertas longitudes de onda, pero que absorbe otras, para el observador ese medio
aparece coloreado. Debido a que solo las radiaciones no absorbidas llegan al ojo, sus longitudes
de onda indican el color del medio. Se dice que este color es complementario al color que se
percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar, debido a que la luz emitida y absorbida, juntas,
forman la luz blanca original.
En la tabla 1 se indican los valores que corresponden a determinadas zonas del espectro visible.

Tabla 1. Colores del espectro visible

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ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION UV-VIS

INTRODUCCION

Fundamentos Teóricos
Los métodos en los que se determina la fracción de radiación absorbida por el
componente en estudio o a determinar, se denominan absorciométricos. Dentro de estos
métodos se encuentra la espectrofotometría de absorción en las zonas ultravioleta y visible
del espectro electromagnético (Región UV: 200-400 nm; Región Visible: 400-800 nm).
La espectrofotometría de absorción en las regiones ultravioleta y visible del espectro
electromagnético es, posiblemente, la más utilizada en la práctica del análisis cuantitativo
de todas las técnicas espectroscópicas. Además, puede resultar de utilidad como técnica
auxiliar para la determinación de estructuras de especies químicas.
Se basa en la absorción de radiación ultravioleta y visible por el analito, como
consecuencia de lo cual se origina un estado activado que posteriormente elimina su exceso
de energía en forma de calor, en un proceso que esquemáticamente puede representarse así:

X + hυ —> X* —> X + calor

La cantidad de calor disipado es muy pequeño, por lo que el método tiene la ventaja
de originar un trastorno mínimo en el sistema que se estudia.

ABSORCION DE RADIACION
La absorción UV-VIS está estrechamente relacionada con el tipo de enlaces
presentes en una molécula. Está restringida a un número limitado de grupos funcionales
llamados cromóforos.
Cuando una molécula absorbe un fotón, se incrementa su energía, pasando a un estado
excitado.
La absorción de radiación ultravioleta y visible origina transiciones entre distintos
niveles de energía electrónicos, así como simultáneamente transiciones vibracionales y
rotacionales, de forma que el cambio en la energía molecular de una determinada especie
como consecuencia de la absorción de energía radiante puede representarse así:

ΔE = ΔEelectrónica + ΔEvibracional + ΔErotacional + ΔEtraslacional

De todos los términos que figuran en la expresión anterior, el más importante es

ΔEelectrónica, pues la diferencia de energía entre dos estados vibracionales es unas 10
veces menos, y ΔErotacional es, a su vez, entre 10 y 100 veces menor que ΔEvibracional.
Por otro lado, el último término es tan pequeño que prácticamente puede prescindirse de su
influencia.
Debido a lo anteriormente expuesto, suele ser de utilidad clasificar las especies
absorbentes en base al tipo de transiciones electrónicas que pueden tener lugar. Asimismo, esto
permite correlacionar el comportamiento espectral de una determinada especie con sus
características químicas, lo cual es importante en orden a determinar estructuras moleculares y
para la identificación de ciertos grupos funcionales.
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Tipos de transiciones electrónicas

Las moléculas orgánicas, y una gran cantidad de aniones inorgánicos, contienen
electrones en orbitales moleculares σ y π, así como en orbitales no enlazantes, n, por lo que
cuando estas especies absorben fotones de contenido energético adecuado se pueden producir
transiciones a los correspondientes orbitales moleculares antienlazantes, σ* y π*, tal como se
indica en la figura 5, donde se muestra la estructura de Lewis para una molécula orgánica
sencilla y las transiciones electrónicas correspondientes.

Figura 5. Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares.

Como se representa en la figura 3.6., pueden tener lugar cuatro tipos de transiciones:
σ—>σ*, π—>π*, n—>σ* y n—>π*. Asimismo, también pueden producirse transiciones
denominadas de transferencia de carga y de campo ligando. Seguidamente se
comentarán algunas peculiaridades de cada una de las transiciones mencionadas.
Transiciones σ—>σ*. Estas transiciones entre orbitales moleculares sigma enlazantes y
antienlazantes implican energías relativamente grandes (ver fig. 3.6.), de forma que las
bandas de absorción se observan en el ultravioleta lejano, a longitudes de onda inferiores a
200 nm (Figura 6). En los hidrocarburos saturados, en los que solamente hay enlaces
sencillos C–H se producen estas transiciones; así el metano presenta máximos de absorción
a 125 nm y el etano a 135 nm.
Transiciones n—>σ*. Las especies químicas saturadas que contengan átomos con pares
electrónicos en orbitales no enlazantes pueden dar lugar a que se produzcan transiciones n—
>σ*. Esto sucede, por ejemplo, en compuestos saturados conteniendo heteroátomos de oxígeno,
azufre y halógenos. Estas transiciones requieren bastante energía, si bien en menor grado que
las σ—>σ*, por lo que las bandas correspondientes se presentan fundamentalmente en el
ultravioleta lejano. Por otra parte, las intensidades de las absorciones asociadas con estas
bandas suelen ser de pequeña magnitud.

Figura 6. Bandas de absorción originadas por diferentes transiciones electrónicas.

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Transiciones n—>π* y π—>π*. Estas transiciones se consideran juntas debido a que

muchos grupos químicos contienen electrones en orbitales π y no enlazantes. Como se
aprecia en la Figura 3.6., las transiciones π—>π* requieren la absorción de una cantidad de
energía relativamente grande, por lo que suelen aparecer en el ultravioleta lejano, mientras
que las n—>π* necesitan menor cantidad de energía, como consecuencia de lo cual se
originan bandas en las zonas ultravioleta próximo y visible.
En lo que respecta a la intensidad de la absorción, las absortividades molares de los picos
asociados a las transiciones n—>π* son generalmente bajos, mientras que los
correspondientes a los π—>π* son considerablemente mayores. De cualquier forma, el
comportamiento mencionado puede alterarse, como se verá posteriormente, por la presencia
de determinadas agrupaciones atómicas, o por el tipo de disolvente.
Para que tengan lugar las transiciones consideradas en este apartado, es evidente que la especie
química tendrá que contener algún grupo funcional con enlaces π, esto es, la estructura
molecular deberá presentar centros absorbentes no saturados. A estos grupos de átomos
responsables de la absorción en las regiones ultravioleta y visible se les denomina grupos
En la tabla 3.1. se muestran algunos grupos cromóforos y las transiciones implicadas en
espectrofotometría ultravioleta-visible.

Tabla 2 Grupos cromóforos y transiciones electrónicas

LEYES DE LA ABSORCION DE RADIACION

Consideremos un haz de radiación paralela que atraviesa una capa de solución de
una especie absorbente de concentración c y de espesor b (figura 6)

Figura 6
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A causa de la interacción entre los fotones y las partículas absorbentes la intensidad

de radiación se atenúa de I0 a I.
Por tanto se puede definir la Transmitancia (T) como la fracción de radiación
incidente/transmitida por la solución:

T = It / Io (1)

La absorbancia (A) se define como:

A = - log T = - log (It / Io) = log 1/T (2)

La absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor es la atenuación de la luz.

Consideremos ahora una porción infinitesimal (db)
Lambert en 1760 estableció que la intensidad de radiación transmitida, disminuye
con el incremento de la longitud del camino óptico según:

-d I = k' I dx

Donde I representa la intensidad de la radiación en un punto cualquiera x del medio

absorbente y donde k' es una constante que depende fundamentalmente de la temperatura,
naturaleza del medio y de la longitud de onda de la radiación. Reordenando e integrando la
expresión anterior se tiene: (entre los límites de Io e It, 0 y b)
It b
- d I = k’ dx   d ln I  k'  dx
;
I Io o

-ln ( It / I0) = k’ b que reordenada nos queda: It = Io e– k’b

(3)

La última expresión (I) conocida como ley de Lambert, establece que la intensidad
de la luz transmitida a través de un medio homogéneo disminuye exponencialmente,
cuando la longitud del camino óptico aumenta aritméticamente. Esto equivale que
espesores iguales de un mismo medio absorben la misma fracción de radiación incidente.
’
En forma análoga Beer, en 1852, estableció que la intensidad de la radiación
transmitida disminuye con el incremento de la concentración del componente en solución,
según la siguiente expresión:
- d I = k'' I dc
que reordenada e integrada entre límites conduce a:

It = Io e– k’’c (4)

donde c es la concentración y k” es directamente proporcional a b y depende también de la

longitud de onda y en menor medida de la temperatura.
Esta expresión es conocida como ley de Beer y expresa lo mismo que ( I ) pero con
respecto a la concentración del componente interpuesto en le camino del haz.
Si se considera ambas variables, b y c, en forma simultánea, se tendrá:
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It = Io e– k’’’b c (5)

Esta es la expresión de la ley de Lamber-Beer que es la Ley Fundamental de la

Absorciometría.
Otras formas más frecuentes usadas de la misma son:

It = Io 10– a b c (6)
Teniendo en cuenta la ecuación (1) y reemplazando en la ecuación anterior nos
quedará: T = 10– a b c
tomando logaritmo y multiplicando ambos miembros por (-1) se tiene: A= a b c (7)

donde a se denomina absortividad y es igual a : k’’’/ 2,303.

De acuerdo con la ecuación ( VI ) entre A y c media una relación lineal. Cuando c
está expresada en mol / L y el camino óptico en cm, a, es la absortividad molar o
coeficiente de extinción molar. Esta magnitud también se expresa frecuentemente con  y el
camino óptico con L, por lo que la ley de Lambert- Beer puede escribirse:

A=lc
Cuando la escala del equipo viene expresada en porcentaje de transmitancia ( % ) =
( Tx100 ), la ecuación ( 7 ) toma la forma A = 2 – log %T.
La ley de Lambert es exacta y es aplicable a cualquier medio absorbente (gas,
líquido, solución o sólido homogéneo).
En la práctica, para medir la absorbancio o transmitacia, la solución en estudio debe
estar contenida en alguna clase de recipiente transparente o cubeta. En la misma se
producen fenómenos de reflexión en las dos interfaces aire / solución como así también en

Figura 7

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las dos interfaces pared / solución. Además, la atenuación del haz de radiación puede
producirse por dispersión a moléculas grandes y a veces por absorción en las paredes del
recipiente (figura 7). Para compensar estos efectos, la intensidad del haz transmitido por la
solución del compuesto adsorbente se suele comparar con la intensidad del haz transmitido
por una cubeta idéntica que solo contiene el disolvente de la solución (blanco).
En cuanto a la ley de Beer, es frecuente que por alteraciones en los instrumentos o sistemas
químicos en estudio se presenten algunas desviaciones aparentes de la misma.

Desviaciones de la ley de Beer

La ley de Beer solo describe el comportamiento de la absorción en soluciones
diluidas; en este sentido, es una ley límite. La proporcionalidad entre la absorbancia y la
concentración únicamente se cumple para disoluciones muy diluidas, observándose
desviaciones más o menos acusadas al aumentar la concentración
Las desviaciones de la ley de Beer pueden clasificarse de la forma siguiente:

Desviaciones reales
En la deducción de la ley de Beer que se hizo anteriormente, no se ha considerado
que la absortividad depende del índice de refracción, n, según la expresión:

Como, a su vez, el índice de refracción varía con la concentración, la absortividad no es

rigurosamente constante para cualquier concentración, provocando desviaciones negativas. De
todas formas, en la práctica, para concentraciones inferiores a 10–3 M puede prescindirse de la
influencia de este factor, al ser el índice de refracción esencialmente constante.

Desviaciones instrumentales
Las fluctuaciones producidas en la corriente eléctrica, la inestabilidad de algunas
fuentes de radiación o la respuesta no lineal del detector pueden originar el funcionamiento

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incorrecto de un determinado instrumento. Además de éstos, pueden considerarse los

siguientes factores de tipo instrumental como causas de desviaciones de la ley de Beer:

a) Uso de radiación no monocromática.

El cumplimiento estricto de la ley de Beer solo se cumple para una radiación
verdaderamente monocromática, lo cual, en sentido estricto, nunca se cumple, pues en la
práctica, todos los dispositivos seleccionan una banda más o menos ancha en torno a una
determinada longitud de onda.
La siguiente deducción muestra el efecto de la radiación policromática sobre la ley de Beer:
Considérese un haz formado por las longitudes de onda λ1 y λ2 (banda M en la figura 8a.).

Figura 8 Influencia de la radiación policromática sobre la ley de Beer.

Aplicando la ley de Beer a cada una de ellas, se tiene:

Cuando este haz constituido por las dos radiaciones atraviesa una disolución conteniendo
especies absorbentes, la potencia del haz emergente es P1+P2, mientras que la del haz incidente
sobre la muestra es P01 + P02. Según esto, la absorbancia medida será:

AM = log (P01 + P02) – log (P01 10–ε1 b C + P02 10– ε2b C)

En el caso particular de que ε1 = ε2 la ecuación anterior se simplifica, reduciéndose a

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AM = ε1 b C
que es la ley de Beer. Sin embargo, cuando ε1 es distinto de ε2, la relación entre AM y la
concentración deja de ser lineal. Evidentemente, cuanto mayor sea la diferencia entre ε1 y
ε2, mayores serán las desviaciones de la linealidad. Por eso mismo, aún cuando el ancho de
banda sea relativamente grande, si las diferencias en los valores de la absortividad son
pequeños, la utilización de un haz policromático no implica diferencias significativas
respecto a uno monocromático (ver Fig. 8 a., banda N).

b) Presencia de radiación parásita

El haz de radiación que sale de un monocromador suele estar contaminado con pequeñas
cantidades de radiación parásita o dispersada originada por reflexión de los distintos
componentes ópticos, dispersión por partículas de polvo atmosférico, etc. Por otra parte, la
propia muestra puede originar dispersiones.

Con frecuencia, la radiación dispersada tiene una longitud de onda diferente respecto a la
radiación principal, pudiendo, además, en ocasiones, llegar al detector sin haber atravesado la
muestra. Por todo ello, la absorbancia medida en presencia de radiación parásita es:

donde Ps es la potencia del haz dispersado. Al aumentar la concentración de sustancias

absorbentes, disminuye P, con lo que este término puede ser lo suficientemente pequeño
respecto a Ps como para que la expresión anterior se transforme en:

lo cual indica la presencia de desviaciones negativas en la ley de Beer debido a este factor
(Figura 9).

Figura 9

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c) Errores de lectura
Los errores indeterminados en la lectura de la transmitancia o absorbancia son errores que
potencialmente siempre están presentes y es necesario tenerlos en cuenta. En ocasiones,
pequeños errores en la lectura de la transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar
errores grandes en la concentración cuando se opera en los extremos de la escala. Esto se
ilustra en la figura 3.4. En 1, figura 3.4., el error absoluto cometido en la determinación de
la concentración, para un cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al ser
pequeña la concentración, el error relativo puede ser grande. En 3, la incertidumbre en la
determinación de la concentración es alta, y en 2, hacia la mitad de la escala, parece que se
trata de la situación más favorable.
Puede demostrarse, como se indica a continuación, que el mínimo error relativo se
obtiene para una absorbancia de 0.434.
La primera derivada de la ley de Beer es:

donde dT representa el error indeterminado en la lectura de la escala de transmitancia y dC

indica la incertidumbre en la concentración. Como log e = 0.434 y ε b = – log T/C, se
obtiene,

Derivando esta ecuación de nuevo e igualando a cero, se obtiene que la transmitancia

óptima corresponde a 36.8 %, que equivale a una absorbancia de 0.434 (figura 10).

Figura 10. Error fotométrico vs. Transmitancia para una solución de KMnO4. Incertidumbre en la
transmitancia ± 0,01

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DESVIACIONES QUIMICAS
Se incluyen en este apartado toda una serie de desviaciones aparentes de la ley de
Beer producidas como consecuencia de procesos químicos en los que participan las
especies absorbentes.
a) Influencia del equilibrio
Cuando la sustancia problema interviene o forma parte de un sistema en equilibrio con
otras especies, el desplazamiento del equilibrio implica una modificación en la
concentración, y, en consecuencia, en la absorbancia. Algunas situaciones que pueden
producirse son las siguientes:
Dimerizaciones. Cuando una disolución de dicromato potásico no tamponada se diluye,
ocurre una transformación parcial en cromato, como consecuencia del equilibrio dímero-
monómero:
Cr2O72– + H2O 2 CrO42– + 2 H+
(λmax = 350, 450 nm) (λmax = 372 nm)
Acido–base. En la figura 3.5. se muestran los espectros de absorción de un
indicador ácido-baseEs evidente que cuando las especies absorbentes están implicadas en
un equilibrio ácido-base, la ley de Beer no se cumple, al menos que el pH o la fuerza iónica
sean constante
Complejos. Cuando se mide la absorbancia de un complejo, por ejemplo
Fe(SCN)63–, para que se cumpla la ley de Beer hay que mantener constante la
concentración de ligando libre, lo cual se consigue frecuentemente operando en gran exceso
de ligando respecto al metal.
b) Influencia del disolvente
Como consecuencia de las interacciones soluto–disolvente se originan con frecuencia
desplazamientos espectrales, ensanchamientos de bandas y otros fenómenos que pueden
provocar desviaciones en la ley de Beer. En este sentido, no es posible hacer predicciones de
forma general. Unicamente mencionar algunos términos relacionados con los desplazamientos
espectrales: desplazamiento batocrómico o desplazamiento hacia el rojo, consiste en un
desplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda mayores (este efecto suele
producirse en disolventes de alta constante dieléctrica). Desplazamiento hipsocrómico o
desplazamiento hacia el azul, es el desplazamiento hacia longitudes de onda más cortas.
c) Influencia de la temperatura
La temperatura puede influir modificando el equilibrio químico de algunos sistemas, así como,
en ocasiones, dar lugar a desplazamientos batocrómicos. De todas formas, la temperatura no
suele ser un factor a considerar en la mayor parte de los sistemas absorbentes sencillos.
d) Presencia de impurezas en los reactivos
Muchos métodos espectrofotométricos son lo suficientemente sensibles como para detectar
cantidades a nivel de trazas, por lo que la presencia de impurezas absorbentes en los mismos
reactivos puede originar errores considerables. Debido a ello, en la práctica analítica ordinaria,
las medidas espectrofotométricas se llevan a cabo frente a un blanco constituido por la propia
célula, el disolvente y los reactivos. En este sentido interesa que la absorbancia del blanco sea
pequeña, pues si es grande, un pequeño error en su medida puede implicar un gran error
relativo en el resultado final.
e) Interacciones entre especies absorbentes
Cuando en una disolución existen varias especies absorbentes, la ley de Beer se cumple para
cada una de ellas, si todas actúan independientemente. Sin embargo, la interacción entre ellas

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puede producir alteraciones en la distribución de cargas, como consecuencia de lo cual puede

modificarse la energía requerida para la absorción y, en consecuencia, variaciones en la
posición, forma y altura de las bandas de absorción. Por otra parte, estas alteraciones en la
distribución de cargas también pueden ser originadas por la presencia de sales inertes, con el
consiguiente aumento de la fuerza iónica de la disolución.

ERRORES PERSONALES
En este sentido, los mayores errores suelen cometerse por el uso inadecuado de las
cubetas de absorción. Resultan de utilidad las recomendaciones siguientes:
 Es necesario asegurarse de que las cubetas están perfectamente limpias, no rayadas
y exentas de huellas o adherencias en las paredes por las que ha de pasar la
radiación.
 Las cubetas de vidrio y cuarzo pueden limpiarse con ácido nítrico o con agua regia
en frío, pero no con mezcla crómica.
 Una vez limpias, las cubetas deben enjuagarse con agua destilada y con varias
porciones de la disolución a medir.
 No deben secarse interiormente, mientras que el exterior debe secarse con papel
suave, comprobando, además, que, una vez llena con la disolución problema, no
contiene burbujas de aire.
 Aunque se debe trabajar con cubetas idénticas para la muestra y la referencia
(blanco), es buena práctica utilizar siempre la misma disolución en cada una de
ellas.

INSTRUMENTACION
El instrumento que normalmente se utiliza para medir la transmitancia o la absorbancia de
una muestra en función de la longitud de onda es el espectrofotómetro.
Espectrofotómetro
Los componentes básicos de un espectrofotómetro son: (Fig. 11)

Figura 11. Esquema de un espectrofotómetro

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1. Fuente de radiación: lámpara de W, H2 ó Deuterio.

2. Control de intensidad: iris ó diafragma.
3. Control de longitud de onda: prisma o red de difracción, que seleccione una banda estrecha de
longitudes de onda
4. Ranura variable.
5. Receptáculo para la muestra o referencia: celda de vidrio o cuarzo, recipiente que contenga la
muestra
6. Fotodetector: fotocelda o fototubo.
7. Instrumento de medida: galvanómetro, potenciómetro, etc.

Figura 12. Fotografía de un espetrofotómetro UV-Vis

Fuentes de radiación
Las fuentes de radiación utilizadas en espectrofotometría ultravioleta y visible deben ser:
 continuas en una amplia zona del espectro,
 intensidad elevada
 ser esencialmente constante con la longitud de onda.

En la zona visible, la fuente más utilizada es la

lámpara de filamento de volframio, la
distribución de la energía depende de la
temperatura del filamento, la cual depende, a su
vez, del voltaje. En condiciones ordinarias de
operación, esta lámpara resulta útil entre unos
350 nm y unos 3000 nm. (figura 33) Por debajo
de 350 nm, zona del ultravioleta, la potencia de una
lámpara de volframio es inadecuada, debiéndose
emplear una fuente diferente.
La más común es una lámpara de descarga de hidrógeno, o de deuterio. Cuando se
produce una descarga eléctrica entre dos electrodos en el seno de un gas, como hidrógeno, las
colisiones entre los electrones de la descarga y las moléculas gaseosas provocan la excitación
electrónica, vibracional y rotacional de dichas moléculas, con lo que se obtiene un espectro de
líneas que es característico del gas, siempre que la presión sea baja. Al aumentar la presión, las

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líneas se ensanchan, llegando a superponerse, hasta que, a presiones relativamente altas (0.2–5
mm) se produce un espectro continuo.
Tanto la lámpara de hidrógeno como la de deuterio tienen un intervalo de utilización
comprendido entre 175 y 350 nm (figura 13). También se utilizan con la misma finalidad la
lámpara de descarga de xenon y la de vapor de mercurio.
Finalmente, indicar que, puesto que el vidrio absorbe fuertemente a longitudes de onda
inferiores a unos 350 nm, las lámparas de ultravioleta deben utilizar ventanas de cuarzo.

Figura 13 Curvas de distribución espectral de las lámparas de deuterio y volframio.

Selector de longitud de ondaFiltros y monocromadores

El selector de longitud de onda tiene el objetivo de seleccionar un haz de radiación
"monocromática". Con este fin se utilizan los siguientes dispositivos: los filtros y los
monocromadores. La radiación monocromática es la radiación de una sola longitud de
onda. Por supuesto, es imposible producir radiación monocromática verdadera, en sentido
estricto. Sin embargo, cuanto mejor sea el monocromador, tanto más estrecho será el
intervalo de longitudes de onda.
Filtros
Los filtros de absorción se utilizan en la región visible y se basan en la absorción
selectiva de ciertas longitudes de onda. Normalmente consisten en un vidrio coloreado o
una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio.
Por combinación de diferentes filtros pueden seleccionarse bandas espectrales
relativamente estrechas. Se limitan a la zona del visible.
Los filtros de interferencia consisten en un dieléctrico transparente (frecuentemente,
fluoruro cálcico o magnésico) recubierto en ambos lados con dos finas capas de plata
semirreflectante. (figura 14)

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Figura 14. Filtro de interferencia.

Cuando un haz de radiación incide sobre este dispositivo, una fracción atraviesa la primera
capa metálica, mientras que la restante se refleja. La parte que ha pasado sufre un proceso
similar al llegar a la segunda capa metálica. Si la parte reflejada en la segunda interacción es de
longitud de onda adecuada, se refleja, en parte, desde la cara interior de la primera capa en fase
con la radiación incidente de la misma longitud de onda. El resultado es que se refuerza esa
determinada longitud de onda, mientras que la mayoría de las otras, fuera de fase, sufren una
interferencia destructiva. Estos filtros proporcionan anchuras de banda menores y
transmitancias de pico mayores que los filtros de absorción. Se dispone de filtros de
interferencia para todas las zonas de las regiones ultravioleta y visible, así como parte del
infrarrojo.

Monocromadores
Un monocromador se caracteriza por producir un haz de radiación de gran pureza
espectral y permitir variar, de forma continua y en un amplio intervalo, la longitud de onda de
la radiación. Los componentes básicos de un monocromador son una rendija de entrada, que
selecciona un haz de radiación policromática entrante, un elemento dispersante, prisma o red,
que dispersa la radiación en sus longitudes de onda individuales, y una rendija de salida, que
aísla la banda espectral deseada (figura 15)

Figura 15. Dispersión de radiación por un prisma.

La dispersión de radiación por un prisma se basa en el fenómeno de la refracción; esto es,

el cambio de dirección que experimenta un haz de radiación al pasar de un medio a otro con
distinto índice de refracción. El grado de desviación depende de la longitud de onda; así, los
azules se desvían más que los rojos. El principal inconveniente reside en que la dispersión no es
lineal; esto es, las longitudes de onda no se dispersan de manera uniforme: es mayor para las
longitudes de onda más cortas.

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El material de que está construido el prisma depende del tipo de radiación a dispersar; en la
región visible se usan prismas de vidrio, mientras que en el ultravioleta es necesario usarlos de
cuarzo.
Las redes de reflexión*, que son las más utilizadas, consisten en una superficie dura,
pulida, sobre la que se ha grabado un gran número de surcos paralelos y muy próximos entre sí
(entre 300 y 2000 surcos por milímetro para las regiones ultravioleta y visible).
El fenómeno de la difracción de una radiación policromática por una red se representa
esquemáticamente en la figura 3.16. Para seleccionar la radiación de una determinada longitud
de onda, se hace girar la red hasta hacer que la radiación que interesa coincida con la rendija de
salida, eliminando los órdenes superiores mediante filtros.

Figura 17. Difracción de una radiación policromática por una red.

En cuanto a la ancho de rendija de salida debe tenerse en cuenta lo siguiente: a medida que
disminuye la ancho de rendija se reduce la ancho de banda, siendo posible aumentar la
resolución, pero solo hasta un cierto límite, por que es necesario considerar que al disminuir la
ancho de rendija, disminuye también la intensidad del haz de radiación, por lo que hay que
tener en cuenta la sensibilidad del detector, la cual puede limitar el ancho de la rendija.

Figura 18

Comparando con los prismas, las redes de difracción presentan las ventajas de su elevada
resolución.

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Recipientes para las muestras

En espectrofotometría analítica, casi siempre se trabaja con disoluciones, por lo cual la
mayoría de los recipientes para las muestras son celdas o cubetas para colocar líquidos en
el haz del espectrómetro. Estos recipientes deben estar fabricados con un material que
permita el paso de radiación de la región espectral de interés. Así, el vidrio, plástico y
cuarzo pueden emplearse entre 350 y 2000 nm, mientras que en la región ultravioleta sólo
puede emplearse cuarzo o sílice fundida (ambas sustancias también son transparentes en la
región visible).

Figura 19. Celdas para espectrofotometría.

Las celdas se deben llenar de tal forma que el haz de radiación pase a través de la
disolución, con el menisco por encima del haz. Las celdas típicas para las regiones ultravioleta
y visible tienen 1 cm de paso óptico, si bien existe una gran variedad en cuanto a tamaño, forma
y otras peculiaridades, como se muestra en la figura 19

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Detectores
Los detectores usados en espectrofotometría ultravioleta y visible son transductores que
convierten la energía radiante en una señal eléctrica*. Un detector ideal deberá presentar las
características siguientes:
 Sensibilidad elevada en la región espectral de interés.
 Respuesta lineal para la energía radiante.
 Tiempo de respuesta pequeño.
 Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda.
 Elevada relación señal/ruido.
 Mínima señal de salida en ausencia de radiación.
 Buena disponibilidad para la amplificación.
Los más utilizados son:, fototubos y los tubos fotomultiplicadores. En los equipos de
bajo costo se utilizan como detectores las células fotovoltaicas (celdas de capa barrera).

Células fotovoltaicas
Consisten en una placa de hierro, que actúa de electrodo positivo, sobre la que se deposita
una fina capa de un material semiconductor, como selenio, y éste se recubre de una capa muy
fina de oro o plata, que actúa como segundo electrodo o electrodo colector (figura 20)

Figura 20. Célula fotovoltaica.

Cuando la radiación electromagnética incide sobre el selenio, se promocionan

electrones a las bandas de conducción, haciendo que pasen electrones desde la superficie
del selenio hasta el electrodo colector de plata, produciéndose un aumento de la
conductividad proporcional al número de fotones que inciden sobre la superficie del
semiconductor.
Las células fotovoltaicas presentan las siguientes características: son sencillas de
construir, relativamente baratas y no requieren una fuente de energía externa, por lo que
pueden conectarse directamente a un galvanómetro o un amperímetro. En cuanto a los
inconvenientes, su uso esta limitado a la región visible, presentan dificultades para la
amplificación, y fenómenos de fatiga, de forma que la corriente de salida disminuye
gradualmente con el tiempo.

Fototubos
Consisten en un cátodo semicilíndrico recubierto interiormente de un material
fotosensible, y un ánodo, en el interior de un recipiente en el que se ha hecho el vacío (figura
21)

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Figura 21. Fototubo

Cuando la radiación incide sobre el cátodo, se produce una emisión de fotoelectrones

que se dirigen al ánodo, originándose una corriente que posteriormente se amplifica.
Muchos espectrofotómetros están provistos de detectores intercambiables que permiten
mantener una buena respuesta en un amplio margen de longitudes de onda. En general,
puede concluirse que los fototubos son más sensibles que las células fotovoltaicas, por la
posibilidad de poder amplificar la corriente inicialmente generada.

Tubos fotomultiplicadores
Este tipo de detector consiste en un cátodo fotosensible y una serie de electrodos
(dínodos), cada uno a un potencial menos negativo que el que le precede (figura 22)
La radiación que llega al fotocátodo provoca la emisión de electrones primarios, que
son acelerados hasta el primer dínodo. Al incidir en él, cada fotoelectrón origina la emisión
de varios electrones adicionales; éstos, a su vez, son acelerados hasta el dínodo 2, y así
sucesivamente, hasta que al final, la corriente así producida se recoge en el ánodo, se
amplifica electrónicamente y se mide.

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Figura 22. Tubo fotomultiplicador.

Normalmente, los tubos fotomultiplicadores contienen 9 ó 10 dínodos, los cuales

originan de 106 a 107 electrones por cada fotón. Este sistema de detección se caracteriza por
su respuesta rápida y elevada sensibilidad.
El instrumento que se utiliza en la actualidad para medir la transmitancia o la absorbancia
de una muestra en función de la longitud de onda es el espectrofotómetro
ESPECTROFOTOMETRO: Instrumento más sofisticado que posee un monocromador
en lugar de filtros. Además, el sistema de detección normalmente es un fotomultiplicador, más
sensible que una fotocélula.
FOTOMETRO: Cualquier dispositivo utilizado para medir la intensidad de radiación.
Normalmente se utiliza para designar un instrumento sencillo provisto de filtros para
seleccionar una banda de longitudes de onda y de una fotocélula o un fototubo para medir la
intensidad de radiación.
COLORIMETRO: Instrumento muy simple que compara, usando el ojo humano como
detector, el color de la sustancia problema con el de una disolución patrón. (El nombre de
colorímetro suele aplicarse en la práctica a cualquier instrumento apropiado para medir en la
region visible, y, en realidad, así se conocen muchos fotómetros de filtro comerciales).
Es conveniente destacar aquí las diferencias básicas que existen entre los diversos
instrumentos que pueden ser utilizados para llevar a cabo las determinaciones
absorciométricas:

Fotocolorímetro.
Espectrofotómetro Colorímetro fotoeléctrico. Colorímetro
Características más Sistema de Sistema poco elaborado de Sin monocromación .
importantes monocromación de alta monocromación.
resolución. Sistema de fotodetección Sin detección
Detección instrumental que generalmente no fotoeléctrica.
de alta sensibilidad. permite aplicar la señal.
Fuente de radiación Lámpara de W (Rango Lámpara de W. Lámpara de W.
Visible).
Lámpara de descarga de
H2 ó D2 (Rango UV).
Sistema de Prismas o redes de Filtros de absorción. Filtros No posee, no se utiliza
monocromación difracción. de interferencia o luz monocromática.
combinación de ambos.
Sistema de detección Fototubos o Fotoceldas de capa barrera. Ojo humano.
fotomultiplicadores
Zona del espectro en la UV : 200 – 350nm. Visible: 400 – 800 nm. Visible: 400 – 800 nm.
que puede ser utilizado Visible : 400 – 800 nm.

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Exactitud Muy Buena Buena Aceptable

Sensibilidad Buena Buena Regular
Costo del equipo Alto Medio Bajo

INSTRUMENTOS DE HAZ SENCILLO Y DE DOBLE HAZ

Las medidas de absorción de radiación ultravioleta y visible son, por su propia
naturaleza, de carácter relativo; debe de compararse, continuamente, la absorción de la
muestra, conteniendo el analito, con la de una referencia o blanco conteniendo las mismas
especies que la muestra, excepto el analito. En los instrumentos de haz sencillo hay
solamente un haz de radiación que, después de pasar a través de la muestra llega al detector.
De esta forma, para comparar la absorción del blanco, debe sustituir éste a la muestra en
cada lectura, lo cual implica varios segundos entre cada medida.
Alternativamente, la muestra y la referencia pueden compararse varias veces por
segundo usando un instrumento de doble haz.

Figura 23. Espectrofotómetro de doble haz.

En él, (figura 23) la radiación pasa alternativamente a través de la muestra y de la

referencia, lo cual se lleva a cabo mediante un motor que hace girar un espejo ("chopper")
dentro y fuera de la trayectoria de la radiación. Cuando el espejo obturador intermitente no
desvía el haz, éste pasa a través de la muestra y el detector mide la potencia radiante I.
Cuando dicho espejo desvía el haz a través de la celda de referencia, el detector mide Io. De
esta forma la radiación es desviada varias veces por segundo, y el circuito compara
automáticamente I e Io para obtener la absorbancia.
La operación con el sistema de doble haz presenta, fundamentalmente, la ventaja de obtener
una comparación muy rápida de muestra y referencia ayuda a eliminar errores debidos a
fluctuaciones en la intensidad de la fuente y del detector, inestabilidad electrónica y
cambios en el sistema óptico.

APLICACIONES
En principio, cualquier especie química que absorba radiación electromagnética en las
regiones ultravioleta o visible es susceptible de poder ser determinada por técnicas
espectrofotométricas. El mayor campo de aplicación se encuentra en el análisis
cuantitativo, siendo la espectrofotometría una de las herramientas más usadas.

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Análisis cualitativo
La identificación de un compuesto puro requiere la comparación empírica de los detalles
del espectro (máximos, mínimos y puntos de inflexión) de la sustancia problema con los del
compuesto puro. Los espectros de absorción ultravioleta y visible son, en general, menos
útiles con fines cualitativos respecto de otros métodos (espectros infrarrojos, de resonancia
magnética nuclear).

Análisis cuantitativo
Ya se ha comentado que la espectrofotometría de absorción ultravioleta y visible es
una de las técnicas más usadas en análisis cuantitativo. Se ha estimado que solo en el
campo biosanitario, un 95 % de las determinaciones cuantitativas se llevan a cabo por
espectrofotometría.
En relación con los métodos clásicos de análisis (gravimétricos y volumétricos), los
métodos espectrofotométricos son menos exactos, si bien su mayor sensibilidad (10–4–10–6 M)
y rapidez los hace competir ventajosamente con aquellos en muchas ocasiones. La precisión
puede considerarse aceptable, ya que, normalmente se obtienen incertidumbres relativas entre 1
y 2 %, aunque con determinadas precauciones pueden reducirse considerablemente.

Muchos compuestos orgánicos absorben en la región ultravioleta y el tratamiento de la

muestra solo implica la separación de las posibles interferencias. Por otra parte, algunos
elementos inorgánicos absorben intensamente en la región visible, pero solo en ciertos
estados de oxidación. En estos casos, una etapa previa (además de la disolución si se trata
de muestras sólidas) debe incluir un proceso redox para llevar el elemento al estado de
oxidación adecuado. Así, por ejemplo, el manganeso se determina frecuentemente en forma
de permanganato, previa oxidación con persulfato:

2 Mn2+ + 5 S2O82– + 8 H2O 2 MnO4– + 10 SO42– + 16 H+

La disolución violeta de permanganato presenta un máximo de absorbancia a 525 nm.
En otras ocasiones es posible desarrollar un color por medio de reactivos orgánicos o
inorgánicos. Así, por ejemplo, el Fe3+ puede determinarse mediante el color rojo de los
complejos formados con SCN–; el Ni2+ por el color rosa de su quelato con dimetilglioxima,
etc.
La determinación rutinaria de amoniaco, nitritos y nitratos en aguas para consumo
público suele hacerse espectrofotométricamente. Para el amoniaco se utiliza el reactivo de
Nessler, operando en presencia de EDTA para evitar las interferencias de Ca, Mg y Al,
mientras que para el nitrito suele utilizarse la clásica reacción de diazotación con aminas
aromáticas y posterior reacción con ácido naftilamino-7-sulfónico, midiendo la absorbancia
a 520 nm. Por su parte, el nitrato se reduce previamente a nitrito y se determina éste por el
procedimiento indicado anteriormente.
La formación de especies absorbentes mediante el uso de reactivos adecuados hace
necesario considerar toda una serie de factores, entre los que cabe mencionar:
pH. Esta variable suele jugar un papel muy importante en las reacciones de formación de
complejos.

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Concentración de los reactivos

Previamente a cualquier nueva determinación espectrofotométrica es necesario
establecer los márgenes de concentraciones adecuados de los reactivos, ya que cantidades
demasiado grandes o demasiado pequeñas pueden originar desviaciones de la ley de Beer.
Tiempo adecuado para la medida
Cuando la especie absorbente es estable y su formación es rápida, no es necesario
controlar el tiempo al que realizar las medidas, mientras que si se incumple alguna de las
premisas anteriores, esta variable será necesario tomarla en consideración.
Temperatura
Determinadas reacciones requieren operar a temperatura elevada para aumentar la
cinética de formación de un determinado complejo. En estas ocasiones la temperatura de
trabajo deberá especificarse en el procedimiento.
Orden de adición de los reactivos
A veces, es importante añadir los reactivos según una determinada secuencia.
Eliminación de interferencias
Existen muy pocas reacciones que sean totalmente específicas, por lo que en
muchas ocasiones es necesario eliminar las interferencias de determinadas especies, lo cual
muy frecuentemente se consigue por enmascaramiento.
Extracción con disolventes orgánicos
La eliminación de sustancias interferentes puede llevarse a cabo en ocasiones
mediante extracción con algún disolvente orgánico inmiscible con el agua, aunque también
puede recurrirse a esta técnica cuando la especie absorbente es poco soluble en agua.
Concentración de sales
Altas concentraciones de electrólitos influyen frecuentemente sobre la absorción de
determinados compuestos, debido a la formación de asociaciones iónicas que originan
desplazamientos del máximo de absorbancia.
La base de la aplicación de los métodos espectrofotométricos al análisis cuantitativo
es la ley de Beer. El procedimiento a seguir para llevar a cabo una determinación analítica
consta de una serie de etapas encaminadas a establecer las condiciones de trabajo y la
preparación de la curva de calibrado.
Los efectos de las variables mencionadas deben conocerse y, en consecuencia, escogerse un
conjunto de condiciones de trabajo de forma que la absorbancia no sea afectada
apreciablemente por pequeñas variaciones incontroladas en sus magnitudes.

Los pasos sucesivos a seguir toda vez que se desee emplear un espectrofotómetro son:
1. Preparar a partir de una droga de calidad garantizada, una solución del componente que
se desea determinar en una concentración de tal que el valor de la absorbancia de a la
longitud de onda en que la absortividad es máxima, caiga entre 0,3 y 0,7 unidades de A.
2. Utilizando la solución preparada en 1, efectuar el trazado de la curva espectral para lo
cual se realiza una serie de medidas de absorbancia a distintas longitudes de onda y
concentración constante (Fig. 24)

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Figura 24. Curva espectral

3. Trabajando sobre la curva espectral seleccionar la longitud de onda de trabajo que

corresponda a un máximo de la curva y en zona de meseta, si fuera posible. Esto tiene
por objeto lograr máxima sensibilidad y reproducibilidad.
4. Preparar una serie de soluciones patrones de concentraciones crecientes y perfectamente
conocidas, en el componente a determinar, cuyas absorbancias estén comprendidas
entre 0,100 y 0,700 unidades de absorbancia (figura25).
5. Desarrollar el color en con un reactivo cromogénico adecuado, simultáneamente en los
patrones y en la muestra, cuando ello sea necesario.

Figura 25

6. Realizar las lecturas de la absorbancia de los patrones a la longitud de onda

seleccionada ( = cte.), y graficar absorbancia vs. concentración. Esta gráfica permitirá
verificar el cumplimiento de la ley de Beer y calcular el valor de  (Fig. 26).

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Figura 26. Curva de calibrado

7. Medir absorbancia de la muestra y determinar su concentración utilizando el valor de 

calculado en 6 o por extrapolación en la curva de calibrado.

Si la gráfica absorbancia vs. concentración no hubiese dado una recta, se está en presencia
de una desviación aparente de la ley de Beer, pero la concentración puede determinarse
igual en forma gráfica.

Nota: Las mediciones espectrofotométricas se realizan tomando como referencia una

solución (“blanco’’) que contiene todos los reactivos y fue sometida al mismo tratamiento
que la muestra, pero que no contiene el elemento a determinar.

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APLICACIONES EN QUÍMICA CLÍNICA

Vitaminas
El término genérico de vitaminas se emplea para denominar una serie de
compuestos orgánicos que, imprescindiblemente, deben proceder de fuentes exógenas y que
consumiéndose muy pequeñas cantidades, son esenciales para el desarrollo del individuo.
Las vitaminas desempeñan sus funciones principales actuando como catalizadores
biológicos en combinación con tipos específicos de enzimas.

Determinación de ácido ascórbico

Se prepara un desproteinizado de suero, plasma u orina con ácido tricloroacético. Se
agrega charcoal y el ácido ascórbico del filtrado se oxida a ácido deshidroascórbico. El
ácido deshidroascórbico se une a la 2,4-dinotrofenilhidracina, formándose 2,4-
dinitrofenilosazona. El tratamiento de la osazona con una solución concentrada de ácido
sulfúrico da lugar a la formación de un complejo de color rojo cuya absorción se mide a
515 nm
Iones metálicos
Magnesio
Necesario para la actividad neuromuscular, el magnesio participa en el
metabolismo de las grasas y los carbohidratos; mantiene el normal ritmo del corazón;
facilita la absorción del calcio y la vitamina C; convierte el azúcar en energía; mantiene los
dientes sanos, y alivia los síntomas de indigestión.
El magnesio es un macronutriente esencial porque el organismo lo necesita en grandes
cantidades. Se recomienda 350 mg diarios para el hombre y 300 mg para la mujer. Esta
cantidad debe elevarse a 450 mg durante el embarazo y la lactancia. Su carencia provoca
cansancio, depresión y falta de ánimo.
El magnesio se determina fotométricamente en orina o en el filtrado obtenido con ácido
túngstico del suero, mediante la formación de un complejo rojo con el reactivo amarillo
titán en medio alcalino (= 540 nm).
Se potencia el desarrollo del color con alcohol polivinílico.

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