GUIA A-P E.coli

GUIA LABORATORIO N°5: TÉCNICA
AUSENCIA/PRESENCIA Escherichia coli
1. OBJETIVOS
• Adquirir destreza y conocimientos en técnica de Ausencia/Presencia de Escherichia coli
para muestras de alimentos y el uso de pruebas bioquímicas de identificación.
• Conocer y entender el fundamento de los diferentes medios de cultivos usados en la
técnica de Ausencia/Presencia de Escherichia coli.
• Realizar informe de resultados obtenidos por la muestra analizada y comparar con los
criterios microbiológicos establecidos en la normatividad.
2. INTRODUCCIÓN
La especie Escherichia coli comprende bacilos gram negativos, no esporulados y con flagelos
peritricos en el caso de ser móviles, pertenece al grupo de las enterobacterias y se
caracteriza por ser un microorganismo de fácil recuperación en las muestras de alimentos.
(Doyle & Buchanan, 1997)
E. coli se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal del hombre y de los animales
de sangre caliente. Su presencia en alimentos representa mala calidad higiénica del
proceso, falta de higiene en manipuladores o recontaminación después del proceso y es
considerado el mejor indicador de contaminación fecal en alimentos. Se encuentra en
productos cárnicos, bebidas, derivados del huevo, carnes cocidas y muestras de agua.
(Madigan, Martiniko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015)
3. PREGUNTAS PRELIMINARES
• Investigue las fichas técnicas de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas asociados
con la practica e indique composición, fundamento del medio (para que se usa cada uno
de los componentes del medio) y cómo se identifican las colonias típicas de Escherichia
coli en estos.
4. MATERIALES
• 1 pipeta de 10 ml (para muestras de alimento liquidas)
• Asa de inoculación curva
• Asa de inoculación recta
• Papel estéril
• Marcador de vidrio
• Vinipel
• Reactivos:
o Reactivo de Kovács
o Rojo de metilo
o KOH (40%)
o α-naftol (al 5% en etanol)
o Para Tinción Gram
5. MEDIOS DE CULTIVO
• 1 frasco con 90 ml de caldo verde brillante o EC

• 2 cajas Petri con agar Mac Conkey y EMB
• Tubo con medio de cultivo SIM (Sulfuro Indol Movilidad)
• Tubo con Caldo RMVP (Rojo metilo – Voges Proskauer)
• Tubo con Agar Simmons citrato
• Tubo agar TSI (Hierro Triple azúcar)
6. EQUIPOS
• Pipeteador
• Incubadora a 35°+/- 2°C
• Balanza con sensibilidad de 0,2 g
7. PROCEDIMIENTO
a) Pesar 10 gramos del alimento y colocarlo en 90 ml de caldo bilis verde Brillante o caldo
EC, incubar durante 24-48 horas a 35°C. (procedimiento ajustado, ya que las condiciones
del procedimiento según norma técnica son 25g de alimento en 225 ml de medio).
b) Realizar un aislamiento por agotamiento en cajas con agar EMB y Mac Conkey, incubar
a 35°C durante 24-48 horas. Es muy importante que este aislamiento quede
correctamente hecho para poder realizar las pruebas bioquímicas sin error.
c) Después del proceso de incubación observar colonias características de E. coli (lactosa
positiva), y realizar tinción Gram para confirmar que las características microscópicas
coincidan con E. coli (Bacilos Gram negativos)
d) Tomar de la colonia confirmada por tinción Gram, que este bien aislada y realizar las
siguientes pruebas bioquímicas:
o Medio SIM: introducir el asa recta en el tubo (en el centro, hasta
aproximadamente 2/3 de la profundidad del medio.
o Caldo RMVP (Rojo metilo – Voges Proskauer): inocule con asa curva o recta el
medio.
o Agar Simmons citrato: con asa recta sembrar una estría única en el pico de flauta
del tubo.
o Agar TSI: con asa recta, picar el fondo y extender sobre la superficie del medio.
e) Incubar durante 18-24 horas a 35°C.
f) Revelar las bioquímicas con los reactivos correspondientes (tabla).
BIOQUÍMICA REACTIVO
Medio SIM (indol) Reactivo de Kovac´s (2-5
gotas en el tubo)
Rojo de metilo 2-5 gotas de rojo metilo
Voges Proskauer Añada 12 gotas de α-
naftol y 4 gotas de KOH
8. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Considerar como E.coli las colonias que den las siguientes reacciones:
• Medio SIM: Indol positivo, Movilidad positivo, SH2 negativo.
• Rojo metilo: positivo
• Voges Proskauer: negativo
• Citrato negativo
• TSI (Acido/Acido), Gas positivo, H2S negativo
Indicar la presencia/ausencia de E.coli en X ml o g del alimento analizado.
9. REFERENCIAS
• Doyle, M. P., & Buchanan, R. L. (1997). Food Microbiology; Fundamentals and

Fronteriers. Press. Washington D. Pg 65-72. (4th Edition ed.). Washigton D.C: American
Society for Microbiology (ASM) Press.
• Madigan, M. T., Martiniko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H., & Stahl, D. A. (2015). Brock,
Biología de los microorganismos. . Editorial . (Décima edición ed.). Madrid: Pearson
education. S.A.

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• 1 frasco con 90 ml de caldo verde brillante o EC

• Doyle, M. P., & Buchanan, R. L. (1997). Food Microbiology; Fundamentals and

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