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UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y MEDIO AMBIENTE
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA Y VIROLOGIA
MANUAL DE LABORATORIO

Laboratorio 2: Clasificación de los medios de

cultivo microbiológicos y su utilidad en el
diagnóstico
OBJETIVOS.
• Analizar el fundamento de los principales tipos de medios de cultivo para
bacteriología.
• Conocer la clasificación y uso de los medios de cultivo.

CONTENIDO TEORICO
Todas las formas de vida, desde los microorganismos a los seres humanos, comparten ciertos
requerimientos nutricionales en lo que se refiere a las sustancias químicas necesarias para su
crecimiento y funcionamiento normal. Debemos tener presente que en la naturaleza existe
una gran variedad de tipos de requerimientos nutricionales entre las bacterias.

Los nutrientes son entonces, todas aquellas sustancias necesarias para que la bacteria
sintetice su material celular y pueda generar energía.

Todos los organismos vivos requieren una fuente de energía. Algunas formas de vida,
tales como las plantas verdes, pueden utilizar la energía radiante de la luz y se designan
Fototrofas. Otros como los animales dependen de la oxidación (perdida de electrones de un
átomo) de compuestos químicos, para su energía. Estos organismos se denominan
Quimiótrofos. Todos los organismos vivos son o bien Fototrofos o bien Quimiótrofos, y
ambos tipos existen entre las bacterias.

Todos los organismos vivos requieren carbono en alguna forma, todos requieren al
menos pequeñas cantidades de CO2, pero la mayoría requiere algunos compuestos orgánicos
de carbono, teles como azúcares y otros carbohidratos. Las plantas utilizan el CO 2 y lo
convierten en carbohidratos mediante la fotosíntesis. Muchas bacterias requieren también
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sólo CO2 como única fuente de carbono. Hablando en términos nutricionales, todos estos
organismos son autótrofos. Si obtienen su energía a partir de la luz son fotoautotrofos y si
obtienen su energía al oxidar compuestos químicos son quimioautotrofos. Otras bacterias
son nutricionalmente semejantes a los animales, en el sentido de que no pueden utilizar el
CO2 como única fuente de carbono y dependen de los autótrofos para la producción de
carbohidratos y otros compuestos orgánicos, que luego ellos utilizan como alimentos. Los
microorganismos que requieren compuestos orgánicos como fuente de carbono son
heterótrofos.

Todos los organismos vivos requieren nitrógeno, en alguna forma. Las plantas
utilizan el nitrógeno en forma de sales inorgánicas de nitrato de potasio, en tanto que los
animales requieren compuestos orgánicos, de nitrógeno tales como las proteínas y sus
productos de degradación, es decir péptidos y ciertos aminoácidos. Las bacterias son
extremadamente versátiles en este aspecto, algunos tipos utilizan nitrógeno atmosférico,
algunas utilizan compuestos inorgánicos de nitrógeno y otras requieren nitrógeno procedente
de compuestos orgánicos nitrogenados.

Todos los organismos requieren azufre y fósforo. El requerimiento animal típico de

azufre se satisface como compuestos orgánicos de azufre mientras que el requerimiento típico
vegetal de azufre se satisface con compuestos inorgánicos de azufre. Algunas bacterias
requieren compuestos orgánicos de azufre, algunas son capaces de utilizar azufre elemental.
El fósforo lo proporcionan usualmente los fosfatos, por ejemplo sales de ácido fosfórico.

Todos los organismos vivos requieren varios elementos metálicos como sodio,
potasio, calcio, magnesio, hierro, cobre y cobalto entre otros para su crecimiento normal. Las
bacterias no son una excepción. Las cantidades requeridas son usualmente simples vestigios
y se miden en partes por millón.

Todos los organismos vivos contienen vitaminas (compuestos orgánicos específicos,

necesarios para el crecimiento) y compuestos semejantes a las vitaminas. La mayoría de las
vitaminas participan en la formación de sustancias que activan a las enzimas. Los animales,
incluidos los seres humanos, deben recibir estas sustancias en la dieta. Las bacterias muestran
un patrón variable en este aspecto de la nutrición aunque todas las bacterias requieren
vitaminas en sus procesos metabólicos normales, algunas son capaces de sintetizar sus
requerimientos totales de vitaminas a partir de otros compuestos del medio. Otras no crecerán
a menos que se les proporcione en el medio, una o más vitaminas preformadas.

Todos los organismos requieren agua para sus funciones metabólicas y para su
crecimiento. En el caso de las bacterias, todos los nutrientes deben estar en solución para que
puedan penetrar en el organismo.

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̈Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

compuestos que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos ̈

Todos los organismos necesitan para su desarrollo:

1. Sustancias esenciales para la síntesis de sus constituyentes celulares.

2. Una fuente de energía para que realicen sus funciones vitales.
3. Condiciones ambientales óptimas

Es posible cultivar la mayoría de las especies de bacterias, hongos y algunos protozoarios

(parasitos) de importancia médica en medios artificiales, pero no existe un medio de cultivo
universal que permita el crecimiento de todos ellos.

Hay algunas especies que solo pueden cultivarse en animales de experimentación, por
ejemplo, Mycobacterium leprae y Treponema pallidum.

Los virus, las Clamidas y las Rickettsias no se producen in vitro, si no tiene células de tejidos
vivos.

UTILIDAD EN LOS MEDIOS DE CULTIVO:

• Aislamiento
• Identificación
• Conservación
• Estudios especiales

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FACTORES DE MÁXIMA IMPORTANCIA EN LA FORMULACIÓN

DE UN MEDIO DE CULTIVO.

1. Debe contener elementos nutritivos esenciales.

2. Debe tener un contenido de humedad satisfactorio.
3. Debe tener un pH adecuado.
4. La consistencia del medio debe ser favorable para los fines establecidos.
5. Debe crecer el microorganismo deseado, si es selectivo, los otros deben ser
inhibidos.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES:
1. HUMEDAD

Al contrario de lo que sucede con los organismos superiores, cuyos integumentos

especializados retienen el agua, el metabolismo de las bacterias depende de un
ambiente en el que exista agua.

2. FUENTE DE CARBONO

Brinda energía a través de la oxidación y además proporciona componentes

estructurales. Las bacterias autotróficas (litotrosficas) solo requieren agua, sales
inorgánicas y dióxido de carbono para su desarrollo.

Las bacterias heterotróficas (organotroficas) que exigen una forma orgánica para su
crecimiento como los azucares o hidratos de carbono.

3. FUENTE DE NITRÓGENO

Brinda nitrógenos para la síntesis de aminoácidos, ácidos nucleicos y coenzimas.

Muchos medios contienen la peptona como fuente de nitrógeno. Las peptonas son
hidrolizados de proteínas (soya, carne, gelatina, caseína) por medio de una reacción
acida, alcalina o por digestión enzimática. Están construidas por mezcla de proteasas,
polipéptidos y aminoácidos que son fácilmente asimilados por los microbios en
crecimiento; además, son solubles y de fácil incorporación a la mayoría de los medios.

4. FACTORES DE CRECIMIENTO

Se llaman factores de crecimiento aquellos compuestos orgánicos específicos que

son necesarios en cantidades muy pequeñas y no pueden ser sintetizados por el
microorganismo. Muchas de las bacterias heterotróficas son incapaces de crecer a
menos que se le suministren factores de crecimiento- Estas sustancias que
habitualmente se pronuncian con el medio de cultivo en forma de extractos de la
levadura, carne, hígado, cerebro, sangre entera, sangre desfibrilada, plasma o suero,
incluyen vitaminas, aminoácidos, ácidos grasos, purinas y pirimidinas.
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5. IONES INORGÁNICOS

Cofactores necesarios para las enzimas; almacén de energías; sistema de trasporte de

electrones. Todas las bacterias requieren pequeñas cantidades de un cierto número de
iones inorgánicos (además del nitrógeno, azufre y el fosforo presente en la mayoría
de los nutrientes esenciales) tales como el potasio, el magnesio, el calcio, hierro,
manganeso, cinc, cobalto.

6. SISTEMA AMORTIGUADORES

El pH del medio que expresa su concentración de iones hidrogeno, es

extremadamente importante para el desarrollo de los microorganismos, la mayoría de
ellos crecen a pH aproximadamente neutros, y se determina por medida colorimétrica
o electrométrica.

Debido a que muchas bacterias elaboran productos metabólicos ácidos o básicos

algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH
dentro del rango óptimo de crecimiento bacteriano. Una combinación de KH2PO4
(fosfato potásico monobásico) y K2HPO4 (fosfato potásico dibásico), o sustancias
como las peptonas previenen una desviación del pH.

7. INDICADORES DE PH

Indicadores acido base se añade a menudo a los medios de cultivo con objeto de
detectar variaciones de pH.

8. AGENTES REDUCTORES

Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a los medios para
crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilicos o
anaeróbicos estrictos.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO POR SU

COMPOSICIÓN.
1. MEDIOS EMPÍRICOS

La composición exacta de estos medios es desconocida al participar en ellas sustancias de

descomposición compleja y variantes (extractos de carne, levadura, etc.).

2. MEDIOS SINTÉTICOS

Son medios químicamente definidos en los que se conoce su proporción exacta de cada
componente, se emplean para estudios de metabolismo y crecimiento bacteriano.

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3. MEDIOS SEMISINTÉTICOS

En su composición participan compuestos químicos puros y sustancias orgánicas de

naturaleza química poco definida (extracto de levadura, En peptona). Son los más
extensamente utilizados para el aislamiento e identificación de la mayoría de los
microorganismos.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A

SU CONSISTENCIA.
1. LÍQUIDOS

Los elementos nutritivos se encuentran en una solución acuosa y reciben el nombre de

Caldos.

2. SÓLIDOS

Son medios líquidos a los que se les añade, sin alterar su valor nutritivo, una sustancia
solidificaste.

3. SEMISÓLIDOS

Son medios líquidos a los que añade una concentración de agar baja, según la consistencia
que se quiera obtener. Se utiliza principalmente para estudiar la movilidad de los
microorganismos.

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CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A

SU FUNCION.
1. MEDIOS GENERALES O BÁSICOS

Contienen los nutrientes básicos que permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos, Por ejemplo, Caldo Nutritivo, agar nutritivo, etc.

2. MEDIOS ENRIQUECIDOS

Son medios básicos que se han enriquecido con aditivos como son líquidos
corporales, vitaminas, aminoácidos y proteínas específicas. Por ejemplo, Agar con
sangre; agar chocolate, etc.

Medios de enriquecimiento. Son aquellos medios líquidos selectivos que enriquecen

la población de un microorganismo específico de una población mixta. Se les
incorporan sustancias para inhibir el crecimiento de microorganismos distintos a
aquellos para los que fueron ideados. Ejemplos Caldo selenito y Caldo tetrationato
que son útiles pare el enriquecimiento de especies de Salmonella y Shigella.

3. MEDIOS DIFERENCIALES

Son aquellos en los que se pone de manifiesto propiedades que un determinado tipo
de microorganismo posee. Ejemplo agar sangre, agar SS.

La diferenciabilidad de muchos microorganismos se basa en la producción de ácidos

o álcalis a partir de varios sustratos utilizando por ellos. Es por eso que muchos de
estos medios incluyen indicadores de pH que permiten la detección visual de estos
cambios. Ejemplo agar MacConkey, agar SS.

4. MEDIOS ESPECIALES O DE ENSAYOS

Son medios empleados para comprobar una o más características bioquímicas, se

crearon con el fin de identificar y clasificar a los microorganismos según sus
actividades metabólicas. Ejemplo SIM, TSI, LIA, etc.

5. MEDIOS PARA EL TRANSPORTE

Son medios semisólidos o líquidos, su función es la de mantener la vialidad de los

microorganismos durante varias horas, permitiendo así́ el aislamiento de especies
poco resistentes después de transcurrido cierto tiempo entre la toma de muestra y la
entrega en el laboratorio. Ejemplo Amies, Cary Blair, Stuart.

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SUSTANCIAS USADAS COMO AGENTES SOLIDIFICANTES PARA

FORMULACIONES NO LIQUIDAS.
1. EL AGAR

Es un polisacárido extraído de ciertas algas marinas principalmente de la clase

Rhodophyceae, en particular de la especie Gelidium corneum. Funde
aproximadamente a 92 °C Solidifica a no más de 42 °C.

Es digerida por muy pocos microorganismos y su adición al medio no afecta sus

características nutricionales ni su pH.

La concentración de agar para un medio solido es del 2% y para un medio semisólido

es de 0.05-0.75%.

2. LA GELATINA

Es una mezcla de proteínas libre de carbohidratos obtenida a partir de colágeno de la

piel, cuero, tendones y huesos de animales. Forma un gel de buenas características a
concentraciones del 12-15% que permiten usarla como soporte; Como pueden ser
digerida por algunos microorganismos se usa el 3% para determinar características
proteolíticas. Su punto de fusión es de 22 °C, quedando destruidas sus propiedades al
alcanzar temperaturas superiores a los 100 °C.

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3. PLASMA

Una variante de los medios sólidos son los medios condensados preparados a partir
de materiales coagulables como el suero o la albumina de huevo u condensado en
forma de pico de flauta a temperaturas cuidadosamente controladas entre 70 y 80 °C.

POSIBLES FUENTES DE ERROR EN LA PREPARACIÓN DE

MEDIOS DE CULTIVO.

• Medio inadecuado.
• Pesaje erróneo.
• Material de vidrio mal lavado.
• Agua de mala calidad.
• Sobrecalentamiento.
• Esterilización inadecuada.
• No ajustar pH.
• Distribución incorrecta.
• Inadecuado almacenamiento.

MÉTODOS PARA CONOCER EL BUEN ESTADO DE LOS MEDIOS

DE CULTIVO PREPARADOS
CONTROL DE ESTERILIDAD

Sirve para verificar que los medios de cultivos son estériles. Se toma un 5% de la
partida al azar y se incuban por 48 h a 37 °C y 7 días a temperatura ambiente. Para
probar la esterilidad de los medios selectivos es necesario inocular muestras de cada
partida en un medio no inhibidor.

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CONTROL DE CALIDAD.

Determinar la capacidad del medio para respaldar el desarrollo de presuntos

microorganismos y/o exhibir una respuesta bioquímica típica.

o El pH debe estar dentro de un intervalo de + 0.2 del indicado por el fabricante.

CONTROL DE CADUCIDAD

En el momento de preparar los medios es preciso anotar de forma visible sobre cada
tubo, placa, frasco o matraz, el nombre del medio de cultivo, fecha de preparación y
su fecha de caducidad. De esta forma será́ fácil en todo momento llevar un control de
los medios en cuanto a su fecha de caducidad.

Material y reactivos:
• 4 matraces Erlenmeyer de 250mL (por grupo de trabajo que se coordinaran en el lab.)
• 1 rejilla de cerámica y trípode
• 1 varilla de vidrio
• tubos con agar nutritivo cuña larga
• tubos con caldo nutritivo
• tubos con agar nutritivo cuña corta
• placas de Petri con agar nutritivo
• placas de Petri con agar MacConkey
• placas de Petri con EMB (agar levine)

Equipos:
• Autoclave-balanza

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Procedimiento:
La cantidad de medio de cultivo que deberá́ emplearse por litro o ml de medio que se desea
preparar, está especificado en cada frasco, se hacen los cálculos necesarios para las
cantidades deseadas y a continuación se pesan.

Colocar el polvo (medio de cultivo) en un matraz Erlenmeyer y añadir poco a poco el agua
destilada; agitando constantemente para evitar que se formen grumos; para efectuar la
agitación se utiliza un agitador magnético o varilla de vidrio; la cantidad completa de agua
se añade cuando todo el polvo se haya mojado bien; los medios líquidos o caldos se disuelven
bien a temperatura ambiente.

Los medios de agar tienen que calentarse hasta punto de ebullición para que se disuelvan por
completo. Esto puede realizarse de varias formas; para cantidades (hasta 300 mg.), el mejor
procedimiento es calentar el matraz manteniendo el contenido bien agitado para impedir que
se queme.

Otro método satisfactorio que reduce el tiempo de calentamiento del medio es hervir tres
cuartas partes de agua destilada y suspender el medio deshidratado en el resto de agua fría,
teniendo cuidado de que todo el medio sea suspendido uniformemente, entonces la
suspensión se añade al agua hirviendo hasta que la solución sea completa; también debe
tenerse cuidado de que la ebullición no sea demasiado fuerte y en un momento dado pueda
ocasionar que el medio se derrame.

Los medios de gelatina se disuelven mejor calentándose hasta 50°C en un baño de agua (baño
María).

Los medios de agar y gelatina tienen que estar en una completa solución antes de verterlos
en los recipientes en los que habrán de esterilizarse.

Cuando se logra la disolución completa de los medios se prepara un tapón de algodón o gasa
para tapar el matraz en el cual se encuentra contenido el medio, se introduce en la autoclave
para esterilizarlos; previamente marcados para su identificación.

Los medios de cultivo de agar están propensos a mostrar un precipitado, bajo una
esterilización o calentamiento prolongado. La repetida fusión del agar solidificado o el
mantenerlo en fusión a alta temperatura pueden, así́ mismo, causar la formación de un
precipitado en el medio de cultivo.

Un medio que contenga agar también puede formar un precipitado floculante si el medio
líquido se mantiene en un baño de agua (baño María), a una temperatura de 43 a 45 oC, por
un tiempo superior a los 30 min. Este precipitado de agar floculante, no obstante, puede
disolverse calentando de nuevo el medio.

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Un calentamiento del medio también da como resultado un aumento de la acidez. Por un

calentamiento prolongado es posible destruir las propiedades de gelatinización y esta
destrucción se acelera a medida que se aumenta la acidez.

Cumplido el tiempo necesario para la esterilización se saca de la autoclave e inmediatamente

se coloca en los recipientes adecuados, como por ejemplo verter el medio de cultivo en
placas, lo que se denomina “plaquear”.

En el caso de realizar tubos de ensayo con medio de cultivos, el medio de cultivo ya sea
caldos o agares se adiciona al tubo y luego se lleva a la autoclave.

Se distribuye aprox. 6 o 7 ml del agar o caldo en los tubos, al salir del autoclave se colocan
en posición inclinada (se utilizan soportes para inclinar los tubos), permitiendo que se
solidifiquen para formar tubos con agar en cuña corta o cuña larga. Al colocar los tubos en
esta posición se debe tener cuidado de que el ángulo de inclinación sea el adecuado para
impedir que el algodón que tapa el tubo se moje y pueda contaminar el medio.

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FIGURA: PROCEDIMIENTO PARA PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVOS

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Cuestionario
1. Defina qué es un medio de cultivo y cuál es su utilidad.
2. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo de acuerdo a su consistencia?
3. ¿Qué sustancias se emplean para modificar la consistencia de los medios de cultivo?
4. Mencione las propiedades fisicoquímicas del agar.
5. Qué utilidad tiene cada uno de los siguientes tipos de medios de cultivo:
a) Líquido
b) Semisólido
c) Sólido
6. Explique en qué consisten los siguientes medios de cultivo y cite tres ejemplos de
cada uno:
a) Básicos o corrientes
b) Enriquecido
c) Selectivo y/ o diferencial

7. ¿Cuál es la diferencia entre el agar sangre y el agar chocolate?

8. ¿Qué precauciones deben tomarse en cuenta al preparar un medio de cultivo?
9. Realice una tabla para los siguientes medios de cultivo: EMB, Mac Conkey, Agar
Baird Parker, Agar Salmonella y Shigella, Agar Nutritivo

Dicha tabla deberá́ de contener la siguiente información:

a) Nombre del medio de cultivo

b) Clasificación de acuerdo a su composición química
c) Fundamento teórico del medio
d) Utilidad
e) Interpretación resultados (si aplica)

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