CULTIVO IDENTIFICACION Y AISLAMIENTO DE LEVADURAS

I. OBJETIVOS. Dar a conocer al alumno el comportamiento fisiolgico y cultural de los microorganismos .Identificar y aislar microorganismos de inters industrial. Conocer y aplicar las diferentes tcnicas de sembrado para el cultivo de microorganismos. Identificar y aislar microorganismos de inters industrial

II) INTRODUCCION.
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de biotecnologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: CULTIVOS Es la tcnica de referencia, ya que permite la identificacin del agente etiolgico y realizar estudios de sensibilidad a los agentes antimicrobianos. Requiere la presencia de microorganismos vivos capaces de desarrollarse en los medios utilizados. El resultado de un cultivo depender, adems de los factores mencionados, de la siembra en medios enriquecidos de buena calidad.

III ) REVISION BIBLIOGRAFICA CONCEPTO DE MEDIO DE CULTIVO.

Los medios de cultivo son preparados estriles slidos, semi-slidos o lquidos que contienen las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Consisten en mezclas de elementos nutrientes de distinta naturaleza que utilizan los microorganismos para su crecimiento. Se utilizan en el laboratorio para aislar e identificar microorganismos. Los medios de cultivo se clasifican segn su estado fsico, su presentacin, el contenido de nutrientes

Requisitos que deben llenar los medios de cultivo. a) Contener las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos. b) Tener un pH apropiado para la especie microbiana que se va a cultivar (7,2 para los microorganismos patgenos comunes; 5,1 para Lactobacilus acidophilus). c) Estar previamente esterilizado. d) Estar protegidos de la contaminacin ambiental.

Requerimientos nutricionales
Todas las formas de vida, desde los microorganismos a los seres humanos, comparten ciertos requerimientos nutricionales en lo que se refiere a las sustancias qumicas necesarias para su crecimiento y funcionamiento normal. Debemos tener presente que en la naturaleza existe una gran variedad de tipos de requerimientos nutricionales entre las bacterias. Los nutrientes son entonces, todas aquellas sustancias necesarias para que la bacteria sintetice su material celular y pueda generar energa. Todos los organismos vivos requieren una fuente de energa. Los animales dependen de la oxidacin (perdida de electrones de un tomo) de compuestos qumicos, para su energa. Estos organismos se denominan Quimitrofos. Todos los organismos vivos son o bien Fototrofos o bien Quimitrofos, y ambos tipos existen entre las bacterias. Todos los organismos vivos requieren carbono en alguna forma, todos requieren al menos pequeas cantidades, adems requieren nitrgeno, en alguna forma. Las plantas utilizan el nitrgeno en forma de sales inorgnicas de nitrato de potasio, en tanto que los animales requieren compuestos orgnicos, de nitrgeno tales como las protenas y sus productos de degradacin, es decir pptidos y ciertos aminocidos. Las bacterias son extremadamente

verstiles en este aspecto, algunos tipos utilizan nitrgeno atmosfrico, algunas utilizan compuestos inorgnicos de nitrgeno y otras requieren nitrgeno procedente de compuestos orgnicos nitrogenados. Todos los organismos requieren azufre y fsforo. El requerimiento animal tpico de azufre se satisface como compuestos orgnicos de azufre mientras que el requerimiento tpico vegetal de azufre se satisface con compuestos inorgnicos de azufre. Algunas bacterias requieren compuestos orgnicos de azufre, algunas son capaces de utilizar azufre elemental. El fsforo lo proporcionan usualmente los fosfatos, por ejemplo sales de cido fosfrico. Todos los organismos vivos requieren varios elementos metlicos como sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro, cobre y cobalto entre otros para su crecimiento normal. Las bacterias no son una excepcin. Las cantidades requeridas son usualmente simples vestigios y se miden en partes por milln. Todos los organismos vivos contienen vitaminas (compuestos orgnicos especficos, necesarios para el crecimiento) y compuestos semejantes a las vitaminas. La mayora de las vitaminas participan en la formacin de sustancias que activan a las enzimas. Los animales, incluidos los seres humanos, deben recibir estas sustancias en la dieta. Las bacterias muestran un patrn variable en este aspecto de la nutricin aunque todas las bacterias requieren vitaminas en sus procesos metablicos normales, algunas son capaces de sintetizar sus requerimientos totales de vitaminas a partir de otros compuestos del medio. Otras no crecern a menos que se les proporcione en el medio, una o ms vitaminas preformadas. Todos los organismos requieren agua para sus funciones metablicas y para su crecimiento. En el caso de las bacterias, todos los nutrientes deben estar en solucin para que puedan penetrar en el organismo. Los nutrientes que utilizan dependen del tipo de bacteria. Energticamente las bacterias littrofas necesitan H 2S como donador de electrones, NH2 o NH3 (nitrificantes), H2, S2, Fe+2,..... y las organtrofas necesitan muchas sustancias orgnicas pero desde el punto de vista energtico, las mas utilizadas son: carbohidratos, lpidos, protenas y otros componentes (alcoholes, cidos orgnicos, etc.). Desde el punto de vista estructural, las bacterias necesitan como elementos mas representativos: C, H, O, N, S, P, Fe+2, Mg+2, K, Na..... Estos elementos se pueden encontrar en forma orgnica o inorgnica. Las bacterias en conjunto poseen vas metablicas necesarias para sintetizar todos los compuestos necesarios a partir de sustancias de tipo inorgnico: CO2 , H2O, N2, NH3, SO4..... Sin embargo, la sntesis total de una clula a partir de compuestos simples es una excepcin, ya que solo un grupo reducido de bacterias pueden crecer a expensas de sustancias simples. La mayora de las bacterias carecen de una varias vas metablicas para ello y necesitan un aporte en forma orgnico. SUPLEMENTOS Algunos microorganismos son muy difciles de cultivar y deben agregarse a los medios elementos que son denominados como suplementos como por ejemplo; Extracto de levadura, peptonas y extracto de carne. Extracto de levadura. Es un extracto de la hidrlisis cida o enzimtica de las clulas de levadura, que han sido lisadas previamente por calor. Es una fuente rica en vitamina B, contiene adems nitrgeno orgnico y compuestos carbonados. Se puede adquirir comercialmente en forma de polvo. Peptonas. Productos que resultan de la digestin de materiales proteicos, por ejemplo carne, casena y gelatina. Existen disponibles en el comercio muchos tipos diferentes de peptonas (dependiendo de la protena utilizada y del mtodo de digestin) para su utilizacin en medios bacteriolgicos; las peptonas difieren en cuanto a su capacidad de soportar el crecimiento de las bacterias. Las peptonas son la principal fuente de nitrgeno orgnico; pueden contener adems algunas vitaminas y a veces carbohidratos, dependiendo del material proteico digerido. Extracto de carne. Es un extracto concentrado de los productos hidrosolubles de la carne de buey. Es la fuente principalde carbohidratos, compuestos orgnicos de nitrgeno, vitaminas hidrosolubles y sales. Otros elementos necesarios para el crecimiento y que deben encontrarse presentes en los medios de cultivos son: NaCl en cantidades del 0,5% para evitar fenmenos de lisis en la clula bacteriana. Todos los medios de cultivo deben ser hidratados con agua la cual debe ser destilada para evitar la formacin de carbonato de calcio que enturbie el medio e impida el crecimiento bacteriano.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estril. El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las tcnicas empleadas normalmente en microbiologa, siguiendo el siguiente esquema a partir de una muestra de suelo: La muestra de suelo se resuspende en agua estril. El sobrenadante se diluye 10-1 a 10-10 veces.

Muestras de estas series de diluciones (c.a. 100 L) se siembran sobre varios medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban. Se aislan colonias separadas de distinta morfologa y se purifican por resiembra. Los cultivos puros se mantienen en tubos de ensayo como cultivos en medio slido listos para realizar las pruebas de seleccin. El mtodo de siembra por estra en placa Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos (Figura 1). Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petr (a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se fiamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales. Para aislar clulas individuales, los microorganismos han de ser diluidos, debido al gran numero en que normalmente estn presentes. La dilucin se realiza, normalmente, por uno de los siguientes sistemas: siembra por estra en placa, vertido en placa y extensin en placa. Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa: En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien (). Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario

Desarrollo del inculo:

Tanto en la primera produccin industrial como en las siguientes es necesario utilizar grandes volmenes de cultivo por lo que la preparacin de un inculo adecuado es una tarea de importancia capital. En un proceso industrial puede ser necesario realizar incubaciones de gran volumen (>160.000 litros) para las que son necesarios tambin grandes inculos (>1.000 litros). Para repetir rutinariamente la operacin de produccin es necesario utilizar cultivos almacenados del microorganismo de inters (cultivos stock) y a partir de ellos hay que desarrollar el inculo intentando: (1) minimizar la prdida de viabilidad durante el proceso de recuperacin del microorganismo, (2) obtener una copia genticamente idntica a la que se haba almacenado (esto es: evitar mutaciones y contaminaciones), (3) incrementar la biomasa del cultivo y (4) cultivar el microorganismo hasta un estado fisiolgico adecuado para lograr la mayor eficiencia en la fase final de produccin. ICMSF 1996, Microorganismos de los Alimentos, Editorial Acribia. S.A, Zaragoza (Espaa.)

MACCONKEY AGAR
Agar selectivo para el aislamiento de Salmonellas, Shigellas y bacterias coliformes, a partir de heces, orina, alimentos, aguas residuales, etc. segn McCONKEY (1905). Forma de actuacin Las sales biliares y el Violeta cristal inhiben considerable mente la flora gram-positiva. La lactosa, junto con el indicador de pH Rojo neutro, sirven para la comprobacin de la degradacin de dicho azucar. Composicin (g/litro) Peptona de casena 17,0; peptona de carne 3,0; cloruro sdico 5,0; lactosa 10,0; mezcla de sales biliares1,5; Rojo neutro 0,03, Violeta cristal 0,001; Agar -agar 13,5. Preparacin y conservacin Disolver 50 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min. a 121 C) y verter en placas. pH: 7,1 0,2 a 25 C Los medios de cultivo preparados son claros y de color rojo parduzco a rojo oscuro

TRIPLE AGAR DE HIERRO DE AZCAR- AGAR DE TSI

Triple Agar de hierro de azcar (Agar de TSI) es usado para la diferenciacin de bacilos gram negativos sobre la base de fermentacin de carbohidratos y la produccin de sulfito de hidrgeno. Agar de TSI contiene tres azcar (dextrosa, lactosa y sacarosa), fenol rojo para detectar fermentacin de carbohidrato y sulfato de amonio ferroso para la deteccin de la produccin de sulfide de hidrgeno (demostrada se ennegreciendo en el mango del tubo). Fermentacin de carbohidrato es demostrado por la produccin del gas y un cambio en el color del indicador de pH de rojo a amarillo. Para facilitar la deteccin de organismos que solamente fermentan dextrosa, la concentracin de dextrosa es uno - dcimo la concentracin de lactosa o sacarosa. Lo pequeo amount of cido producido en la pendiente del tubo durante la fermentacin de dextrosa se oxida rpidamente, causando que el medio se quede rojo o volver a un pH alcalino. Por contraste, la reaccin de cido (amarillo) es mantenida en el mango del tubo porque est bajo la tensin de oxgeno ms baja. Mtodos de aislamiento:agotamiento por estra en tres placas. Se agota el inoculo en placas. v Para el asa estriado. v Esterilizar el asa v Estriar el asa sin esterilizar el rea. b) por dilucin y estras en una sola placa. Se realizan diluciones seriadas y luego se siembra en un placa dividida en cuatro, las diluciones realizadas. El aislamiento de hongos se debe usar un medio apropiado con sustancias antimicrobianas. Tambin el medio a usar debe tener un ph muy bajo teniendo la acidez.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las tcnicas empleadas normalmente en microbiologa, siguiendo el siguiente esquema a partir de una muestra de suelo: v La muestra de suelo se resuspende en agua estril. v El sobrenadante se diluye 10-1 a 10-10 veces. v Muestras de estas series de diluciones (c.a. 100 L) se siembran sobre varios medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban. v Se aslan colonias separadas de distinta morfologa y se purifican por resiembra. v Los cultivos puros se mantienen en tubos de ensayo como cultivos en medio slido listos para realizar las pruebas de seleccin.

SELECCION DE MICROORGANISMOS
Los parmetros que se utilizaran para seleccionar estos microorganismos productores de antibiticos seran: Temperatura: Hongos 20-22C; Actinomicetos 28C Ph: Hongos pH cido; Bacterias pH neutro Oxgeno: Todos los productores son aerobios Carbono: Actinomicetos glicerol, quitina, almidn Nitrgeno: Actinomicetos casena, arginina, asparragina; Gram +, Gram,amplio espectro, etc. Se aslan, para ensayos posteriores, aquellas colonias que produzcan halos de inhibicin. ICMSF 1996, Microorganismos de los Alimentos, Editorial Acribia. S.A, Zaragoza (Espaa.)

III.

MATERIALES y rectivos Reactivos Mechero Bunsen ESPATULA GRADILLAS

Materiales de vidrio Tubos de ensayo Placas petri Asas de colle * Variilas de vidrio FOSFORO

*Agares utilizados simmons citrate agar triple sugar iron agar mac conkey agar lysine iron agar

VI) PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Pesar la muestra del agar Medir 25ml en una probeta agua destilada Pasar a un erlemeyer de 80ml Llevar al autoclave durante 15 minutos las muestras i luego sacar Echar del erlmenyer a los tubos del ensayo serca del mechero Luego de enfriar unos minutos aplicar las tecnicas de profundidad con asa bacteoroloica de las muestras del tsi, lisini ,macnkey en las placas respectivas .coger un microorganismo para para cada placa y tubo de las muestras y llevar a estufa las placas y observar lueo de 48 horas . METODO DE AISLAMIENTO POR RAYADO EN CUADRANTES Y METODO POR RAYADO CONSATANTE

V) RESULTADOS . presencia de microorganismos en los tubos Y PLACAS LUEGO DE 72 HORAS Medio de cultivo material Observaciones Simmons Citrate Agar placas No hay sigo de crecimiento de m.o. Tubos de ensayo No existe crecimiento de m.o. Triple Sugar Iron Agar placas Si hay crecimiento de parcial de m.o. Tubos de ensayo Si hay crecimiento de parcial de m.o. Mac Conkey Agar placas Existe un crecimiento parcial de m.o en todo el entorno del estriado. Tubos de ensayo Hay un crecimiento a menudo de m.o en el estriado. Lysine Iron Agar placas Existe crecimiento de m.o. Tubos de ensayo Si hay crecimiento de parcial en todo el entorno de m.o. Interpretacion de los resultado obteinod de la siembrade cultivo con respecto asu aspecto,fondo y superficie. Cuadro Nro4.interpretacion del cultivo Simmons Citrate Agar amarilo Simmons Citrate Color y Agar aspecto fondo Fermentacin de la glucosa y formacin de acidos. superficie Fermentacin de la lactosa y/o sacarosa con produccin de acidos.

Cuadro Nro5.interpretacion del cultivo Triple Sugar Iron Agar Rojo intenso Triple Sugar Iron Color y Agar aspecto fondo No se fermenta la glucosa y se produce formacin de lcali. superficie No hay fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa y hay formacin de lcali.

Cuadro Nro6.interpretacion del cultivo Mac Conkey Agar No hay cambio original de color del Mac Conkey Agar Color y medio aspecto fondo No hay fermentacin de la glucosa superficie No hay fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa.

CALCULOS
PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO AGAR MAC CONKEY 500Gr. ----------9.7Lt X ----------25ml X = 1.2886 gr. PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO AGAR TRIPLE SUGAR IRON (TSI) 65Gr. --------------- 1000ml X --------------- 25ml X = 1.6250gr PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO AGAR LYSINE IRON 34.56Gr. ------------1000ml X ------------25ml X = 0.8640gr PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO AGAR SIMMONS CITRATE 24.28Gr. ------------1000ml X -------------25ml X= 0.6070

Los medios se distribuyen de acuerdo a su rotulacin a cada placa, con previa manipulacin hasta que se gelefique y finalmente se lleva a la incubacin por 24 horas, o mas a una temperatura de 37C, hasta que las levaduras se desarrollen en el medio.

VI) DISCUSIN Y RECOMENDACIN A) Segn Mara Jos Linares Sicilia * las distintas diferencia de crecimiento microbiano en diferentes cultivos como Agar Macconkey selectivo para el aislamiento de Salmonellas, Shigellas y bacterias coliformes, a partir de heces, orina, alimentos, aguas residuales, etc. segn McCONKEY ( Clavell, L.; Pedrique de Aulacio *El cultivo Triple Agar de hierro de azcar (Agar de TSI) es usado para la diferenciacin de bacilos gram - negativos sobre la base de fermentacin de carbohidratos y la produccin de sulfito de hidrgeno. * *Se observo las colonias que formaron de diferentes especies y gneros tornando diferentes colores, y de igual manera el los tobos de ensayo se observa claramente las coloraciones que formaron el substrato agar en las placas y tubos de ensayo. ICMSF, *Triple Agar de hierro de azcar (Agar de TSI) es usado para la diferenciacin de bacilos gram - negativos sobre la base de fermentacin de carbohidratos y la produccin de sulfito de hidrgeno. Se observo en los resultados no hay fermentacin de la lactosa ni de la

sacarosa y hay formacin de lcali. No se fermenta la glucosa y se produce formacin de lcali.

*Agar de TSI contiene tres azcar (dextrosa, lactosa y sacarosa), fenol rojo para detectar fermentacin de carbohidrato y sulfato de amonio ferroso para la deteccin de la produccin de sulfide de hidrgeno (demostrada se ennegreciendo en el mango del tubo).

B) Se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios. La muestra deben diseminarse lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo slido, de manera que luego de la incubacin ellos formen colonias visibles aisladas

VII) CONCLUSION
*Los microorganismos que desarrollaron en los diferentes cultivos y la muestra sometidas al cultivo, se encuentran microorganismos especficos en cada una de los cultivos esto debido al contenido de nutrientes que pueda aprovechar dicho microorganismo del agar. *se observo las colonias que formaron de diferentes especies y gneros tornando diferentes colores, y de igual manera el los tobos de ensayo se observa claramente las coloraciones que formaron el substrato agar en las placas y tubos de ensayo

*Al diseminar sobre un medio de cultivo slido una muestra de bacterias, diluida convenientemente, las clulas individuales quedarn lo suficientemente separadas unas de otras y crecern en forma de colonias aisladas, a partir de las cuales se puede obtener un cultivo puro. *Luego de tener las colonias aisladas, stas deben transferirse con el filamento a un tubo que contenga agar nutritivo estril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como transplante

VII) CUESTIONARIO
QUE ENTENDEMOS POR AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Y CUANDO LO LLEVAMOS ACABO? Es separar un tipo de microorganismo a partir de una poblacin que los contiene de varios tipos. En habtantes naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algn procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de m.o. presentes. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los m.o. estn en una proporcin adecuada. Cuando el m.o. que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporcin en la muestra, o interesa un solo tipo de m.o., se lleva a cabo un procedimiento llamado bsqueda que involucra una primera etapa de aumento del nmero de microorganismos del tipo que se desea aislar en relacin al resto de la poblacin. Luego se aisla por el mtodo de estras o por dilucin y se identifica.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: a) Aislamiento por estras b) Aislamiento por dilucin QU FUENTES NATURALES DE LEVADURAS, BACTERIAS LCTICAS, CONIFORME Y ACTICA CONOCE USTED? Fermentaciones naturales: vino, pan, queso, materiales en descomposicin. microorganismos productores de antibiticos se encuadran dentro de las bacterias (Bacillus, Pseudomonas y fundamentalmente actinomicetos) y hongos (Penicillium). Los parmetros que se utilizaran para seleccionar estos microorganismos productores de antibiticos seran: Temperatura: Hongos 20-22C; Actinomicetos 28C Ph: Hongos pH cido; Bacterias pH neutro Oxgeno: Todos los productores son aerobios Carbono: Actinomicetos glicerol, quitina, almidn Nitrgeno: Actinomicetos casena, arginina, asparragina; Gram +, Gram -, amplio espectro, etc. Se aslan, para ensayos posteriores, aquellas colonias que produzcan halos de inhibicin. QUE OTROS MTODOS DE AISLAMIENTO EXISTEN? Aislamiento en placa por estras Existen distintas tcnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. Tcnica a. Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfra, se gira la placa 90 y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por ltimo, sin quemar el ansa, se estra el resto de la superficie sin sembrar . Tcnica b

Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estras; se quema el ansa, se perpendiculares a las anteriores, repite el procedimiento hasta placa

hacen 3 o 4 estras se quema el ansa y se agotar la superficie de la

Aislamiento por dilucin en medio slido Se emplean tanto el mtodo de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puede preparar las diluciones decimales en condiciones aspticas usando suero fisiolgico o algn otro diluyente. La siembra incorporada se realiza tal como se describi anteriormente. Tambin se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por rotacin entre las manos y se vierte en placas de Petri estriles.

BIBLIOGRAFA
*Antonio Madrid Vicente, 2001. Nuevo manual de industrias alimentaras. Edicin-Mundi Prensa (Espaa). Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales (2da edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. *Mara Jos Linares Sicilia. 2001 Revista Iberoamericana de Micologa - ISBN: 84-607-3050-6

ICMSF 1996, Microorganismos de los Alimentos, Editorial Acribia. S.A, Zaragoza (Espaa.)