UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN – TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA – MICROBIOLOGÍA

ABOUT DNA DAY

ELECTROFORESIS
DOCENTE : Freddy Eddinson Ninaja Zegarra
CURSO : Técnicas Moleculares
ESTUDIANTES :
❏ Clever Lenin Turpo Quispe (2018-118066) ❏ Nicole Stefany Mamani Checalla (2020-118026)
❏ Patrick Stefano Barrios Arocutipa (2020-118017) ❏ Hamileth Pamela Roque Castillo (2019-118058)
 INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN

ABOUT DNA DAY

La electroforesis es un componente importante del
procedimiento sistemático de análisis (separación,
purificación y preparación) de ácidos nucleicos y
proteínas en biología molecular.

La magnitud de la carga eléctrica de la mayoría de las

biomoléculas depende del pH de su entorno.

Como resultado, cuando están expuestas a un campo

eléctrico, pueden moverse hacia el polo de carga
opuesto al de la molécula.
 TABLA DE CONTENIDO

Elementos necesarios Procedimiento general

01 para una electroforesis 03 de una electroforesis

Electroforesis Aplicaciones de una

02 horizontal y vertical 04 electroforesis
 01

2022
ELEMENTOS NECESARIOS
PARA LA ELECTROFORESIS
 CÁMARA DE
ELECTROFORESIS
Un dispositivo conocido como cámara de
electroforesis permite la creación de un campo
eléctrico alrededor de un gel donde se depositan
las muestras.

El alto contenido de electrolitos permite la

transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el
pH estable durante el paso de la corriente; este
campo se produce dentro de una solución
amortiguadora en la que se sumerge el gel que
contiene las muestras.

Figura 01:
Cámaras de electroforesis
 CÁMARA DE
ELECTROFORESIS
La cámara tiene dos polos conectados a una
fuente de energía.

- El polo positivo de las cámaras de

electroforesis verticales se encuentra en la
parte inferior de la cámara, mientras que las
cámaras de electroforesis horizontales se
encuentran en uno de sus extremos.

El polo positivo de la cámara se identifica con un

color rojo y el polo negativo con un color negro.

Figura 02:
Cámaras de electroforesis
 GEL
● Para evitar cualquier alteración mecánica durante el proceso de separación, la
muestra debe colocarse en un soporte adecuado.

● Por lo general, este soporte es un gel semisólido o gelatinoso formado por

polímeros que forman estructuras en forma de microporos o malla
tridimensionales.

● Estos poros permiten que las moléculas avancen a través de ellos de acuerdo
con su peso molecular, lo que facilita la separación por tamaño de los distintos
componentes de la muestra.

● Los geles se pueden fabricar con agarosa o poliacrilamida.

● Para la separación de ácidos nucleicos, se utilizan geles de acrilamida o

agarosa, mientras que para la separación de proteínas, se utiliza acrilamida en
su totalidad.
 a. Gel de Agarosa
● La agarosa, un polisacárido derivado de algas marinas, tiene la peculiaridad de
permanecer sólida a temperatura ambiente, disolverse fácilmente entre 50 y
60°C, y formar un gel altamente poroso al enfriarse.

● Para preparar el gel, se disuelve la agarosa en una solución amortiguadora

similar al buffer de corrimiento y se calienta hasta que se vuelva líquida; luego,
se vierte rápidamente en un molde rectangular y se inserta un peine en uno
de los extremos para crear los pocillos donde se colocarán las muestras.

● La agarosa presenta ventajas sobre la acrilamida al no ser tóxica y permitir el

análisis de ácidos nucleicos de diferentes pesos moleculares según su
concentración.

● Sin embargo, su capacidad de resolución es menor que la de la poliacrilamida.

 a. Gel de Agarosa

● La concentración de agarosa se elige en función del tamaño del ácido nucleico

a analizar.

● La densidad de poros en el gel varía con la concentración de agarosa, siendo

inversamente proporcional al tamaño del poro:

➢ a mayor concentración, menor tamaño de poro y viceversa.

● Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos de mayor peso molecular migran

más lentamente debido a la dificultad para atravesar los poros de agarosa.
 a. Gel de Agarosa

● La migración de ácidos nucleicos no lineales, como plásmidos circulares o ARN

con estructuras secundarias, depende no solo del peso molecular, sino
también del grado de compactación de la molécula.

● Por lo tanto, es importante desnaturalizar la muestra para eliminar las

estructuras secundarias antes de la electroforesis.

● La concentración más comúnmente utilizada de agarosa para la electroforesis

de ácidos nucleicos oscila entre el 0.5% y el 2%.
 a. Gel de Agarosa

Figura 05:
Perfil electroforético de un
plásmido.

Figura 03:
Preparación de un gel de
agarosa.
Figura 04:
Electroforesis de ácidos
nucleicos.
 b. Gel de Acrilamida
● La acrilamida es un polímero sintético termoestable, sin color y químicamente
inerte, que permite la creación de geles con una amplia gama de tamaños de
poro.

● El gel de poliacrilamida se forma mediante la polimerización química de una

mezcla de acrilamida y bisacrilamida, siendo el tamaño de poro determinado
por la concentración total de acrilamida presente.

● La relación típica entre acrilamida y bisacrilamida es de 19:1, y variando su

concentración y proporción se pueden obtener diferentes porosidades,
siempre menores que las de los geles de agarosa.
 b. Gel de Acrilamida
● En disolución acuosa, la acrilamida experimenta una polimerización
espontánea y lenta, pero en presencia de un sistema generador de radicales
libres se produce una polimerización vinílica, formando polímeros de cadena
larga.

● La bisacrilamida, compuesta por dos moléculas de poliacrilamida enlazadas,

se polimeriza junto con la acrilamida y crea puentes entre las cadenas lineales,
permitiendo la formación del gel.

● La acrilamida es una neurotoxina y debe manejarse con precaución,

almacenando en condiciones adecuadas para prevenir la autopolimerización y
la hidrólisis.
 b. Gel de Acrilamida

● Los geles de acrilamida son capaces de soportar altos voltajes, se pueden teñir
de varias maneras y pueden digerirse o desecarse para su análisis posterior.

● La electroforesis con geles de acrilamida se realiza generalmente en cámaras

verticales.

● En la electroforesis de proteínas, se utilizan geles de acrilamida de dos capas

con diferentes concentraciones, uno para la concentración y otro para la
separación.
 b. Gel de Acrilamida

● Las proteínas se separan en el gel de

resolución según su tamaño,
dependiendo del porcentaje de
acrilamida utilizado en su preparación.

● La adición de SDS a los geles de

poliacrilamida es opcional, pero ayuda a
mantener las proteínas en estado
extendido, facilitando su movilidad
electroforética a través del gel.

Figura 06:
Electroforesis de proteínas
 BUFFER DE CORRIMIENTO
● El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con
el que se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida.

● Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y

mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento.

● En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE como buffer
de corrimiento.
❖ El buffer TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un
pH de 7.2.
❖ El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5.

● El buffer de corrimiento de electroforesis de proteínas lleva Tris, 25 mM, SDS al

1% y glicina, 192 mM, a un pH 8.3.
 MARCADOR DE PESO MOLECULAR
Figura 07:
Son moléculas de ADN o de proteínas que Marcadores de peso molecular
permiten determinar por comparación el tamaño para ADN
de los fragmentos de ácidos nucleicos o
proteínas contenidos en las muestras sometidas a
electroforesis.

En el caso de marcadores de peso molecular de

ácidos nucleicos, éstos pueden ser fagos o
plásmidos sometidos a corte con enzimas de
restricción que generan fragmentos de tamaño;
también puede tratarse de moléculas de ADN
sintéticas denominadas escaleras, porque
contienen fragmentos con incrementos de
tamaño gradual.
 BUFFER DE CARGA

Este amortiguador tiene como fin brindar peso, Figura 08:

densidad y color a la muestra, lo que facilita su Buffer de carga para ADN
depósito en el pocillo y evita su salida del gel;
permite, además, monitorear el corrimiento de la
muestra en el gel.

Se emplea en relación 1:3 para ácidos nucleicos o

1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de
muestra.
 TRANSILUMINADOR ULTRAVIOLETA
El transiluminador transmite luz del espectro Figura 09:
ultravioleta a través de la muestra, excitando la Transiluminador ultravioleta
molécula cromogénica que emite energía
fluorescente que permite visualizarla.

En general emiten energía a una longitud de onda

a 302 nm, aunque también existen para 254 y 365
nm; y suelen contar con un botón para baja/ alta
intensidades por si se requiere una menor
exposición de la muestra a la luz ultravioleta
 02

2022
ELECTROFORESIS
HORIZONTAL Y VERTICAL
 ELECTROFORESIS HORIZONTAL
Figura 10:
Se lleva a cabo con gel de agarosa para ácidos
Electroforesis submarina
nucleicos.

Una vez cargada la muestra, se corre por unos

minutos a bajo voltaje hasta que la muestra entre
en el gel y entonces se cubre del todo con el
buffer de corrimiento
 ELECTROFORESIS VERTICAL
Figura 11:
Empleada exclusivamente con gel de Electroforesis vertical
poliacrilamida, se utiliza para proteínas o ácidos
nucleicos de pequeño tamaño.

El gel debe estar contenido entre dos placas

rectangulares de vidrio donde la corriente eléctrica
se genera gracias al buffer en el que se encuentra
embebido el gel y llena las cubetas o
compartimientos del ánodo y el cátodo
 03

2022
PROCEDIMIENTO

ABOUT DNA DAY

GENERAL DE UNA
ELECTROFORESIS
Electroforesis de ácidos nucleicos y proteínas
 Procedimiento general

Preparación del Corrida

01 gel 04 electroforética

Preparación de las
02 muestras 05 Visualización

Cargar muestra Análisis de

03 en gel 06 resultados
 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA

MATERIALES: PREPARACIÓN:

- Cámara de 1. Licuar agarosa y enfriar hasta

electroforesis (50-60°C).
horizontal y 2. Añadir agarosa
accesorios. (20-25ml)asegurando tener los
- Agarosa. peines insertados, dejar enfriar
- Buffer TAE 50X. por 20 min.
3. Añadir Buffer de electroforesis
TAE 1X entre 0,3 y 1 cm.
4. Colocar las muestras.
 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
ELECTROFORESIS DE ADN

MATERIALES:

- Cámara de electroforesis (gel)

- Fuente de poder
- Buffer de solución stock ADN TAE 50X
- Buffer de la muestra para ADN
- Gradilla para tubos de 1,5 mL
- Micropipetas y puntas de 20 µL
- Envase para descarte de puntas y
lámina extensible de parafina.
 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
PREPARACIÓN:

1. Mezclar 5 volúmenes de solución (ADN) con

buffer de muestra 6X.
Para la mezcla añadir un volumen de buffer de
muestra, repartidos en alícuotas sobre lámina
de parafina. Añadir 5 volúmenes de cada una
de las muestras de ADN sobre las alícuotas y
mezclar.
2. Cargar la muestra
3. Considerar marcador estándar de ADN para
medir peso molecular
4. Colocar muestras en los pocillos, cubrir y
conectar los cables correspondientes.
 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
PREPARACIÓN:

1. Encender fuente de poder y proceder

a seleccionar el voltaje adecuado.
2. Aplicar voltaje de acuerdo al peso
molecular de ADN que se va a separar.
3. Calibrar el tiempo de acuerdo a la
posición por los indicadores (azul de
bromofenol y xilencianol) en la matriz
de agarosa.
4. Luego de seleccionar las condiciones
de voltaje iniciar la electroforesis.
5. Detener la electroforesis
6. Finalizada, procede el desmontaje
 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Visualización del ADN

MATERIALES:

- Bromuro de etidio
- Transiluminador
- Guantes
- Agua destilada

El bromuro de etidio se intercala

entre las bases del ADN y
posteriormente fluoresce frente a
los rayos UV.
 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

PROCEDIMIENTO:

1. Sumergir el gel de agarosa en un envase de

teflón conteniendo bromuro de etidio a una
concentración de 1µg/mL y dejar incubando por 5
minutos en reposo.
2. Devolver la solución de bromuro de etidio y lavar
el gel cuidadosamente con abundante agua.
3. Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se
encuentre un transiluminador de luz UV.
4. Depositar el gel cuidadosamente sobre la
pantalla del transiluminador.
5. Visualizar el ADN
 ELECTROFORESIS DE LAS PROTEÍNAS
Se lleva a cabo en un sistema GEL = Conformado por 2
discontinuo geles de poliacrilamida

GEL ELECTROFORESIS
Unidos pero limitados por una La acrilamida se prepara a partir de
fase de separación una solución al 30% de
acrilamida-bisacrilamida:

GEL ACRILAMIDA ● Mezclar con el buffer

correspondiente y una solución
Usado en Ácidos nucleicos sólo
de SDS
se tiene una fase ( gel de
● Añadir persulfato de amonio
resolucion)
(POLIMERIZADOR)
 ELECTROFORESIS DE LAS PROTEÍNAS
Genera radicales libres, Se forma entre dos
GEL DE
APS por lo que es un vidrios, y el sistema
iniciador de la reacción ACRILAMIDA completo se sumerge en
de polimerización que el buffer de corrimiento
finalmente forma el gel. dentro de la cámara
vertical de electroforesis.

Funciona como otro

TEMED iniciador de
polimerización.
 ELECTROFORESIS DE LAS PROTEÍNAS
SUMERGIR 1 3 COLOCACIÓN DE MUESTRAS
Poner los geles en el tanque,
considerar que los pocillos del gel 4 ● Colocar las muestras en cada
estén cubiertos por el buffer 1 pocillo de gel.
● Conectar los cables de los
2 electrodos a la fuente de energía,
con la selección del voltaje.
MUESTRA DE PROTEÍNA 2 - Para el cálculo del voltaje es
5 importante conocer la
se realiza una reacción
distancia en centímetros del
fisicoquímica, en la que se rompen
gel desde la parte superior
enlaces peptídicos y puentes
hasta la inferior.
disulfuro
La electroforesis se realiza hasta que
● La muestra mezclada con el 3 6 el colorante se vea como una línea
buffer de carga se deposita
azul haya llegado al límite de la parte
con cuidado en los pocillos
inferior del gel
 VISUALIZACIÓN DE LAS MUESTRAS
El gel se sumerge en un recipiente conteniendo el colorante azul brillante de
Coomasie y se incuba por unos minutos, lo que permitirá la visualización de las
bandas de proteínas

La tinción de La tinción con plata

Coomassie Blue La tinción con plata
incrementa este consiste en
clásica, desarrollar el color
normalmente puede límite de sensibilidad
en el gel por
detectar bandas de unas 50 veces incubación
proteína de 50 ng

Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y todas las proteínas tienen
características distintas de tinción. Algunas veces, el gel se seca para conservarlo
 04

2022
ABOUT DNA DAY
APLICACIONES DE
LA ELECTROFORESIS
Algunos de los usos de la electroforesis para
ácidos nucleicos
 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS
Ácidos nucleicos en geles La electroforesis puede ser un proceso previo a las
técnicas de hibridación, como
de agarosa

Determinar los tamaños Southern blot (ADN) o el Northern blot (ARN)

moleculares de los ácidos
nucleicos

analizar los fragmentos La presencia de determinada secuencia del ácido

cortados con enzimas de nucleico en una mezcla de moléculas se distingue por
restricción su tamaño, la cual se confirma por hibridación con
una sonda específica

comparar los tamaños de

distintos tipos de ADN

Aislar, recuperar fragmentos

de ADN purificados, y analizar
productos de PCR
 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS
PROTEINAS
La electroforesis es
crucial en técnicas
como la secuenciación, se puede deducir la
La electroforesis se secuencia del
aplica para la donde tras un
corrimiento segmento de ácido
identificación de nucleico
electroforético de las
fracciones proteicas
cuatro reacciones de
o proteínas elongación con los
particulares por dideoxinucleótidos
tamaño

Los termocicladores en tiempo real basan la detección de los fragmentos amplificados en

una electroforesis capilar, donde es posible la detección inmediata de los segmentos
amplificados.
GRACIAS