Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida

Objetivos
1. Conocer los principios básicos de la técnica de electroforesis y su aplicación en el análisis
de proteínas.
2. Realizar una electroforesis para separar las proteínas presentes en el extracto de levadura.
3. Determinación del peso molecular de las proteínas en estudio

Introducción
La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comúnmente
denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin
duda una de las técnicas más utilizadas en la caracterización de mezclas complejas de proteínas.
La electroforesis PAGE es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues
se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína para su análisis.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga
un pH diferente al de su punto isoeléctrico y es por eso que tienen la propiedad de desplazarse
cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación
entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida
será la migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en
una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (carga
total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de
poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su
seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas.
Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes,
transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica.
Algunas características destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son :
Las geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción
de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador
y un catalizador. Como iniciador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-
tetrametilnediamina) y como catalizador el ión persulfato (S2O8-) que se añade en forma
de persulfato amónico.
Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxígeno es un inhibidor de la
polimerización. Además, durante la polimerización se libera calor que podría provocar la
formación de burbujas en el seno del gel.
La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato
(catalizador) y del TEMED (iniciador).
La porosidad de la gel determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-
acrilamida, siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use.
El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel.
Habitualmente los geles se denominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida que
contienen. Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a 10%. Un
menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran
tamaño.

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 1
En función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso
electroforético éstas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes.
Electroforesis desnaturalizante: la más común de las electroforesis y se caracteriza por
la desnaturalización completa de la proteína (pérdida de la estructura tridimensional). La
migración de las proteínas es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no
a su forma. El agente desnaturalizante más empleado es el sodiododecilsulfato o SDS, un
detergente.
Electroforesis nativa: es la que somete a las proteínas a una migración sin la
desnaturalización. En la Electroforesis nativa las proteínas migran en función de su carga,
de su tamaño y de su forma. Además se mantienen en ciertos casos las interacciones entre
subunidades y entre proteínas, separándose los complejos. Los sistemas “buffer”
empleados en estos caso son: tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH
7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

La electroforesis en geles de acrilamida se puede realizar empleando sistemas de uno o

más “buffers”, en estos casos se habla de sistemas “buffers” continuos o discontinuos. En los
sistemas discontinuos el “buffers” asegura la migración de todas las proteínas en el frente de
migración, provocándose la acumulación de todas las que se han cargado en el pocillo. La
separación realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migración alcanza la
frontera del segundo “buffers”. En el esquema se muestran los componentes en la gel de
acrilamida. El primer gel ('stacking') es de mayor poro (menor porcentaje de
acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que el segundo gel (“resolving”) que es el
que realmente separa las proteínas. Este sistema es especialmente adecuado para analizar
muestras diluidas sin perder resolución. En el segundo esquema se ilustra cómo se descarga la
muestra, el proceso de desnaturalización de la proteína y la migración en el gel de PAGE

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 2
 SDS-PAGE es la electroforesis de proteínas más ampliamente utilizada. Su nombre
significa la electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS ('SDS-
polyacrilamide gel electrophoresis'). Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la
que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-
mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS que desnaturaliza y recubre a la
proteína con cargas netas negativas), y se separan como cadenas polipeptídicas aisladas.
En general se emplean sistemas de dos “buffers” (discontinuos). Este sistema permite la
separación de volúmenes relativamente grandes de muestra sin pérdida de resolución. La
concentración se produce por isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking'). El efecto
de estrechamiento de las bandas se basa en el hecho de que los iones glicinato, relativemente
cargados negativamente (en el depósito de tampón superior) tienen una movilidad electroforética
inferior que los complejos de proteínas-SDS que a su vez tienen menor movilidad que los iones
Cl- de los “buffers” de carga en el gel de apilamiento ('stacking'). Cuando se conecta la
diferencia de potencial todas las especies han de migrar a la misma velocidad para mantener el
circuito eléctrico. Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma velocidad que los
iones Cl- si hay una región de 'field strenght'. 'Field strenght' es inversamente proporcional a la
conductividad que es a su vez proporcional a la concentración, El resultado es que las tres
especies de interés ajustan sus concentraciones de forma que [Cl-] > [proteína-SDS] >
[glicinato]. Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS las tres se concentran en
una banda muy delgada entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato. Cuando el
glicinato alcanza el borde del gel de separación adquiere una mayor carga en el nuevo medio,
con un pH superior, e incrementa su movilidad. A partir de ese momento la interfase entre el
glicinato y el Cl- deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se desplazarán a su propia
velocidad.

SDS es un detergente de acción desnaturalizante que se une a las cadenas polipeptídicas

desnaturalizadas con una relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, uniéndose
aproximadamente una molécula de SDS por cada dos aminoácidos de la cadena. Esta unión
masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de proteína y le confiere al
complejo una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las proteínas
acomplejadas con SDS viajen hacia el ánodo. La separación de los complejos SDS-proteína es
proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas tienen la misma carga por unidad de masa.

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 3
Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación
con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en
los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

DETERMINACION DEL PESO MOLECULAR

La SDS-PAGE se usa, como ilustraremos en la presente práctica, para determinar el peso
molecular de proteínas. Para ello se compara el Rf de la proteína problema con el de proteínas de
referencia cuyo peso molecular se conoce. Recordemos que el Rf es el parámetro experimental asociado a
esta técnica, y se define como:

El frente del gel se determina por la posición de un compuesto de referencia de movilidad

máxima, como puede ser el colorante azul de bromofenol. El procedimiento se explica detalladamente en
la sección de resultados

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 4
 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida

PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA:
En la presente práctica se van a preparar mini-geles de 0,75 mm de espesor. Las cantidades
indicadas para la preparación de las soluciones en el anexo corresponden a la preparación de dos geles.
Cada uno de ellos consta de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm de longitud que contiene los
pocillos para cargar las muestras, y un gel separador de aproximadamente 6 cm. En la figura 4, se ilustra
el montaje del sistema de electroforesis, la preparación de los geles y el procedimiento a seguir.

PREPARACION DEL GEL SEPARADOR AL 13%

Se mezcla en un matraz (capacidad aproximada de 100 mL) los componentes en el orden que se
indica en el anexo I. 2. Con cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se añade la mezcla en el interior del
molde hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma que quede
suficiente espacio para el gel concentrador (se debe calcular 1 cm más de la longitud de los pocillos del
peine) (Fig 4, c). A continuación, usando una pipeta limpia, se cubre la superficie del gel con isobutanol,
isopropanol o agua destilada. Esto previene el contacto del oxígeno con el gel que inhibe la reacción de
polimerización (Fig 4, d). La polimerización del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.

PREPARACION DEL GEL CONCENTRADOR AL 3%

Se elimina el alcohol que cubre el gel separador, y se lava la parte superior del gel 2-3 veces con
agua destilada para eliminar cualquier residuo de acrilamida no polimerizada. Se seca el líquido restante
en la parte de superior del gel con papel de filtro con cuidado de no dañar el gel. Se mezclan en un matraz
los componentes en el orden indicado en el anexo2. Utilizando una pipeta Pasteur, se introduce la
solución directamente sobre la superficie del gel separador (Fig 4, e). Inmediatamente se inserta el peine
en la solución concentradora con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire (Fig 4, f). Se espera
hasta que el gel haya polimerizado (aproximadamente 30 minutos). Se retira el peine cuidadosamente con
un movimiento vertical (Fig 4., g). Usando una botella de lavado, se enjuagan los pocillos 2-3 veces con
agua destilada para eliminar cualquier resto de acrilamida.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:

1. Considerando la concentración de proteínas previamente determinada. Calcular cuántos µl de su

muestra necesita para tener 15µg de proteínas
2. Calcule cuantos µl de Loading Buffer 4X necesita para una concentración final de 1X
3. En un microtubo combine los µl calculados previamente de proteínas y Loading buffer
4. Calentar en un termobloque a 100ºC durante 5 minutos.

ELECTROFORESIS:

1. Se insertan las placas con los geles polimerizados en la unidad de electroforesis tal como se
indica en la Figura 4 (h,i). Se prepara el tampón de electroforesis a partir de la solución
concentrada (ver anexo) y se añade en los reservorios interior y exterior (Fig 4, j). Se retiran,
si las hubiera, las burbujas de aire y restos de acrilamida del interior de los pocillos,
introduciendo tampón de electroforesis en los mismos.
Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD
Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 5
 2. Se aplican las muestras con ayuda de una micropipeta P-20 (hasta 20 µl) en los pocillos, en
un orden predeterminado y previamente anotado (Fig 4, k). No se olvide añadir, en un carril,
la solución de proteínas estándar, de peso molecular conocido.
3. Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la fuente de alimentación y se
aplica corriente eléctrica. La corriente eléctrica recomendada para geles de 0,75 mm de
grosor es un voltaje constante de 100-200V (Fig 4, l,m,n).
4. La duración aproximada del proceso es de 40-45 minutos. Una vez acabada la electroforesis,
cuando el frente de azul de bromofenol alcanza la parte inferior del gel, se desconecta la fuente de
alimentación, retirándose los electrodos y sacando los geles de la cubeta de electroforesis. Estos
se depositan en la mesa de trabajo (Fig 4, ñ).
5. Se sacan los geles de acrilamida del interior del molde, separando cuidadosamente con ayuda de
una espátula ambos cristales (Fig 4, p). Se elimina el gel concentrador (Fig 4, q) y se hace una
muesca al gel en una de las esquinas para orientar la posición de las muestras (por ejemplo en la
esquina inferior contraria al patrón de proteínas).

Figura 4. Desarrollo de la práctica. Material de electroforesis vertical (a); montaje del sistema (b); Preparación
del gel separador (c,d) y concentrador (e-g); electroforesis (h-ñ); tinción del gel (o-s)

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 6
REVELADO:
Las bandas de proteínas, una vez terminada la electroforesis, se visualizan tiñendo los geles con
una solución de azul de coomasie. La tinción se realiza con agitación suave durante, al menos, 30
min.
1. Se trasfiere el gel de la placa de vidrio a un recipiente que contiene la solución de tinción de
coomassie (anexo; Fig 4, r). Se deja el gel en agitación suave con suficiente volumen de esta
solución a temperatura ambiente durante 1 hora. (Fig 4., s)
2. Se elimina la solución de tinción con una pipeta y se conserva para futuras tinciones. Se
añade solución decolorante (anexo) y se incuba en agitación para eliminar el exceso de
coloración hasta que sólo queden teñidas de azul las proteínas, cambiando la solución
decolorante tantas veces como sea necesario. El gel puede estar en esta solución toda la
noche pero se pueden empezar a observar las proteínas en 20 minutos.
3. Se elimina la solución de desteñido y se añade agua destilada. Los geles pueden conservarse
de esta forma durante largos periodos de tiempo de forma casi indefinida a 4ºC.

RESULTADOS

1. Mida y anote la distancia recorrida por el frente del gel (Df), y por cada una de las proteínas
estándar (Dp). Calcula el correspondiente valor de Rf para cada una de ellas y anótalo en una
tabla.

2. Calcula el peso molecular de las proteínas

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 7
ANEXO: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLÓGICO EMPLEADO

NOTA: Una vez preparadas las soluciones, éstas se almacenan en botellas de cristal y se mantienen a 4ºC,
salvo que se indique lo contrario.

Soluciones para SDS-PAGE

1. Solución “Buffer” para el gel separador Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8.

2. Solución “Buffer” Tampón para el gel concentrador Tris-HCl 0,5M, pH 6,8.

3. SDS al 10% (peso/volumen)a:

4. Persulfato amónico (APS) al 10%

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 8
5. Gel separador al 13% de acrilamida en tampón Tris-H-Cl 0,375 M, pH 8,8

6. Gel concentrador al 3% de acrilamida en tampón Tris-H-Cl 0,125 M, pH 6,8

7. Tampón de electroforesis Tris-Glicina pH 8,3.

Nota: la solución está concentrada 10 veces y antes de utilizarla hay que diluirla 10 veces, como
se indica.

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 9
 8. Loading Buffer 4x
a. 0.55M Tris-HCl pH6.8-------------3ml
b. SDS 8%------------------------------0.4g
c. Beta-mercaptoetanol------------------0.5ml
d. Glicerol 30%------------------------1.5ml
e. Bromofenol azul 0.02%-----------0.0025g

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm#Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida

2. Hames BD, Ricwood D (2002): “Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach”, 3ª ed.
Oxford University Press. Excelente libro que explica en detalle desde un punto de vista práctico los
protocolos de separación electroforéticas de proteínas.
3. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage
T4. Nature 227: 680-685. Descripción del método SDS-PAGE.
4. Nelson DL, Cox MM (2001). “Principios de Bioquímica”, 3ª ed. Omega (Barcelona, España). Libro
básico de bioquímica.
5. Westermeier R (2001): “Electrophoresis in Practise”, 3ª ed. WILEY-VCH Verlag GmbH (Weinheim,
Alemania). Explica en detalle los métodos de separación electroforéticas. Consultar los capítulos que
hacen referencia a SDS-PAGE

Modificado por: Olgary Figueroa Santiago, PhD

Revisado por Edwin Vázquez, PhD Page 10