Bitacora 11

Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnología
Laboratorio de Biotecnología Molecular
Profesoras:
Flor Selene Villalobos Escobedo
Aida Margarita Zamora Contreras
Bitácora: Práctica 11: “Expresión de proteínas

recombinantes y detección por Inmunodetección en estado
sólido (Western blot)”
Alumno: Cano Pérez Jeimy Melanie
Equipo: 5
Fecha de entrega: 16/12/2022

Objetivos:
Generales
 Realizar la técnica de Western blot para detección de proteína mediante la reacción
antígeno-anticuerpo.
Específicos
 Realizar electroforesis en gel de poliacrilamida.
 Realizar una electrotransferencia.
 Detectar proteínas por medio de un inmunoensayo.
Tabla de reactivos
Tabla 1. Función de reactivos Práctica 11
Reactivo Función
Gel separador Separa las proteínas, posee mayor concentración de Acrilamida
(10%) y pH más básico (8.8). Ofrece mayor resistencia en la
corrida.
Gel concentrador Posee baja concentración de acrilamida (4%) en tampón
ligeramente ácido (Tris/HCl 1M pH 6,8). Ofrece poca
resistencia a la mezcla de proteínas sometidas a electroforesis
por tanto lo atraviesan con relativa rapidez. Concentra la mezcla
Sol. Acrilamida – Se realiza una polimerización química de una mezcla de acrilamida y
bisacrilamida bisacrilamida. La acrilamida forma polímeros lineales pero la
bisacrilamida introduce uniones cruzadas entre las cadenas de
poliacrilamida, generando la malla, matriz o red tridimensional del
gel. Regulando la concentración de ambos tipos de monómero y su
proporción se consiguen distintas porosidades.
Persulfato de amonio Se trata de un compuesto que se descompone de forma espontánea
generando radicales libres, los cuales junto con el TEMED inician la
reacción de polimerización química de la mezcla de acrilamida y
bisacrilamida.
TEMED La tetrametiletilenodiamina (TEMED) acelera la reacción de
polimerización de la acrilamida, pues propaga la generación de
radicales libres.
SDS El dodecilsulfato sódico es un detergente aniónico que se une a las
proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida
recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el tamaño de la
molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en
aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del
SDS que la recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo
tanto, la movilidad electroforética de la proteína depende
exclusivamente de su masa molecular.
Tris Se trata de un compuesto muy utilizado en el laboratorio para
preparar disoluciones tampón; el grupo ácido-base que ejerce el
tamponamiento es el amino. Se comercializa en sus formas básica
("Tris base") y ácida ("Tris hidrocloruro"), aunque la primera es la de
uso más común. En la electroforesis, es el agente tamponante que
mantiene el pH. Se incluye tanto en el gel como en el tampón de
cubeta.
Azul de bromofenol Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para
comprobar el progreso de la electroforesis.
β-mercaptoetanol Este compuesto actúa como agente reductor de enlaces disulfuro.
Facilita así la desnturalización completa y el desplegado de las
moléculas de proteína. Además, se separarán las subunidades de la
proteína si es que los disulfuro las mantenían unidas.
Metodología
Sol. stock (mL) / 5 6 7 8 9 10 12 13 15
Conc. gel (%)
Sol. Acrilamida – 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5
bisacrilamida
Amortiguador pH 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
8.8
Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75
Persulfato de 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
amonio
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Tabla 2. Gel separador para un volumen de 15ml
Sol. Acrilamida – bisacrilamida 0.26ml

Amortiguador pH 6.8 0.5ml
Agua desionizada 1.22ml
Persulfato de amonio 0.01ml
TEMED 0.02ml
Tabla 3. Gel concentrador para un volumen de 2ml
Cuestionario
1. ¿Cuál es la ventaja e importancia de los inmunoensayos?
Un inmunoensayo es una prueba química que se utiliza para detectar o cuantificar
una sustancia específica mediante una reacción inmunológica. Debido al uso de
anticuerpos y antígenos purificados, los inmunoensayos son muy sensibles y
específicos. El principio detrás de la prueba de inmunoensayo es el uso de un
anticuerpo que se unirá específicamente al antígeno de interés. Los inmunoensayos
pueden detectar antígenos de interés en concentraciones muy bajas que no pueden
medirse mediante pruebas estándar. Los inmunoensayos son generalmente rápidos y
específicos, lo que permite a un médico diagnosticar de manera rápida y precisa una
variedad de enfermedades como la diabetes, el cáncer y las enfermedades cardíacas.
2. ¿Qué ventaja tiene la expresión de proteínas recombinantes de manera
constitutiva o de manera inducible?
 Operones de expresión constitutiva: Son aquellos que se transcriben
permanentemente, independientemente de las condiciones ambientales. Por
ejemplo, operones para las ADN- y ARN-polimerasas; operones para las
proteínas de las cadenas transportadoras de electrones; operones para las
proteínas ribosómicas, etc.
 Los genes inducibles son aquellos en los que la presencia de una sustancia
(un inductor) en el medio ambiente, enciende la expresión de uno o más
genes (genes estructurales) involucrados en el metabolismo de tal sustancia
ejemplos: la lactosa induce la expresión de los genes del operon lac.
3. ¿Qué información proporciona el Western blot que el ELISA no?
Un Wester blot se debe realizar cuando:
 Se cuenta con un reducido número de muestras.
 Se requiere determinar el peso molecular de la proteína.
 Se requiere observar cambios en el peso molecular debido a modificaciones
postraduccionales.
 Se requiere estudiar la degradación de una proteína para determinar la
calidad de una muestra.
 El anticuerpo que se vaya a utilizar solo reconozca epítopos lineales, y por lo
tanto la proteína deba estar desnaturalizada para que pueda identificarlos.
 Existen dudas sobre la especificidad del anticuerpo y se requiere confirmar
que no reconocerá otras bandas diferentes a la que se corresponda con el
peso molecular de la proteína diana.
 El tiempo no es un factor limitante.
4. ¿Por qué para proteínas se prefieren los geles de poliacrilamida sobre los de
agarosa? ¿Qué ventajas y desventajas tienen unos y otros geles?
La electroforesis en geles de poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitación en
cuanto al tamaño de los fragmentos que podemos separar (5-600 pb), posee un
poder de resolución mucho mayor, permitiendo la separación de moléculas que
difieren en un sólo par de bases. Los geles de poliacrilamida se corren de forma
vertical y tienen la desventaja de ser más complicados en su elaboración y
manipulación. La agarosa posee ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un
compuesto tóxico y permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos
moleculares variados, según la concentración de agarosa que se emplee. Sin
embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida.
5. ¿Por qué es necesario transferir las proteínas a una membrana en lugar de
hacer la inmunotransferencia sobre el gel?
Después de la electroforesis en gel se transfieren las proteínas a otra superficie. Esto
se debe a que los geles son un sustrato pobre para la inmunodetección y debido a la
fragilidad de estos pueden romperse fácilmente. Por lo tanto, se realiza la
transferencia de la proteína a una membrana más duradera para la posterior
inmunotinción. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las
proteínas, permitiendo así la detección de un anticuerpo.
6. ¿Qué tipos de membranas pueden emplearse para la transferencia? ¿Qué
ventajas y desventajas tienen?
Las membranas pueden ser de polifluoruro de vinilideno (PVDF) o nitrocelulosa.
Cada una tiene diferentes características, por un lado, la membrana de PVDF ofrece
una mayor resistencia mecánica, resistencia al SDS y una mayor unión que la
nitrocelulosa; mientras que la membrana de nitrocelulosa tiene la ventaja de
proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con
metanol.
7. ¿Por qué es importante bloquear la membrana tras la transferencia de las
proteínas del gel?
El primer paso en el procedimiento de inmunotinción es bloquear el espacio vacío
en la membrana con una proteína neutral. Esto es importante porque la membrana es
una superficie adherente para todas las proteínas, por lo que un anticuerpo libre
podría unirse no específicamente a la membrana expuesta. Para esto se incuba con
una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo.
A menudo, son soluciones a base de proteínas, como la leche descremada en polvo
o la albúmina de suero bovino (BSA). Las proteínas en la leche o el BSA se unen a
la membrana para cubrir los espacios libres, para que el anticuerpo no se adhiera a
estas áreas más adelante.
8. Además de las enzimas ¿Qué otras señales pueden emplearse para la
detección? ¿Qué ventajas y desventajas tiene cada tipo?
 Detección radioactiva: Este tipo de detección fue uno de los primeros
métodos utilizados para revelar los resultados del Western blot mediante el
marcaje de los anticuerpos con conjugados radioactivos, la principal ventaja
que presenta radica en su sensibilidad, pero tiene el gran inconveniente de
que al utilizar materiales radioactivos existe el riesgo de seguridad y la salud
del investigador, además de que es una técnica de elevado costo y su
ejecución requiere mucho tiempo.
 Detección fluorescente: Se basa en el uso de anticuerpos secundarios
conjugados a fluoróforos que producen señal por ellos mismos, sin la
necesidad de añadir ningún sustrato adicional. Entre las ventajas esta que la
señal es más estable que la producida por los métodos de detección
enzimática, además la posibilidad de utilizar anticuerpos marcados con
fluoróforos con longitudes de onda de emisión diferentes en una misma
membrana de Western blot permite multiplexar los experimentos, también
esta técnica permite cuantificar la proteína presente en la muestra. Entre sus
desventajas es que tiene una menor sensibilidad que la detección enzimática
y se necesita equipamiento especializado.
9. ¿Qué ventajas y desventajas presenta el empleo de un segundo anticuerpo para
la detección?
La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos,
cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Los métodos directos utilizan un
anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable, como una enzima, biotina
o molécula fluorescente. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos; un
anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer
anticuerpo. En la detección indirecta, es el anticuerpo secundario el que está
conjugado con un marcaje detectable. Esta última es la forma más utilizada debido a
la amplificación de la señal que produce.
10. Este sistema emplea SDS-PAGE, un sistema en condiciones desnaturalizantes.
¿Qué inconveniente representa esto y qué otras opciones existen?
El SDS es un detergente que desnaturaliza estructuras secundarias y estructuras
terciarias no enlazadas con disulfuro y las reviste con una carga negativa que se
correlaciona con su longitud, permitiendo que los pesos moleculares sean
estimados. La movilidad a través del gel puede verse afectada por el estado de la
proteína (por ejemplo, fosforilación y presencia de moléculas multiméricas). En
ocasiones hay anticuerpos, que reconocen no solo una secuencia definida de la
proteína, sino también, la configuración que esta tiene en el espacio. En tal caso, en
la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de muestra. En esta
situación, también conocida como PAGE nativo, las proteínas mantienen su
estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su relación masa:
carga de la proteína por encima de su tamaño. Sin embargo, la mayoría de ensayos
Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes.
Referencias
Tabla de reactivos: Reactivos empleados en la electroforesis de DNA y de proteínas. (s/f).
Biomodel. Recuperado de: https://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos.htm
Pregunta 1: ¿Qué son los Inmunoensayos? (s/f). Diagnóstico Oportuno. Recuperado de:
https://www.diagnosticorapido.mx/que-son-los-inmunoensayos/
Pregunta 2: Regulación génica. (2006). Recuperado de:
https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/15regulacion.htm
Pregunta 3: Abyntek. (2017). Wester blot o ELISA, ¿Cómo elegir? Abyntek. Recuperado
de: https://www.abyntek.com/western-blot-o-elisa-como-elegir/
Pregunta 4: Fierro, F. (2014). Electroforesis de ADN. En Herramientas moleculares
aplicadas en ecología: Aspectos teóricos y prácticos (pp. 27–53). INECC. Recuperado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/electroforesis.pdf
Pregunta 5: Torrealba, C. (2019). Introducción a Western blot. AllScience. Recuperado
de: https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot
Pregunta 8: Abyntek. (2020). Métodos de detección para Wester blot. Abyntek.
Recuperado de: https://www.abyntek.com/western-blot-o-elisa-como-elegir/

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Alumno: Cano Pérez Jeimy Melanie

Fecha de entrega: 16/12/2022

Sol. Acrilamida – bisacrilamida 0.26ml

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