“AÑO DE LA UNIDAD, LA PAZ Y EL DESARROLLO”

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS.

ESCUELA DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS.

TÍTULO:
INVESTIGACIÓN FORMATIVA
ANALISIS POR INSTRUMENTACIÓN APLICADOS AL YOGURT

ASIGNATURA:

ANÁLISIS DE ALIMENTOS POR INSTRUMENTACIÓN

INTEGRANTES:
ACUY DIAZ ADRIANA CLARIBEL
ARANA TELLO ROSA ISIS
CANAYO EMMA ALELY CESIA
DAZA MERA DELIA ISABEL

DOCENTE:
ING. CARLOS ALFREDO VEGAS PÉREZ, DR.

SEMESTRE ACADÉMICO:
I- 2023

CICLO:
NOVENO

FECHA DE ENTREGA:
30-08-2023
 INDICE

I. INTRODUCCIÓN..................................................................................................................... 3
II. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................. 3
2.1. QUE ES EL YOGURT ..................................................................................................... 3
2.2. PROCESO DE ELABORACIÓN .................................................................................... 5
2.3. MICROORGANISMOS QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE
ELABORACIÓN DEL YOGURT ............................................................................................. 10
2.4. VALOR NUTRICIONAL............................................................................................... 12
III. ANALISIS POR INSTRUMENTACIÓN QUE SE PUEDEN APLICAR EN EL
YOGURT ......................................................................................................................................... 12
3.1. EPECTOFOTOMETRÍA .................................................................................................... 12
3.2. CROMATOGRAFÍA DE GASES ...................................................................................... 22
3.3. HPLC..................................................................................................................................... 24
3.4. TECNICA DE MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (PCR) ............................................ 29
3.5 REFRACTOMETRÍA .......................................................................................................... 34
3.6 CONTRAJE EN MICROSCOPIO Y RECUENTO EN PLACAS ................................... 39
IV. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 42
V. REFERENCIAS ...................................................................................................................... 42
 I. INTRODUCCIÓN

El yogur es un producto lácteo preparado por medio de la acidificación de la leche. Esta

acidificación se logra a través de la inoculación de las bacterias Streptococcus salivarius ssp.
thermophilus y Lactobacillus delbruekii ssp. bulgaricus. Estos microorganismos se encargan
de convertir la lactosa, el azúcar de la leche, en ácido láctico. En este proceso de conversión
hay producción de sustancias como ácido acético, diacetilo, acetaldehído y otras responsables
de sabores y aromas reconocidos en el yogur.

De todos los productos lácteos acidificados, el yogur es el más conocido y popular en casi
todo el mundo. El consumo más alto de yogur se da en los países ribereños del Mediterráneo,
Asia y Europa Central. El yogur es un producto lácteo altamente digerible con un alto valor
nutritivo, que suple una gran cantidad de proteínas y es una fuente de calcio, fósforo, potasio
y significativas cantidades de vitaminas. Existen tres tipos principales de yogur: batido,
líquido y firme, aunque se pueden mencionar algunos otros como el congelado y deshidratado
(Shizuko Guriz ,2018).

En el presente trabajo de investigación estaremos abordando los conceptos sobre el yogurt ,

su proceso de elaboración y su valor nutricional y al mismo tiempo se presentará el resultado
de una busca bibliográfica acerca de los diferentes métodos de análisis por instrumentación
que se puede aplicar al yogurt para determinar sus componentes .

II. MARCO TEÓRICO

2.1.QUE ES EL YOGURT
El yogur es un producto popular entre los consumidores, que se obtiene de la fermentación
de la leche por microorganismos específicos (streptococcus, thermophilus y lactobacillus
bulgaricus). Tiene la característica de ser altamente nutritivo sabroso y fácil digestión. Su
consumo en la actualidad se ha llevado en aumento por lo que el mercado lo demanda.
Las bacterias ácido-lácticas constituyen un vasto conjunto de microorganismos benignos,
dotados de propiedades similares, que fabrican ácido láctico como producto final del proceso
de fermentación.

Gracias a la elaboración del yogur y otros productos lácteos fermentados, las bacterias ácido-
lácticas seguirán representando un filón de explotación como cultivos probióticos. Éstas se
complementan con las bacterias presentes en nuestra flora intestinal y contribuyen al buen
funcionamiento del aparato digestivo. Ante la creciente demanda de los consumidores, cada
día más preocupados por la salud, el mercado internacional de estos productos no cesa de
incrementarse.
La acción de estas bacterias desencadena un proceso microbiano por el cual la lactosa (el
azúcar de la leche) se transforma en ácido láctico. A medida que el ácido se acumula, la
estructura de las proteínas de la 33 leche va modificándose (van cuajando), y lo mismo ocurre
con la textura del producto. Existen otras variables, como la temperatura y la composición
de la leche, que influyen en las cualidades particulares de los distintos productos resultantes.

Una de las propiedades más destacables del yogur es su capacidad de para regenerar la flora
intestinal, la cual se ve muy afectada por una mala alimentación y sobre todo, por infecciones
y abuso de medicamentos como los antibióticos (Desconocido, 2019).

SE CLASIFICAN LOS TIPOS DE YOGURES

La variedad de yogures que existe alrededor del mundo hace que sea muy difícil categorizar
todos los yogurts de una forma en particular. Por el contrario, es bastante común toparse con
diferentes maneras de enlistar los yogures que existen actualmente. Esto con el fin de
seleccionar aquél yogurt cuya característica cumpla con satisfacer a nuestros paladares. Es
así como se pueden encontrar las siguientes clasificaciones:
 Yogures según su preparación:
 Yogurt Natural.
 Yogurt con azúcar.
 Pasteurizado.
 Yogurt líquido.
 Frutado.
 Yogurt batido.

 Yogures según su país de origen:

 Griego.
 Yogurt islandés.
 Yogurt Kéfir.

 Yogures según su sabor:

 De fresa.
 Yogurt de mango.
 Yogurt de manzana.
 De ciruela.
 Yogurt de coco y afines.

 Según el tipo de leche:

 Yogurt con lactosa.
 Yogurt sin lactosa.
 Con leche de cabra.
En este caso en particular, se tomará como referencia los tipos de yogures según su
preparación. Esta clasificación es la que suele contar con mayor variedad de tipos distintos
(Paredes, 2022).

2.2.PROCESO DE ELABORACIÓN

El yogurt es un tipo de leche coagulada, por acidificación biológica de origen microbiano; el

ácido desarrollado en la leche permite una mejor conservación del producto. El yogurt está
comprendido dentro de un grupo denominado leches fermentadas.

LECHES FERMENTADAS.

Son productos acidificados por la acción de bacterias lácticas, que transforman la lactosa o
azúcar de la leche, en ácido láctico; la acidez resultante origina la coagulación de las proteínas
de la leche, dando a esta la apariencia de un gel o flan. La leche fresca, dejada por unas horas
al medio ambiente, se acidifica por acción de las baterías que naturalmente contaminan la
leche; esta es una fermentación espontanea, que da lugar a la "leche cortada". La
fermentación controlada de la leche, se realiza utilizando cepas o cultivos puros de bacterias
lácticas especiales, que se adicionan o inoculan a la leche y se mantienen bajo condiciones
controladas de tiempo y temperatura.

CONSERVACIÓN DEL YOGURT

El contenido de ácido láctico en las leches fermentadas, como el yogurt, kefirt y otras, no
permite el desarrollo de bacterias proteolíticas u otras que no son sido tolerantes y debido a
esto se previene su descomposición. Sin embargo, estos productos deben ser conservados en
refrigeración, para detener la producción de ácido. El yogurt se mantiene en buenas
condiciones durante 8 a 10 días, conservado en refrigeración; pasado este tiempo, el nivel de
acidez se incrementa a más de 1.5%, disminuyendo la calidad organoléptica del producto. En
muchos países el yogurt se consume debido a su contenido activo de fermento láctico; debido
a esto no está permitida la pasteurización, ni el uso de conservadores químicos para prolongar
el periodo de conservación del producto. En los casos que estuviera permitido, es posible
prolongar el periodo de conservación del yogurt, mediante un tratamiento térmico del
producto terminado; se pasteuriza el yogurt a 72 °C - 75 °C y se enfría de inmediato hasta
10-15 °C, en un intercambiador de calor; luego se envasa en condiciones asépticas. El
tratamiento térmico debilita la estructura del yogurt, por lo que es necesario añadir un
estabilizador a la leche antes del pretratamiento.

INGREDIENTES

Los ingredientes esenciales para elaborar yogurt son: leche concentrada de buena calidad y
fermento láctico.

 La leche. La consistencia y estabilidad del yogurt, dependen de la concentración de

proteínas de la leche; para obtener un producto de buena calidad es necesario usar
leche concentrada. La leche concentrada se puede preparar a partir de leche entera,
leche parcialmente desgrasada, leche en polvo o una mezcla de cualquiera de estos
productos.

La concentración de la leche se puede llevar a cabo mediante dos procedimientos:

 Por evaporación. La leche se concentra en evaporadores al vacío, donde se
elimina hasta 20 del agua contaminada en ella. Este proceso permite
conservar las propiedades nutritivas y funcionales de los constituyentes de la
leche debido a que el vacío permite evaporar a temperaturas entre 50 a 70 °C.
 Por adición de leche en polvo. Este es el procedimiento más utilizado.
Consiste en añadir 3 a 5% de leche descremada en polvo a la leche fresca,
entera o semidesgrasada.
 El cultivo láctico. El cultivo o fermento láctico utilizado para la producción de
yogurt, se prepara a partir de cultivos puros, suministrados por laboratorios
especializados. El cultivo, normalmente, se adquiere deshidratado (liofilizado), en
forma de polvo, por lo que es necesario activarlo antes de ser utilizado. La
propagación del cultivo, se hace preparando un cultivo madre o cultivo intermediario,
a partir del cual se obtiene el cultivo industrial. El cultivo o fermento para yogurt,
está constituido por una combinación de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus
bulg ricus, en la relacion 1:1

PREPARACIÓN DE CULTIVO LÁCTICO PARA LA PRODUCCIÓN DE YOGURT

La preparación de cultivos lácticos para la producción industrial, exige ciertos cuidados, a
fin de mantener la pureza, el balance de los microorganismos constituyentes y la actividad
óptima del cultivo. El cultivo láctico para yogurt, está constituido por una combinación de
Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus al 50%; estos dos microorganismos
crecen en simbiosis y ambos son responsables de la fermentación láctica de la leche. Para
obtener un buen yogurt, es importante mantener el balance en producciones sucesivas.

La relación entre las dos bacterias se mantiene controlando las condiciones óptimas para la
propagación del cultivo. Estas condiciones son:

 Cantidad inoculada: 3% de fermento láctico

 Temperatura de incubación: 42 a 45 °C
 Tiempo de incubación: 3 horas
En el proceso de propagación de la cepa se distingue tres tipos de cultivos:

 El cultivo original o cultivo puro. Es el cultivo, generalmente liofilizado (en polvo),

que se adquiere de laboratorios especializados.
 Cultivo madre. Se prepara a partir del cultivo puro y se utiliza para la preparación del
cultivo industrial o fermento láctico para la producción diaria. El cultivo madre debe
ser renovado periódicamente.
 Fermento o cultivo industrial. Se prepara a partir del cultivo madre o intermediario y
se utiliza directamente para la producción industrial.

En el proceso de propagación del cultivo, las condiciones higiénicas del material y del
ambiente en que se trabaja, son de suma importancia; es preferible realizarlo dentro de
espacios aislados y esterilizados para evitar riesgos de contaminación. La leche para la
propagación del cultivo, debe ser de buena calidad, puede ser leche descremada o leche en
polvo descremada reconstituida. Para la preparación del cultivo madre, la leche es
pasteurizada a 90 °C durante 30 minutos, se en fría luego hasta 43 - 45 °C y se inocula con
3% de cultivo puro. Después de 3 horas, cuando la leche ha coagulado, se enfría rápidamente
a 4 °C (en refrigeración) para detener la actividad bacteriana. Este fermento o cultivo madre
sirve para preparar el fermento industrial, inoculándolo a 30 - 40 litros de leche pasteurizada,
contenida en recipientes adecuados de aluminio o acero inoxidable. El proceso para preparar
el cultivo industrial, es el mismo que el descrito para el cultivo madre, en cuanto al porcentaje
de inoculo, tiempo y temperatura de incubación y tratamiento térmico de la leche.

PROCESAMIENTO DEL YOGURT

El procesamiento del yogurt consiste básicamente en inocular una leche concentrada, con el
fermento láctico industrial preparado previamente en la forma descrita, luego se incuba la
leche inoculada, a 44°C, durante 3 horas. A continuación, se describe el flujo de operaciones
para la elaboración de yogurt.

MATERIALES Y EQUIPOS

 Descremadoras
 Intercambiador de calor
 Homogeneizador
 Tanques o cubos de fermentación

PROCESO DE ELABORACIÓN

 Estandarización de la leche. El yogurt que m s se comercializa es a partir de leche

parcialmente descremada. Para esto se normaliza el contenido de grasa de leche entre
1 y 2.5%. Para la elaboración de yogurt dietético (de bajas calorías), se normaliza el
contenido de grasa a menos de 1%.
 Concentración de la leche y Homogenización. La concentración de la leche, puede
llevarse a cabo, por evaporación al vacío, en equipos especiales, en donde se evapora
parte del agua de la leche (entre 10 y 20%), a una temperatura promedio de 70 °C.
Un método más sencillo y económico para concentrar la leche, es la adición de leche
descremada en polvo, a la leche fresca. Esta adición se hace gradualmente y con
agitación constante; luego la leche es precalentada hasta 70 °C y pasada por el
homogenizado a una presión de 2,500 a 3,000 lbs/pulg2. La adición de leche en polvo,
varía entre 1 y 5%, sobre el peso de leche fresca utilizada.
 Pasteurización. Luego de la homogenización, la leche se somete a tratamiento térmico
para destruir microorganismos patógenos; este puede realizarse en intercambiadores
 de calor donde la leche se calienta hasta 72 °C y se mantiene a esta temperatura por
lo menos 15 segundos; luego se enfría de inmediato. Se puede pasteurizar tambien en
ollas u otros recipientes donde la leche se calienta hasta 85 °C con agitación constante,
manteniéndose a esta temperatura durante 15 minutos.
 Enfriamiento. Después de la pasteurización la leche debe enfriarse de inmediato, en
la sección regenerativa del intercambiador, hasta una temperatura de 45 °C. Si no se
dispone de intercambiador; el enfriamiento se realiza sumergiendo en agua fría o
helada, las ollas o recipientes en que se calienta la leche; en este caso es muy
importante evitar toda posible contaminación, después del tratamiento térmico.
 Inoculación e incubación. La leche a 45°C se col oca en tanques o cubas de
fermentación; estas deben ser lo más aisladas posibles, para evitar pérdidas de calor
y mantener la temperatura de 45 °C en la leche cultivada o inoculada. Añadir el
cultivo láctico en la proporción de 3% (30 ml. por cada litro de leche); se dispersa
con agitación por un par de minutos, para que se distribuya uniformemente en toda la
leche. La leche cultivada se mantiene en las cubas de fermentación, durante 3 horas
a 45 °C. Cuando se ha alcanzado la correcta acidez (0.6%), el yogurt debe ser enfriado
rápidamente hasta una temperatura de 15 °C y en seguida se refrigera a temperatura
de 4 °C.

La incubación puede realizarse tambien, directamente en los vasos para consumo,

dependiendo del tipo de yogurt a elaborar. Según el método de manufactura se
elaboran los siguientes tipos de yogurt:
 Yogurt gelificado. Es el yogurt de textura firme. Para su preparación, la leche
pretratada se envasa inmediatamente después de la inoculación y coagula en
el vaso.
 Yogurt batido. La leche pretratada es inoculada en los tanques de incubación
y coagula antes de ser envasada. Este tipo de yogurt es más fluido que el
anterior, debido a que después de la coagulación, se somete el producto a un
batido moderado, que le da la consistencia final.
SABORIZADO DEL YOGURT

El saborizado del yogurt se realiza mediante la adición de extractos naturales, frutas

endulzadas o sin endulzar, sabores o esencias artificiales. La forma más común de saborizar
el yogurt, es mediante la adición de frutas endulzadas, reforzadas con sabores artificiales. El
nivel de fruta que se adiciona al yogurt, es alrededor de un 10 a 15%, lo cual no es suficiente
para conseguir un buen sabor y color en el yogurt; por lo que es necesario reforzar la fruta
natural con productos concentrados, naturales o artificiales.

Normalmente se prepara una mezcla base de fruta con 25 a 45 % de azúcar, pectina, esencia
y color artificial. Esta mezcla base de fruta debe ser sometida a un tratamiento térmico que
inactive todos los microorganismos vegetativos, sin afectar el sabor y estructura de la fruta.
Para conservar la fruta que no va a ser utilizada de inmediato, se puede añadir sorbato de
potasio o benzoato de sodio a un nivel de 0.1%. La adición de la fruta al yogurt, se puede
hacer mediante dos procedimientos, según el tipo de yogurt a elaborar.

 Yogurt tipo suizo. La fruta y el yogurt están mezclados. En este caso primero se
incuba la leche inoculada, durante 3 horas; cuando el yogurt está listo, se mezcla con
la fruta antes del envasado.
Yogurt tipo "sundae". La fruta se encuentra en el fondo del vasito y generalmente se mezcla
antes de ser consumida. En este caso, se coloca la fruta en el fondo del vasito, se vierte
cuidadosamente la leche cultivada y se llevan a incubar los vasitos por tres horas a 45 °C;
luego se enfrían y se refrigeran, estando listos para el consumo humano. La fruta que se
utiliza para este tipo de producto, debe ser de una consistencia que no le permita mezclarse
con la leche cultivada, al momento de añadir está en el vasito ( O. Navarrete, s.f).

2.3.MICROORGANISMOS QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE

ELABORACIÓN DEL YOGURT
Según Medina (2016), las bacterias de ácido láctico son el grupo más grande se incluyen
especies de Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc y Lactobacillus. Los iniciadores
lácteos generalmente se agrupan como mesófilos o termófilos, dependiendo de la aplicación
del producto. Las cepas termofílicas de Streptococcus thermophilus ahora a veces se incluyen
en cultivos iniciadores mesofílicos (por ejemplo, para queso Cheddar). Las cepas mesófilas
de Lactococcus lactis susbsp. lactis se incorporan ocasionalmente en cultivos termofílicos
(por ejemplo, para queso mozzarella).
En general, los cultivos lácteos realizan tres funciones principales:

 Fermentar el azúcar de la leche, la lactosa y acidificar la leche o el queso.

  Para generar sabor o precursores de sabor.
 Para modificar las propiedades de textura del producto.
 Sinéresis del lactosuero.
 Producir el gas requerido para la formación de hoyos en algunos tipos de
queso la proteólisis necesaria para la maduración

Fuente: (Shizuko Guriz ,2018).


 Lactobacillus bulgaricus. Se encuentran con frecuencia en ambientes lácteos y
cárnicos, en jugos, bebidas fermentadas y productos de cereales. Es una bacteria
láctea homofermentativa. Su temperatura optima desarrollo entre 42 y 45°, al
producir pH disminuye hasta un 2,7% de ácido láctico, produce hidrolasas que
hidrolizan las proteínas. Este es motivo que los aminoácidos como la valina son
liberados, la cual favorece el desarrollo del streptococcus thermophilus (Hutkins,
2006).

 Streptococcus thermophilus. Son anaerobios no móviles y facultativos, con un

metabolismo homofermentativo obligatorio, se utiliza en la fabricación de alimentos
fermentados, está altamente adaptado a un ambiente lácteo en el que fermenta la
lactosa rápidamente y produce ácido láctico en forma homoláctica. Además, S.
thermophilus tiene un optima de temperatura (40ºC - 42ºC), una temperatura de
crecimiento máxima (52 ºC) y una tolerancia térmica más alta (por encima de 60ºC)
(Hutkins, 2006). Además de producir polisacáridos que forman un mucilago
importante para la viscosidad del yogurt, su función es dar desarrollo de la textura y
sabor (Puelles, 2015).
 2.4.VALOR NUTRICIONAL

CIFRAS TÍPICAS DE CONCENTRACIÓN DE ALGUNOS NUTRIENTES MAYORITARIOS DE LA

LECHE Y EL YOGUR.

III. ANALISIS POR INSTRUMENTACIÓN QUE SE PUEDEN APLICAR EN

EL YOGURT
3.1. EPECTOFOTOMETRÍA
TESIS : EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICAS, QUÍMICAS Y
ORGANOLÉPTICAS DEL YOGURT BATIDO ENRIQUECIDO CON
EXTRACTO DE BASUL
En esta tesis utilizaron el espectrofotómetro para la determinación de Calcio
Determinación de calcio.
La determinación de calcio de desarrollo de acuerdo el método AOAC 975. 03.
1. En crisoles a peso constante se colocaron 20 gramos de yogurt para ser secada en
una estufa a 110 °C durante un día para eliminar la humedad.
2. Posteriormente la muestra fue llevada a incineración a una estufa en una mufla de
600 °C por doce horas
3. De la cenizas obtenidas solo se pesaron 0.05 gramos aproximadamente. Y se
acidificaron con 2 mL de ácido nítrico 1:1.
4. Posteriormente se filtraron con papel whatman n° 4 y se aforaron a 50 ml con
agua destilada
5. De este filtrado se tomaron 2 mL y se le adiciono 5 ml de SCI2, 5 mL de KCI y
0.2 mL de HNO3 1:1.
Estas soluciones y los estándares, después de preparadas se permanecieron en
refrigeración, hasta la lectura en el espectrofotómetro.
RESULTADOS
Es evidentemente que una de las mayores cualidades del yogurt es su importante
cantidad de calcio (Cajas, 2011), en ese sentido en la Tabla 19, se observa que la
cantidad de calcio en las formulaciones del yogurt disminuyen de con el incremento
de extracto de basul de 92.62 a 80.29 mg/100, mostrando alta diferencia significativa
(p-value < 0,05) (Figura 15), sin embargo el contendió promedio de calcio en un
yogurt es de 142 mg/100 g (Early, 200), este hecho se debe a que el aporte de calcio
por parte del extracto de basul es bajo, ya que este producto alcanza valores máximo
de 16 mg/100 g (Tito, 2002); aunque es normal que durante ese proceso se altere la
naturaleza del complejo.
cálcico (Vélez y Rivas, 2001), asimismo esto pudo deberse a una insuficiencia de la
acción de las bacterias lácticas en la fermentación ICBF (2015).
Por otra parte Vélez y Rivas (2001), afirman que las cualidades nutrimentales del
yogurt provienen no sólo de la presencia de los compuestos de la leche, sino también
de la transformación de éstos, como resultado de la actividad metabólica causada por
la fermentación de los microorganismos, además de la composición de la leche como
tal, ya que influyen factores genéticos en un 45% y factores nutricionales fisiológicos
y de manejo en un 55%, el más importante es la alimentación, seguido por el nivel de
producción, el estado de salud de la ubre, la época del año, el número de lactancias y
la edad del animal, así, la disminución de calcio se debe a la disminución en el nivel
de síntesis en términos del lactocito por influencia de citosinas producidas por los
leucocitos (Blanco, 2014).

Castilla y Muñoz (2017), observaron incrementos de calcio de 80 a 160 mg/100 para

el yogurt formulado con zumo de vegetales y cascara de piña, mientras que Hidalgo
(2017), reporta un contenido de 85.0 mg Ca/100 g ( Julio Sichez , 2018) .
TESIS: COMPARACION DE DOS METODOS PARA LA
CUANTIFICACION DE CALCIO EN YOGUR PARA ADULTOS Y NIÑOS
PARTE TEÓRICO
Método Oficial para la determinación de Calcio en alimentos según la Asociación
Oficial de Químicos Analíticos.
Como antes se mencionó, el método oficial proporcionado por la Asociación Oficial
de Químicos Analíticos (AOAC,2005) 985.35, para cuantificar el contenido de calcio
en alimentos, se describe la utilización de la técnica de espectrometría de absorción
atómica con llama, seguidamente se describen los aspectos más importantes de esta
metodología. Por tal motivo es de suma importancia, conocer el contenido de calcio
que poseen este tipo de alimentos, especialmente el yogurt, debido a que este producto
es comúnmente consumido por la población junto con otros productos que contienen
calcio, como por ejemplo quesos, huevos, etc. Para conocer dicho contenido de calcio
presente en los alimentos la Asociación Oficial de Químicos Analíticos
(AOAC,2005) 985.35, describe la utilización de la técnica de espectrometría de
absorción atómica con llama, además de este método existen otras metodologías no
oficiales para la cuantificación de calcio en alimentos, entre las cuales están la
metodología tritrimetrica complejometrica y por Oxido-Reducción, pero se
desconoce si dichos métodos tienen la capacidad de cuantificar el analito de forma
exacta y precisa. La problemática de la presente investigación radica en como
asegurar que las metodologías alternativas cumplen con los requisitos de desempeño
esperados (Precisión y exactitud).
Lo que se entiende por la espectrofotometría de absorción atómica ahora se usa
ampliamente para la determinación cuantitativa de muchos elementos metálicos y no
metálicos presentes en preparaciones farmacéuticas, medicina y estudios clínicos,
minería, industrias, suelo, plantas, agua, fertilizantes, muestras ambientales, comida
y similares. En la determinación por fotometría de llama, los átomos en estado
fundamental libres de los elementos metálicos son excitados por la energía térmica
de la llama, un proceso en el que los electrones orbitales externos de los átomos se
transfieren a sus niveles de energía superiores posteriores. Tales estados se
denominan estados excitados de los átomos. Sin embargo, solo una fracción muy
pequeña del total de átomos libres experimenta el proceso de excitación, mientras que
la fracción restante, mucho más grande, continúa en su estado fundamental. Un átomo
en su estado fundamental es el estado normal y energéticamente más favorable del
átomo; en el estado fundamental de un átomo, los electrones de este último siguen
moviéndose en sus orbitales cuantificados normales con espines opuestos. Como solo
una pequeña fracción de los átomos puede ser excitada por la energía de la llama, la
intensidad de la radiación característica emitida por los átomos en estado excitado o
de mayor energía durante su regreso al estado fundamental es bastante baja y, en
consecuencia, la sensibilidad de la fotometría de llama como herramienta analítica
también es muy baja. Esta baja sensibilidad es, con mucho, el defecto más importante
de la determinación fotométrica de llama. Salvo algunos elementos como el sodio, el
potasio, el litio, el bario y el calcio, la población de átomos excitados de los demás
elementos es extremadamente baja, tanto que la fotometría de llama es inadecuada
para su determinación. Sin embargo, una fracción mucho mayor de estos "átomos en
estado fundamental" se puede excitar por medio de energía distinta a la energía
térmica de la llama y, si eso se puede lograr, la herramienta analítica se puede volver
mucho más sensible. Uno de esos otros medios de proporcionar la energía requerida
es la energía disponible en forma de radiación electromagnética de longitud de onda
que es característicamente específica para un elemento. Debe mencionarse con
mucho énfasis en este contexto que los átomos de un elemento en su estado
fundamental pueden tomar solo valores dados de energía para su excitación (para
alcanzar un estado de mayor energía), y por lo tanto una radiación de longitud de
onda específica para los átomos. Expresado en palabras más simples, para suministrar
la cantidad requerida de energía con el fin de excitar los átomos en estado
fundamental de un elemento, la espectrofotometría de absorción atómica utiliza la
energía de la luz contenida en la radiación con longitudes de onda particulares que
son absorbidas específicamente por los átomos del elemento concreto.
Componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica
Hay cinco componentes básicos de un espectrofotómetro de absorción atómica:
 Fuente de radiación que emite el espectro del elemento a determinar.
 Atomizador que produce los átomos libres del elemento. El atomizador utiliza
una llama o un horno como fuente de energía para producir los átomos del
elemento a partir de sus compuestos.
 sistema óptico que aísla la radiación de la longitud de onda deseada.
 detector que mide la intensidad de la luz, generalmente después de la
amplificación de la señal de entrada.
 dispositivo de visualización que lee la concentración del elemento en cuestión en
formato analógico o digital u otro formato adecuado.
Interferencias en Espectrofotometría de Absorción Atómica
La espectrofotometría de absorción atómica es una herramienta analítica muy
sensible. Sin embargo, los resultados del análisis son propensos a errores debido a
interferencias de varios tipos. Estas interferencias pueden clasificarse como
interferencias químicas, de ionización, espectrales, de emisión, de matriz y de
absorción de fondo.
 Interferencia química: La interferencia química es la más común de las
interferencias y es causada por los compuestos del elemento (que se está
determinando) en la muestra que no están disociados por la energía térmica
de la llama. Como resultado, el número de átomos libres del elemento en la
llama que van a absorber la radiación de la fuente es menor de lo que debería
ser.
 Interferencia de ionización: La interferencia de ionización es causada por la
alta temperatura de la llama. La temperatura de la llama a veces resulta ser tan
alta que la energía térmica provoca la eliminación de los electrones externos
o de valencia de los átomos libres que forman sus respectivos iones.
 Interferencia espectral: La interferencia espectral se puede encontrar cuando
otro elemento del cual una o más longitudes de onda de absorción se
encuentran dentro del ancho de banda de la línea de absorción del elemento a
determinar en la muestra
 Interferencia de emisión: A altas concentraciones de analitos, los resultados
del análisis de absorción atómica de elementos altamente emisivos pueden
tener una precisión analítica deficiente, si la señal de emisión se encuentra
dentro del paso de banda espectral de la radiación utilizada.
 Interferencias de la matriz: Las interferencias de la matriz incluyen
interferencias debidas a características físicas como la viscosidad, la tensión
superficial y la calidad de combustión de la muestra y los estándares. Las
interferencias de la matriz también pueden deberse a variaciones en las
concentraciones de sales o ácidos disueltos y solventes en la muestra y las
soluciones estándar.
 Interferencia de absorción de fondo: La interferencia de absorción de fondo
en la espectroscopia de absorción atómica es causada principalmente por la
dispersión de la luz, por las partículas en la llama, y la absorción de radiación
 por formas moleculares no disociadas de los materiales de la matriz en la
llama.

Preparación de la muestra
Salvo en algunos casos específicos, la muestra que se va a analizar mediante
espectrofotometría de absorción atómica no se puede alimentar directamente al
instrumento y se debe administrar a la muestra algún tipo de tratamiento llamado
preparación de la muestra. La muestra puede ser medicamentos y productos
farmacéuticos, cereales, comida rápida, bebidas frías, tierra, plantas, agua, aleaciones,
cemento, electrolitos en suero, metales en metaloenzimas, plomo en colorantes
alimentarios permitidos y muchos más. Para el análisis elemental total, existen cinco
métodos de preparación de muestras: Incineración seca, oxidación húmeda, fusión,
disolución a presión y digestión en horno de microondas.
- La incineración seca: Se sigue particularmente para las muestras que tienen un alto
contenido de carbono orgánico. Para la incineración seca, una masa dada de la muestra
se somete a digestión usando la temperatura alta disponible en un horno de mufla o un
horno de aire caliente o una combinación de ambos.
- Oxidación húmeda: Para la oxidación húmeda, también conocida como digestión
ácida, una determinada masa de la muestra se digiere tratando la muestra con un ácido
mineral fuerte y concentrado o, más comúnmente, con una mezcla de ácidos minerales
fuertes y concentrados en proporciones específicas a alta temperatura.
- Fusión: En el método de fusión de preparación de muestras para el análisis elemental
total, se transfiere una masa dada de la muestra a un crisol hecho de metales como níquel,
zirconio y platino, se mezcla con un fundente apropiado y luego la mezcla se funde sobre
una llama caliente hasta formar un fundido.
- Disolución a presión: Se sigue el método de disolución a presión para la determinación
de elementos volátiles que se pierden a alta temperatura. Una combinación de alta
presión y una mezcla ácida ayuda a digerir la muestra a una temperatura moderada en la
que no hay pérdida volátil de los elementos que se están determinando.
- Digestión en horno de microondas: En el método de digestión en horno de microondas
para la preparación de muestras para el análisis elemental metálico, una determinada
masa de la muestra tomada en un recipiente pequeño resistente a las microondas, como
un crisol de teflón o policarbonato, se transfiere a un horno de microondas y luego se
digiere a una temperatura moderada. El método de digestión en horno de microondas es
el método de preparación de muestra utilizado para la determinación de calcio en
alimentos según el método oficial, este es una metodología analítica validada, dichas
metodologías son acuerdos a nivel internacional. Se denomina validación de un método
analítico cuando al método se le aplican diferentes parámetros de rendimiento. El
objetivo de la validación de un procedimiento analítico es demostrar que es adecuado
para su propósito previsto. Las recomendaciones para la validación de métodos
analíticos se pueden encontrar en la Guía ICH Q2 (R1) Validación de procedimientos
analíticos: texto y metodología y en el Capítulo general de USP Validación de
procedimientos compendiales.
En cambio, los métodos no oficiales, son metologias alternativas no validadas. Para su
uso y para mayor confiabilidad de los datos dichas metodologías deben ser validadas. A
continuación, se detallan los parámetros de rendimiento comúnmente utilizados para la
validación de los métodos analíticos.
METODOLOGICO
TIPO DE ESTUDIO
 Prospectivo: Con los resultados obtenidos se establece un precedente en cuanto a la
cuantificación de calcio en yogures infantiles y de adultos utilizando los métodos
complejométricos y de óxido reducción, esto con la finalidad de que se tome en cuenta
en futuras investigaciones.
 Experimental: Porque todas las muestras que se recolectaron fueron procesadas en el
Laboratorio de Química Analítica cuantitativa de la Facultad de Química y Farmacia
de la Universidad de El Salvador, El Salvador.
INVESTIGACIÓN DE CAMPO
Universo: Yogures en presentación para adultos y niños, comercializados en un
supermercado de la cadena más grande del país, ubicado en el área metropolitana de San
Salvador en el periodo Enero a febrero de 2022.
Muestra: 6 frascos del mismo lote de yogur de cada tipo de presentación. Dos tipos de
yogurt en presentación para adulto (yogurt sabor manzana, presentación 212g/200 mL,
el cual rótula 190 mg de Calcio por frasco y yogur semisólido natural sin azúcar,
presentación 125 g/100 mL, el cual rótula 180 mg de Calcio por frasco ) y dos tipos de
yogurt en presentación para niños (yogur semisólido sabor banano fresa, presentación
tarro de 100 g/ 90 mL, el cual rótula 130 mg de Calcio por frasco y yogur líquido sabor
galleta de fresa presentación 105 g/ 100 mL, el cual rótula 90 mg de Calcio por frasco).
(Ver anexo N°1, Presentaciones de Yogur utilizados para el análisis).
PARTE EXPERIMENTAL
Para cada método, se realizaron dos repeticiones, con dos analistas, en días diferentes.
Procedimiento para la cuantificación de Calcio utilizando método de Complejometrico

a) Estandarización de la solución valorante de EDTA 0.05M con CaCO3 0.01M

1. Medir con pipeta volumétrica de 10 mL la solución estándar de Carbonato de
Calcio y colocarla en un erlenmeyer de 250 mL.
2. Adicionar lentamente 7 gotas de solución de hidróxido de sodio 4 N para llevar
la solución a pH 12 (verificar con papel pH).
3. Adicionar unas gotas de indicador purpurato de amonio o murexida. Agitar la
solución.
 4. Llenar la bureta de 50 mL previamente ambientada con solución valorante de
EDTA 0.05 M.
5. Titular el patrón primario con la solución EDTA que está en la bureta hasta que
el color de la solución vire de rosado a violeta.
6. Anotar los mililitros gastados en la valoración.
7. Realizar 2 valoraciones más

b) Procedimiento para la cuantificación de Calcio en la muestra:

1. Medir con pipeta volumétrica de 10 ml la muestra tomada directamente desde el
frasco y transferirlo a un erlenmeyer de 250 mL.
2. Agregar lentamente gotas de solución de hidróxido de sodio 4 N. para llevar la
solución a pH 12 (comprobar el pH con el papel indicador).
3. Agregar una mínima cantidad de indicador purpurato de amonio o murexida.
Agitar la solución.
4. Llenar la bureta con solución estándar secundario de EDTA 0.05 M.
5. Titular la muestra con la solución de EDTA que está en la bureta, hasta que el
color varía de rosado a violeta, anotar los mililitros gastados en la valoración.
6. Realizar por duplicado el procedimiento.
Procedimiento para la cuantificación de Calcio utilizando método de Oxido- Reducción
(PERMANGANOMETRIA).
a) Estandarización de la solución de KMnO4 con oxalato de sodio 0.1N

1. Tomar con pipeta volumétrica 10.0 mL de la solución estándar primario (oxalato de

sodio) y transferir a un erlenmeyer de 250 mL.
2. Adicionar con probeta 7.5 mL de ácido sulfúrico 2 N. y calentar la solución a 60 ºC,
hasta que se observen signos de evaporación en el cuello del erlenmeyer.
3. Valorar en caliente con la solución de permanganato de potasio 0.1N. Agitando
constantemente hasta la aparición de un color rosado pálido que persiste por 30
segundos.
4. Efectuar 3 valoraciones

b) Procedimiento para la cuantificación de calcio en muestra de yogur Tratamiento de

Muestra
1. Transferir el volumen total de yogur de la presentación a analizar beaker de 500 mL
2. Agregar 100 mL de HCl 3 M para llevar a pH ácido para separar las proteínas y dejar
reposar por 1 semana.
3. Separar por medio de filtración.
4. Agregar al filtrado 30 mL de ácido oxálico 2% (p/v) y 15 mL de Amoniaco para la
formación del precipitado.
5. Calentar en baño de maria por 30 minutos.
6. Filtrar al vacío con papel whatman N°40 libre de ceniza.
7. El precipitado calentarlo en estufa a 105°C por una hora, posteriormente colocarlo
en desecador por 1 hora.
 8. Pesar en balanza analítica y transferirlo a beaker de 100 mL
9. Realizar los cálculos pertinentes para la formación de una solución 0.1 N de Oxalato
de calcio.
Cuantificación de Calcio

1. Tomar con una pipeta volumétrica 10.0 mL de solución problema y transferir a un

erlenmeyer de 250 mL
2. Adicionar 8 mL de ácido sulfúrico 2N
3. Calentar 60°C
4. Valorar la muestra hasta la aparición de un rosado pálido
5. Realizar por duplicado
EXACTITUD Y PRECISIÓN DE LOS MÉTODOS UTILIZADOS
Evaluar niveles de concentración de 100% (muestra), 110% y 120%. Para el método
complejometrico se realizó los cálculos pertinentes para calcular el nivel de 110% y 120%
de calcio elemental utilizando para el método complejometrico el estándar de Carbonato
de Calcio y el método Oxido de calcio.
Procedimiento:
 Calcular por cada presentación, el 10% y 20% de Calcio elemental de acuerdo al
estándar utilizado por cada método.
 Pesar por cada método y nivel de concentración la cantidad de calcio calculada
en el paso 1.
 Agregar a cada una de las muestras la cantidad de estándar pesado.
 Continuar el análisis como se indica en cada método.
 Realizar 1 muestra por cada nivel de concentración y realizar 3 repeticiones.
 Calcular el porcentaje de Recuperación para Exactitud
 Calcular a los datos obtenidos la Desviación estándar y Desviación estándar
Relativa para la precisión.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Determinar el contenido de calcio utilizando el método de oxido reducción y
complejométrico en los yogures seleccionados.
Resultados obtenidos mediante la aplicación del método complejometrico y método Oxido-
Reducción en Yogur Liquido en presentación Adulto 200 mL y presentación Niño 100 mL.
Resultados obtenidos mediante la aplicación del método complejometrico y método Oxido-
Reducción en Yogur semisólido en presentación Adulto 100 mL y presentación Niño 90 mL.

CONCLUSIONES
Para las cuatro presentaciones de yogur evaluadas, mediante el método complejometrico se
obtuvo un porcentaje sobre lo rotulado de calcio que ronda el 100% (entre 100-102%). En
cambio, al aplicar el método Oxido-Reducción a las mismas presentaciones de yogur se
obtuvo un porcentaje de recuperación cercano al 90% (entre 90 y 94%).
Los dos métodos no son precisos, se evidencio mediante los resultados de la desviación
estándar y el coeficiente de variación mayores al 2% (criterio de aceptación según el
parámetro de precisión), lo cual demuestra una alta dispersión de los datos y por lo tanto una
muy baja precisión (Arango Miranda & Guillen Torres, 2022).

TESIS: COMPARACIÓN ENTRE OCHO MARCAS DE YOGURT NATURAL

COMERCIAL PARA EVALUAR LOS PRINCIPALES COMPONENTES .
Determinación de calcio por el Método 33.7.08 (A.O.A.C, 2000)
La determinación del contenido de calcio en el yogurt fue determinado mediante
espectrofotometria de absorción atómica con un equipo SpectraAA 220 FS (Atomic
Absortion Spectrometer) de la marca Varian®, el cual se encuentra en el laboratorio del
departamento de Química y Biología, UDLA-P.
Se prepararon estándares con una solución stock de calcio con las siguientes concentraciones:
0, 1, 2, 3, 4 y 5 ppm a los cuales se les adicionó cloruro de estroncio, (10 mL), cloruro de
potasio (10 mL) y ácido nitrico 1:1 (0.4 mL).
Las muestras de yogurt se prepararon de la siguiente forma: en crisoles a peso constante se
colocaron 20 g de yogurt para ser secado en una estufa a 110 °C durante un dia para eliminar
la humedad, posteriormente la muestra fue llevada a incineración en una mufla a 600 °C por
12 horas. De las cenizas obtenidas sólo se pesaron 0.05 g aproximadamente y se acidificaron
con 2 mL de 1INO, 1:1, posteriormente se filtran con papel Whatman No. 4 y se aforaron a
50 mL con agua destilada. De este filtrado se tomaron 2 ml. y se les adicionó 5 ml de SrCl,
5 ml. de KCI y 02 mL de HNO, 1:1. Estas soluciones y los estándares (soluciones a diferentes
ppm mostradas en el Apéndice C), después de preparadas permanecieron en refrigeración,
hasta la lectura en el espectrofotômetro
La determinación de calcio se realizó mediante una llama de óxido nitroso-acetileno,
utilizando una longitud de onda de 4227 y un paso de banda de 05 nm.
Con los estándares se obtuvo una curva de calibración de acuerdo a las diluciones realizadas
y con las lecturas proporcionadas por el equipo se obtuvieron los resultados de mg de
calcio en la muestra (Segundo Lara, 2014).

3.2. CROMATOGRAFÍA DE GASES

TESIS: VALORACIÓN CUANTITATIVA DE ÁCIDO LAÚRICO EN EL YOGURT

CON LECHE DE COCO FERMENTADA CON PROBIÓTICO Y DE UN
SUCEDÁNEO DE YOGURT
Cromatografía de gases con detector de ionización de llama (GC-FID):
En este tipo de cromatografía, el detector de ionización de llama (FID) es uno de los
detectores que más se aplican.
El efluente de la columna resulta de una mezcla de hidrogeno y aire en un quemador para
ser encendido eléctricamente, esto ocurre porque en la gran mayoría de los compuestos
orgánicos se descomponen a la temperatura de una llama de hidrógeno/aire, produciendo
iones y electrones para que puedan conducir energía a través de la llama.
La ionización en la llama para compuestos que tienen carbono no está todavía bien
establecida. El detector de ionización de llama es un detector que manifiesta el número de
átomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo, en la que es un detector
sensible a la masa. En efecto, el detector posee la ventaja de que los cambios en el caudal de
la fase móvil tienen poco efecto sobre la respuesta del detector.
Los grupos funcionales como carbonilo, alcohol, halógeno y amina producen escasos iones
en la llama
Materiales y Métodos
Selección del universo
El universo estuvo basado en la propuesta que se presentó la cual se trató de un yogurt
elaborado a base de leche de coco fermentado con probióticos y de un producto que es la
competencia directa a nuestra propuesta el cual se trata de un sucedáneo de yogurt elaborado
con pulpa de coco.
El presente estudio de investigación fue de carácter, experimental comparativo y
cuantitativo
Diseño experimental
El análisis de campo se enfocó directamente en un producto llamado yogurt sucedáneo de
coco “D’hoy” que se encuentra comercializado en el mercado ecuatoriano contra un yogurt
con leche de coco fermentada con probióticos que se propuso como alternativa de
investigación para la comparación de porcentajes de ácido laúrico.
Técnica de análisis de las muestras
Se empleó como técnica la Cromatografía de gases con detección de ionización de llama
(GC-FID) para determinar el porcentaje de Ácido Laúrico presente en las muestras, este tipo
de análisis se realizó en las instalaciones de Laboratorio Analítico UBA utilizando como
método de referencia AOCS Ce 1b-89.
Planificación del muestreo
Se elaboró cuatro lotes para recolectar las muestras de la “propuesta” es decir el yogurt de
leche de coco fermentado con probióticos los mismos que fueron elaborados en la Facultad
de Ciencias Químicas en el Laboratorio de Análisis Químico de Alimentos.
Así mismo se realizó una zonificación para recolectar las muestras del sucedáneo de yogurt
de coco “D’hoy”, muestras que fueron recolectadas en 4 supermercados diferentes, ubicados
en la zona norte, zona central y zona sur de la ciudad de Guayaquil tales como: Mall del Sol,
City Mall, Mall del Sur y Policentro.
El muestreo para la determinación de Ácido Laúrico se realizó en 4 periodos. Durante el
primer periodo se elaboró un lote de la “propuesta” y se seleccionó una muestra, y así mismo
para obtener la muestra de la “competencia” se zonificó y se seleccionó un supermercado de
la ciudad de Guayaquil y se escogió la muestra del yogurt sucedáneo de coco “D’hoy”.
Ambas muestras tanto la muestra “propuesta” como la muestra de la “competencia” fueron
recolectadas y enviadas a las instalaciones de Laboratorio Analítico UBA para su respectivo
análisis, este mismo procedimiento se realizó tanto en el segundo, tercer y cuarto periodo.
En total se recolectó 8 muestras de yogurt de las cuales 4 muestras fueron del yogurt de leche
de coco fermentada con probiótico (propuesta) las mismas que fueron codificadas con su
respectivo número de lote y nombradas como muestra A1, A2, A3 y A4, y las 4 muestras
restantes fueron del sucedáneo de yogurt de coco “D’hoy” (competencia) las cuales también
estuvieron codificadas con su respectivo número de lote y nombradas como muestra B1, B2,
B3 y B4. (Tabla XI. Planificación de muestreo).
Resultados y discusiones
Se Valoraron cuantitativamente ocho muestras, cuatro muestras elaboradas con la formula
seleccionada y cuatro muestras adquiridas en diferentes zonas de la Ciudad de Guayaquil en
los supermercados, las cuales se Analizaron por el Método Cromatografía de Gases por
Detección de Ionización de llama para determinar los porcentajes de Ácido Laúrico del
yogurt con leche de coco fermentada con probiótico, de nuestra autoría y de las muestras
conseguidas en el mercado, ya que nuestra competencia directa sería el Sucedáneo de yogurt
de marca registrada “D’ hoy “. Estos análisis se realizaron por dos meses, desde marzo hasta
abril del presente año.
Conclusión
Con los resultados obtenidos de la determinación de ácido laúrico por el método de
Cromatografía de gas con detección de ionización de llama (GC-FID) se consiguió realizar
el análisis comparativo estableciendo que el yogurt con leche de coco fermentada con
probiótico (“Dypol”) obtuvo un mayor rendimiento de Ácido Laúrico con respecto al yogurt
vegano de coco (“D’hoy”). Debido a que el yogurt con leche de coco fermentada con
probiótico obtuvo una media de 79,0225mg y una desviación estándar de 13,97572 y el
sucedáneo de yogurt de coco (“D´ hoy”) obtuvo una media de 11,5300 mg con una desviación
estándar de 9,75028, mientras que en la prueba T-Student en ambos grupos de estudio indicó
un p valor (Baquero Tomalá & Gutiérrez Campoverd, 2018).

3.3. HPLC

HPLC en la industria alimentaria

La cromatografía permite en los alimentos proporcionar información precisa sobre los
nutrientes de un alimento, la cromatografía es el método más versátil y se puede utilizar
en varias etapas del proceso de producción en la industria alimentaria.
En el presente trabajo se visualiza dos de las aplicaciones más importantes de la
cromatografía en la industria alimentaria, existen otras aplicaciones de la
cromatografía, sin embargo, estas son dos de las más utilizadas:
 Detección de contaminantes y aditivos
Los encargados de producción de alimentos deben mantener estándares exigentes,
debido a que el consumo de productos en mal estado o de baja calidad podría provocar
enfermedades graves. Las empresas de alimentos realizan varias pruebas antes de que
sus productos lleguen a los estantes, y una de las pruebas más importantes se lleva a
cabo a través de cromatografía. Esta se utiliza para buscar contaminantes que puedan
provocar el deterioro bacteriano. Por ejemplo, el HPLC es el sistema más común para
la separación y detección de aditivos en la comida (Juan P,2018)..
 Analizando la calidad nutricional
Aún con el auge de los organismos genéticamente modificados y los alimentos no
orgánicos, los productos de calidad siguen siendo importantes y requeridos por
agencias gubernamentales. A través de la cromatografía, las empresas de alimentos
pueden identificar los componentes de los alimentos. Con este método analizan sus
productos en busca de nutrientes como proteínas, vitaminas, conservantes y más, para
probar la calidad nutricional de sus productos. Las entidades regulatorias requieren que
la mayoría de los productos envasados tengan una etiqueta de información nutricional
que describa con precisión los ingredientes del producto.
Cuantificación de aminoácidos del yogurt mediante HPLC
Existen diversas estrategias para cuantificar aminoácidos, por ejemplo, aislarlo por
cromatografía de intercambio iónico y cuantificarlo por técnicas colorimétricas o
fluorométricas, una de las técnicas más avanzada por su resolución, velocidad y
sensibilidad es RP-HPLC con detector UV.
Procedimiento
Inicialmente se preparó la fase móvil en un vaso precipitado de 50 ml (Ácido acético,
butanol, acetona y agua en proporciones 7,7 0,15 9,2 respectivamente). Posteriormente
se tapó el vaso de precipitado con papel vinipel para no permitir que no escaparan
vapores. Luego se agregó la fase móvil en la cámara cromatográfica y se tapó
inmediatamente para que no se escaparan vapores y también para que la cámara
alcanzara la saturación necesaria.
Para la hidrolisis se tomó 6 g de muestra (en nuestro caso se utilizó yogurt natural),
luego la muestra se dividió por la mitad para hacer las respectivas hidrolisis, una mitad
con 2 ml ácido clorhídrico 6 N y la otra mitad 2 ml hidróxido de sodio 6 N.
Posteriormente, se dejó calentando a 100°C por 12 horas. A continuación, se agregó
2,5 ml de etanol al 70% a cada una de las muestras y se dejó en reposo por 15 minutos.
Paralelamente, y utilizando la placa cromatográfica y un tubo capilar calentado
previamente (con la finalidad de reducir el diámetro del capilar y al momento de la
siembra, obtener un punto fino) se comenzó a realizar la siembra con cada uno de los
patrones de cada aminoácido, para esto se utilizaron patrones de Y, K, I, A, S, M, P, G,
F, T, W D, N, H, E, V, y adicionalmente con patrones de la muestra hidrolizada en
medio básico y la hidrolizada en medio ácido. Los puntos de siembran se colocaron a
2 cm del inicio de la placa cromatográfica.
Posteriormente, se colocó la placa cromatográfica de acetato de celulosa en la cámara
cromatográfica previamente saturada y se empezó a dejar correr la fase móvil en la fase
estacionaria. Esto se dejó durante 1 hora y 15 minutos, momento en el cual la fase
móvil estaba a un centímetro de finalizar el corrimiento dentro de la placa
cromatográfica.
Se preparó el revelador con 0,1 g de Ninhidrina a una mezcla de butanolacetona
3,125:3,125 Posteriormente, se retiró la placa cromatográfica de la cámara, y se colocó
dentro de la cámara cromatográfica el revelador preparado, se dejó saturar al igual
como se hizo con la fase móvil.
Luego se colocó nuevamente la placa cromatográfica en la cámara que contiene el
revelador, y se dejó hacer el mismo corrimiento que realizó la fase móvil: este
corrimiento tomó 50 minutos.
Finalmente, se colocó la placa cromatográfica en el horno que estaba previamente
calentado a una temperatura de 80°C, y se dejó dentro del horno por 8 minutos (para
observar las manchas obtenidas) (Juan P,2018)..
 ANALISIS
a) Medio de hidrolisis: En primera instancia, podemos decir que el medio de hidrolisis
en el que se encuentre un aminoácido es esencial para determinar sus propiedades
ácido-base, aspecto importante pues de ello dependen las propiedades químicas y la
funcionalidad biológica de los péptidos y proteínas que forman (Juan P,2018)..

Las propiedades ácido-base de un aminoácido vienen determinadas por los grupos

protonables que posea. Un aminoácido puede actuar bien como ácido o como base
(sustancias anfóteras), pudiendo tener hasta tres grupos con carácter ácido-base: el
amino, el carbonilo y, en algunos casos, el resto –R.
Lo importante es que estos grupos poseen un carácter ácido-base débil, lo que hace
que dependa del pH, el correspondiente equilibrio pueda desplazarse de un sentido
a otro (hacía la forma protonada o hacía la desprotonada).

El grupo amino presenta dos formas, una protonada cargada positivamente (-NH3
+), y otra desprotonada sin carga (-NH2), según el siguiente equilibrio:

Sí el pH aumenta, el equilibrio se desplaza hacia la derecha (dominando la forma

con carga cero) y sí disminuye lo hacía la izquierda (dominando la forma con carga
+1)

Composición de aminoácidos que posee el Yogurt

De acuerdo a los valores mostrados en la tabla 2, se puede observar que la composición
del yogurt natural, posee un 3,9% de aminoácidos en su composición. Esto es
importante tenerlo a consideración puesto que los aminoácidos forman varios tipos de
proteínas, estas difieren de acuerdo a su estructura (Primaria, secundaria, terciaria y
cuaternaria) y las interacciones que estas forman.
En el caso del yogurt, la proteína que está presente en su composición es la caseína, la
cual es una fosfoproteína. Esta se encuentra en leche y en el yogurt en la fase soluble
asociada al calcio (fosfato de calcio), en un complejo que se ha denominado
caseinógeno. Las caseínas son un conjunto heterogéneo de aminoácidos, por lo que es
difícil fijar una definición.
Sin embargo, todas las proteínas englobadas en los que se denomina la caseína tienen
una característica en común, estas precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4-6. Por
ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche y de
algunos lácteos.
Como resultado, las caseínas son relativamente hidrofóbicas y carecen de una
estructura secundaria o terciaria bien definidas. En los productos lácteos se encuentran
como en una suspensión de partículas que se asemeja a las micelas surfactantes (son
pequeñas esferas, hidrofílicas en el exterior e hidrofóbicas en el interior). Estas micelas
de caseína se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofóbicas (Juan P,2018)..
Cromatografía
Para el análisis cromatográfico, se utilizarán los valores de la tabla 1 y de la tabla 3.
Los valores de la tabla 1 están asociados a la imagen
 En la tabla 3, se puede apreciar la clasificación de los aminoácidos utilizados como
patrones en la cromatografía en capa fina. De acuerdo a los datos obtenidos en la tabla
1 podemos inferir que de acuerdo a su clasificación (y sí son del mismo grupo), serán
similares por la similitud de sus propiedades químicas. Así que esta técnica, es muy
útil para separación de los aminoácidos presentes y si existen puntos de siembra con
patrones de aminoácidos, la cromatografía podrá ser utilizada para la identificación de
los mismos.
Al incluir a las muestras hidrolizadas en medio básico y en medio ácido con los valores
de la tabla 1, tabla 2 y tabla 3; podemos inferir que, los aminoácidos que se encuentran
en mayor proporción en la muestra de Yogurt Natural serán: Prolina (que en la
cromatografía presenta una coloración naranja, debido a que el grupo amino está dentro
de un ciclo), ácido glutámico y lisina, que comparando con los datos de la tabla 2, son
los aminoácidos que se encuentran en mayor proporción en una porción de 100 gramos
de yogurt natural.
Con lo anteriormente mencionado, no se descarta la presencia de los demás
aminoácidos presentes en la muestra de yogurt, pero probablemente y por la poca
cantidad de los mismos, la mancha cromatográfica no pudo ser identificada notable y
efectivamente.
Los aminoácidos que probablemente coexistan en la muestra y que según la imagen 1
puede evidenciar son: Valina, ácido aspártico, serina y triptófano. Podemos analizar
esto, puesto que según las cantidades descritas en la tabla 2, y los valores de R de la
tabla 1 junto con la imagen 1, se puede llegar a esta conclusión de la composición de
aminoácidos que probablemente esté presente en este yogurt natural (Juan P,2018).

3.4. TECNICA DE MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (PCR)

ARTÍCULO : OBTENCIÓN DE YOGURT NATURAL PROBIÓTICO

UTILIZANDO LECHE DE CABRA COMO
SUSTRATO Y B. INFANTIS
En la elaboración de productos que contienen bacterias probióticas es importante tomar en
cuenta dos desafíos tecnológicos: la viabilidad y estabilidad de las cepas. En esta
investigación se estudió el efecto del cambio de escala del proceso de yogurt natural con B.
infantis, L. delbrueckii y Str. thermophilus utilizando leche de cabra como sustrato. Se
crearon condiciones de anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno en el sistema de
fermentación. La estrategia experimental consistió en la caracterización y tratamiento
térmico del sustrato; reactivación de cepas, optimización de  y td de las mismas;
preparación de cultivos madre; selección de condiciones óptimas y escalamiento del
proceso de fermentación (500 mL a 3.5 L) y caracterización de los productos fermentados
obtenidos ( Valeria Díaz, s.f).
Se detectó B. infantis a través de una técnica de PCR y posterior electroforesis; y se
determinó concentración de UFC de B. infantis mediante conteos en placa utilizando medio
MRS con kanamicina/cloruro de litio. Los resultados obtenidos evidenciaron que el aumento
de escala del proceso favorece el desarrollo de B. infantis. Los productos obtenidos son
considerados probióticos (>1.0x108 UFC/mL de B. infantis). Así mismo, la
identificación de este microorganismo en los productos fue posible a través del
método de amplificación por PCR implementado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Procedencia y suministro de la leche de cabra.
La leche de cabra fue proveída por el Campo Agrícola Experimental (CAE) del
ITESM.
Cepas en estudio. Las cepas utilizadas para la realización de esta investigación fueron:
B. infantis ATCC 17930, L. delbrueckii ATCC 11842 y Str. thermophilus ATCC
BAA250. Dichas cepas fueron adquiridas de la colección de cepas American Type
Culture Collection (ATCC por sus siglas).
Proceso de obtención de yogurt natural.
El proceso de fermentación se llevo a cabo en reactores de 500 mL y de 3.5 L se
determinaron los parámetros siguientes: inóculo de trabajo total (porcentaje V/V),
relación de las tres bacterias en el inóculo total, concentración inicial de cada una de
las bacterias al inicio de la fermentación, temperatura y tiempo de fermentación.
Independientemente del volumen de fermentación el proceso de fermentación
consistió en calentar leche de cabra estéril a una temperatura de 42  1C y colocarla
en el fermentador estéril. Se adicionó el inóculo de bacterias, y se dejó fermentar
durante 6 horas a 42  1C bajo condiciones de anaerobiosis en atmósfera de
nitrógeno. Posteriormente se almacenó el producto en refrigeración a 4  1C.

En la tabla 1 se muestran las variables involucradas en los procesos de

fermentación.
 Tabla 1. Variables en los procesos de obtención de yogurt probiótico de leche de
cabra.
Variables involucradas Niveles
Volumen de
500 3,500
fermentación (mL)
1.- Creación de vacío (20 mm de Hg).
2.- Incorporación de nitrógeno (15 mm de
Hg) al sistema.
3.- Liberación de la mezcla de oxígeno y
Inyección de nitrógeno
nitrógeno residual.
Condiciones de directa al reactor a un
4. Entrada de nitrógeno (5 mm de Hg).
anaerobiosis-proceso flujo de 10 mL/min
Las condicionces de anaerobiosis total en
durante 5 minutos.
atmósfera de nitrógeno se establecieron en
el sistema donde se llevó a cabo la
fermentación (Incubadora Sheldon
Manufacturing, Inc. A-141, Cornelius, OR).
* El nitrógeno utilizado fue de grado 4.8 (Praxair de Monterrey).

Para determinar si existen diferencias significativas entre los productos obtenidos al cambiar
de escala, con el programa estadístico MINITAB Release 14 se realizó una prueba de
hipótesis para dos muestras utilizando la distribución t para establecer con un nivel de
confianza del 95% (p < 0.05) las diferencias de las medias de los valores del pH, acidez
titulable, lactosa residual y viabilidad de B. infantis.
Identificación de B.infantis ATCC 17930 a través de PCR y electroforesis.
Para verificar que B. infantis estaba presente en el producto fermentado se implementó un
método de PCR que amplifica una secuencia en la región 16S rRNA, la cual es específica
para esta especie si se utilizan los oligos BiINF-1 y BiINF-2 (Takahiro et al, 1999) .

RESULTADOS
En la tabla 2 se presentan los resultados de la caracterización de los productos fermentados
obtenidos.

Tabla 2. Caracterización de productos fermentados obtenidos.

Producto de
Producto de
Parámetro Fermentación (500
Fermentación (3.5 L)
mL)
4.60 a 4.73 d
pH
1.41x10-2 * 2.0x10-2 *
Acidez titulable (% P/V de ácido 0.58 b 0.57 e
láctico) 4.08x10-2 * 3.07x10-3 *
3.98 a 3.92 d
Concentración de lactosa (% P/V)
2.97x10-1 * 1x10-4 *
UFC/mL de Bifidobacterium
5.0x108 c 1.3x1010 e
infantis
a: Valores promedio de 2 eventos independientes. b: Valores promedio de determinaciones
por duplicado de 2 eventos independientes. c: Valores promedio de determinaciones por
triplicado de 2 eventos independientes. d: Valores promedio de 3 eventos independientes. e:
Valores promedio de determinaciones por duplicado de 3 eventos independientes. * Los
valores corresponden al error estándar.
En la tabla 3 se muestran los resultados del análisis estadístico de los parámetros de los
productos fermentados.

Tabla 3. Análisis estadístico de los parámetros de los productos fermentados

obtenidos en dos .
Valor p <
Parámetro Análisis
0.05
La diferencia del pH de los productos es equivalente al
pH 0.079 2.14%. No existen diferencias significativas en el valor
del pH de los productos.
La diferencia entre los valores de la acidez titulable de
Acidez los productos es equivalente al 1.72%. No existen
0.062
titulable diferencias significativas en la acidez titulable de los
productos.
La diferencia en las concentraciones de lactosa de los
Concentración productos es equivalente al 1.51%. No existen diferencias
0.76
de lactosa significativas en la concentración de lactosa disponible en
los productos.
La diferencia entre las concentraciones de B. infantis de
UFC/mL de los productos es equivalente al 96.15%. Si existen
0.001
B. infantis diferencias significativas en el número de UFC/mL. de B.
infantis en los productos finales de fermentación.

Los resultados muestran que no hubo diferencias significativas en el pH, acidez titulable y
concentración de lactosa disponible en los productos de fermentación obtenidos a través de
fermentaciones bajo las mismas condiciones pero variando la escala en un 700%. Sin
embargo, es de notar que con el cambio de escala del proceso se vio favorecido el desarrollo
de B. infantis. Estas diferencias se produjeron por las condiciones de anaerobiosis
establecidas en cada una de los procesos de fermentación, ya que los demás parámetros
establecidos para la obtención de yogurt de cabra probiótico fueron los mismos. Por lo que
la inyección de nitrógeno (a un flujo de 10 mL/min durante 5 minutos) directamente en el
reactor fueron favorables para el desarrollo de B. infantis.
En ambos productos obtenidos a diferente escala se obtuvo una concentración mayor a la que
se buscaba obtener ( 1.0 x 108 UFC/mL de B. infantis), lo cual es favorable si se pretende
escalar a nivel industrial el proceso ya que con los resultados de esta investigación se sientan
precedentes de que es posible la obtención de un producto probiótico tipo yogurt natural
utilizando leche de cabra como sustrato y en particular con este tipo de bacteria.

Identificación de B. infantis ATCC 17930 a través de PCR y electroforesis.

En la figura 1 parecen los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en donde se

corrieron las muestras que correspondían al ADN extraído de los productos probióticos
elaborados (obtenido de las fermentaciones de 3.5 L) denominadas como D y E. El carril M
corresponde al marcador de peso molecular, los carriles X a los controles negativos (sin
ADN) y los carriles M a los controles positivos (cepa pura de B. infantis ATCC 17930). En
dicha figura puede observarse la banda característica de 828 pb que hace posible la
identificación de B. infantis en las muestras del producto probiótico obtenido, con lo cual se
logra la finalidad de la implementación de este método molecular (Valeria Diaz s.f).

EEDDBB XXM

2500 pb

2000 pb

1500 pb

1000 pb

800 pb

600 pb

400 pb

200 pb
Figura 1 Electroforesis en gel de agarosa al 2% de la amplificación de la secuencia 16S
rRNA de B. infantis ATCC 17930 presente en yogurt natural de leche de cabra.
 Variables en los procesos de obtención de yogurt probiótico de leche de cabra.

3.5 REFRACTOMETRÍA
La reflectometría es una técnica analítica que consiste en medir el índice de refracción
de un líquido para estudiar su composición si es una solución o su pureza si es una
sustancia. Las determinaciones refractométricas se basan principalmente en el
supuesto de que un aumento en la densidad de una solución da como resultado un
aumento en el valor del índice de refracción. Por tanto, si se produce un gradiente de
concentración en una solución, se puede esperar que el cambio en el índice de
refracción sea proporcional(Revista Eureka sobre Enseñanza y Divulgación de las
Ciencias, s. f.) .

Para describir las direcciones de propagación de la luz, suele ser conveniente

representar una onda de luz en términos de rayos. La representación de estas ondas
en forma de rayos es la base de la óptica geométrica. Cuando una onda de luz golpea
una interfaz suave que separa dos materiales transparentes (como el aire y el agua),
la onda generalmente se refleja en parte y también se refracta (transmite) en parte al
segundo material. Describimos las direcciones de los rayos incidentes, reflejados y
refractados (transmitidos) en una interfaz suave entre dos materiales ópticos en
términos de los ángulos que forman con la normal (perpendicular) a la superficie en
el punto de incidencia.

𝐶
𝑛=
𝑉

Los estudios experimentales de las direcciones de los rayos incidentes, reflejados y

refractados en una interfaz suave entre dos materiales ópticos llevaron a las siguientes
conclusiones:

 Los rayos incidentes, reflejados y refractados, así como la normal a la

superficie, se encuentran todos en el mismo plano. Los diagramas de rayos
siempre se dibujan de tal manera que los rayos incidentes, reflejados y
refractados se encuentren en el plano del diagrama.
 El ángulo de reflexión θr es igual al ángulo de incidencia θi para todas las
longitudes de onda y para cada par de materiales. Esta relación, junto con la
 observación de que el rayo incidente, el rayo reflejado y la normal se
encuentran en el mismo plano, se denomina ley de reflexión.
 Para luz monocromática y para un par de materiales dado, «i» y «t» en lados
opuestos de la interfaz, la relación de los ángulos sinusoidales θi y θt, donde
los dos ángulos se miden desde la normal a la superficie, es igual al recíproco
de la relación de los dos índices de refracción: (Revista Eureka sobre
Enseñanza y Divulgación de las Ciencias, s. f.)

𝑠𝑒𝑛𝜃𝑖 𝑛𝑡
=
𝑠𝑒𝑛𝜃𝑡 𝑛𝑖

Este comportamiento, que la luz exhibe cuando pasa a través de un material y pasa a
otro medio, nos permite percibir un objeto bajo el agua como si estuviera en una
posición más cercana a la posición que realmente ocupa. Esto se debe a que los rayos
de luz que emanan de objetos sumergidos en agua se desvían de la normal cuando
entran en el aire.

FUNCIONAMIENTO DEL REFRACTÓMETRO

El refractómetro es un instrumento utilizado para medir el índice de refracción de una

sustancia. Su funcionamiento se basa en el principio de la refracción de la luz al pasar
de un medio a otro. Cuando la luz atraviesa una sustancia, su velocidad y dirección
cambian debido a las propiedades ópticas del material. El refractómetro mide este
cambio en la dirección de la luz y lo utiliza para determinar el índice de refracción de
la sustancia. El fundamento del refractómetro se puede resumir en los siguientes
puntos:

 Principio de la refracción: Cuando la luz pasa de un medio a otro, su velocidad

y dirección cambian debido a las diferencias en el índice de refracción de los
medios. El refractómetro aprovecha este principio para medir el índice de
refracción de una sustancia.
  Prisma o prisma de Abbe: El refractómetro utiliza un prisma o prisma de Abbe
para desviar la luz y medir el ángulo de refracción. El prisma está hecho de
un material con un índice de refracción conocido y tiene una forma específica
que permite la desviación de la luz.
 Escalas de medición: El refractómetro está equipado con escalas de medición
que permiten leer directamente el índice de refracción de la sustancia. Estas
escalas pueden ser lineales o angulares, dependiendo del diseño del
refractómetro.
 Calibración: Para obtener mediciones precisas, es importante calibrar el
refractómetro utilizando sustancias de referencia con índices de refracción
conocidos. Esto asegura que las lecturas del refractómetro sean confiables y
precisas.

TIPOS DE REFRACTÓMETROS:

En general, se puede utilizar un refractómetro de mano o un refractómetro digital para

realizar la medición de contenido de azúcar en el yogur. Estos son algunos tipos
comunes de refractómetros que se utilizan en la industria alimentaria:

Refractómetro de mano: Estos son dispositivos portátiles que se pueden sostener en

la mano y son adecuados para mediciones rápidas y en el lugar. Tienen una escala de
lectura directa y generalmente son fáciles de usar.

Refractómetro digital: Estos refractómetros utilizan tecnología digital para medir el

índice de refracción y convertirlo en una lectura de contenido de azúcar. Proporcionan
resultados precisos y suelen tener una pantalla digital para mostrar la lectura.

Es importante tener en cuenta que la elección del refractómetro puede depender de

las necesidades específicas del laboratorio o de la industria en la que se utiliza. Es
recomendable consultar con un proveedor o experto en instrumentos de medición
para obtener recomendaciones más específicas sobre el tipo de refractómetro
adecuado para medir el contenido de azúcar en el yogur.

REFRACTÓMETRO EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Un refractómetro es un instrumento que se utiliza para medir el índice de refracción

de una sustancia, que es una medida de cómo se desvía la luz al pasar a través de la
sustancia. En el análisis de alimentos, el refractómetro se usa comúnmente para
determinar el contenido de azúcar de una muestra, que es un parámetro importante en
el control de calidad y el desarrollo de productos. A continuación, se muestran
algunas formas en que se utilizan los refractómetros en el análisis de alimentos:

 Análisis del contenido de azúcar: los refractómetros se utilizan para medir el

contenido de azúcar de diversos productos alimenticios, como frutas, jugos y
jarabes. El contenido de azúcar se mide colocando unas gotas de la muestra
en el prisma del refractómetro y leyendo el valor del índice de refracción en
la escala. Luego, la lectura del índice de refracción se convierte en contenido
de azúcar utilizando una curva de calibración o una ecuación matemática
específica del alimento que se analiza.
 Estimación de la madurez de la uva: Los refractómetros se utilizan para
estimar la madurez de la uva en la industria vitivinícola. El contenido de
azúcar de las uvas es un indicador importante de la madurez. y los
refractómetros se utilizan para medir el contenido de azúcar del jugo de uva.
Esta información se puede utilizar para determinar el momento óptimo para
la cosecha de las uvas.
 Análisis de control de calidad: los refractómetros se utilizan en la fabricación
de alimentos para garantizar que los productos cumplan con las
especificaciones o estándares deseados. Por ejemplo, en la producción de
alimentos de fruta carica, el contenido de azúcar se analiza utilizando un
refractómetro para garantizar que el producto cumpla con los límites de
control de calidad.
 Evaluación no destructiva de la calidad de los alimentos: los refractómetros
se pueden utilizar junto con otras técnicas espectroscópicas, como la
 espectroscopia Raman, para evaluar la calidad de los productos alimenticios.
Por ejemplo, en el análisis de jugos de arándanos, se utilizó la espectroscopia
Raman para predecir el contenido de azúcar y carbohidratos. de los espectros
Raman, y los resultados se compararon con los obtenidos con un
refractómetro y los productores (Ciaccheri et al., 2017).

En general, el refractómetro es un instrumento versátil que se puede utilizar en

diversas aplicaciones en el análisis de alimentos. Su simplicidad, velocidad y
precisión lo convierten en una herramienta valiosa para el control de calidad y el
desarrollo de productos en la industria alimentaria.

ANÁLISIS DE YOGURT

El análisis de yogur usando el refractómetro es una técnica común en la industria

alimentaria para determinar los grados brix, que es una medida de la concentración
de azúcar en una solución. El refractómetro es un instrumento comúnmente utilizado
en el análisis del yogur. Mide el índice de refracción de una sustancia, que es una
medida de cómo se desvía la luz al pasar a través de la sustancia. En el caso del yogur,
el refractómetro se utiliza para determinar el contenido de azúcar, que es un parámetro
importante en el control de calidad y desarrollo del producto. Aquí está la
metodología para analizar el yogur usando un refractómetro(Huincho, s. f.).

 Preparación de la muestra: Tome una muestra representativa de yogur y

asegúrese de que esté bien mezclada para obtener una muestra homogénea.
 calibración: Antes de comenzar el análisis, calibre el refractómetro utilizando
una solución de calibración con un índice de refracción conocido. Esto
garantiza mediciones precisas.
 Medición: Coloque unas gotas de la muestra de yogur en el prisma del
refractómetro. Cierre la tapa para evitar burbujas de aire. Permita que la
muestra alcance el equilibrio térmico con el refractómetro.
 Lectura: Mire a través del ocular del refractómetro y ajuste el enfoque hasta
que el límite entre las áreas claras y oscuras sea nítido. Lea el valor del índice
de refracción en la escala.
  Conversión Convierta la lectura del índice de refracción al parámetro deseado,
que en este caso es el contenido de azúcar. Esto se puede hacer usando una
curva de calibración o una ecuación matemática específica del yogur que se
está analizando.
 Interpretación: Comparar el contenido de azúcar obtenido del refractómetro
con las especificaciones o estándares deseados para yogur. Esta información
se puede utilizar con fines de control de calidad o para ajustar la formulación
del yogur.

Es importante señalar que el refractómetro no se limita a analizar el contenido de

azúcar en el yogur. También se puede utilizar para otros análisis, como determinar el
total de sólidos solubles, que incluye azúcares, ácidos orgánicos y otras sustancias
disueltas. La metodología específica puede variar según el propósito del análisis y los
requisitos específicos del fabricante o laboratorio del yogur.

3.6 CONTAJE EN MICROSCOPIO Y RECUENTO EN PLACAS

CÁMARA NEUBAUER
Una cámara Neubauer es un tipo de hemocitómetro, que es un dispositivo de
laboratorio que se utiliza para contar células en una muestra. Consiste en un
portaobjetos de vidrio con una rejilla grabada y un cubreobjetos de vidrio que se
coloca encima de la rejilla. La cuadrícula se divide en cuadrados de tamaño
conocido y las células se pueden contar colocando una muestra en el portaobjetos
y observándola bajo un microscopio. La cámara Neubauer es un tipo específico de
hemocitómetro que se usa comúnmente para contar células sanguíneas(Neubauer
et al., 2008).

El principio de funcionamiento de la cámara Neubauer se basa en la observación

microscópica de una muestra de líquido que se ha diluido en una solución
conocida. La cámara tiene una cuadrícula grabada en su superficie, que se utiliza
para contar las células presentes en la muestra. La cuadrícula está dividida en áreas
de 1 mm², y cada área contiene una serie de cuadrados más pequeños. Al contar el
número de células presentes en varios cuadrados pequeños, se puede determinar
la concentración de células en la muestra. La cámara Neubauer se utiliza combinada
en laboratorios de biología y medicina para contar células sanguíneas, bacterias y
otros tipos de células (Pineda Merlo et al., 2022).

ELECCIÓN DE LAS ZONAS DE MUESTREO

Con el fin de poder aislar cepas de posibles probióticos, se eligieron para la toma
de muestras diversas zonas de Perú. Una vez obtenidas las muestras,
adecuadamente identificadas y acompañadas de las fichas correspondientes, se
procedió a su envío en condiciones controladas de refrigeración hasta el laboratorio.

Tras la recepción de las muestras en el laboratorio, se llevó a cabo la siembra de

las mismas, con el fin de proceder al aislamiento de las cepas de Lactobacillus con
posible potencial probiótico.

PROCESADO DE LAS MUESTRAS

A partir de alícuotas de las muestras se procedió a llevar a cabo el pre-

enriquecimiento a modo de activación en diversos medios de cultivo, dependiendo
del microorganismo que se deseaba aislar, durante 3-4 horas en una bolsa de
Stomacher (Bag mixer) o en un contenedor estéril.

En este sentido los medios de cultivo de pre-enriquecimiento seleccionados, fueron:

 Caldo MRS (Liofilchem) para BAL en general, y en particular para especies

de los géneros Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus.
 Caldo M17 (Liofilchem) para especies del género Lactococcus.
 Caldo Pal-P (Standa) para especies del género Propionibacterium.
 TSB (Liofilchem) para especies del género Streptococcus.

Tras la pre-incubación de las diversas alícuotas, se procedió a preparar bancos de

diluciones decimales seriadas de cada alícuota en PBS. Posteriormente se realiza
la siembra en los medios de cultivo para el aislamiento específico de cada grupo de
microorganismos.

A partir de las cepas aisladas de las muestras de heces, se procedió a la selección

de aquéllas que cumplían las características que presumiblemente permitían
considerarlas como BAL de interés para nuestro estudio.

Se obtuvo un cultivo o/n de los microorganismos en estudio en 3 mL de caldo MRS,

con la finalidad de tener un cultivo reciente. Simultáneamente, se descongeló la
cantidad de mucus gastrointestinal requerido (de estómago, de intestino delgado o
de intestino grueso).

Tras 18 horas de incubación se inoculó una alícuota de 300 µL del cultivo a 3 mL de

caldo MRS con 5 µL de timidina tritiada. Se agitó y se incubó durante 24 horas a 37
ºC.

Al mismo tiempo se preparó la placa de mucus. Se realizaron dos diluciones del

mucus en PBS (1:100). A continuación, se inoculó cada pocillo con 2,5 mL de esta
dilución en placa. Se tapó y se guardó en nevera (24 horas) con el fin de que la
mucina sedimentara.

Transcurridas 24 horas se centrifugaron los medios de cultivo inoculados con

timidina tritiada a 8000 rpm, durante 10 minutos. El sobrenadante se guardó en
viales de centelleo para el posterior análisis. Se rotularon como X. Se resuspendió
el precipitado obtenido en 3 mL de PBS y se centrifugó a 8000 rpm durante 10
minutos. Se ajustó la concentración en cámara de Neubauer en PBS para alcanzar
la concentración deseada (±2x108 UFC/mL).

A continuación, se realizaron tres lavados de la placa de mucus con PBS, dejando

200 µL en el pocillo para que no se secara la mucina. En este punto del ensayo, se
añadieron a cada pocillo 500 µL del cultivo tritiado (por triplicado) ajustado a la
concentración deseada.

Se incubó durante 60 minutos a 37 ºC en ambiente de microaerofilia (5% CO2).

Se realizó también la siembra de cada uno de los cultivos en placa para asegurar la
concentración inoculada. Finalizada la incubación, se realizaron tres lavados con
PBS para eliminar los microorganismos no adheridos (Y). Con el último volumen de
PBS se realizó un raspado. El material recuperado se nombró como C.
IV. CONCLUSIONES

Se ha llegado a la conclusión que se puede hacer diversos análisis por instrumentación

al yogurt, como es el caso de la espectrofotometría que ayuda a determinar el contenido
del Calcio o el desarrollo de un PCR y electroforesis que ayudo a la Identificación de
B. infantis como ya se mostró en una de las tesis presentadas en este trabajo , También
se puede hacer contaje en microscopio y recuento en placas de las bacterias lácticas
,otras de las técnicas es el análisis de yogur usando el refractómetro que es común en
la industria alimentaria para determinar los grados brix, que es una medida de la
concentración de azúcar en una solución, así mismo se puede hacer análisis por el
Método Cromatografía de Gases por Detección de Ionización de llama en la que se
determinó los porcentajes de Ácido Laúrico del yogurt coco , y en caso del HPLC es
el sistema más común para la separación y detección de aditivos en la comida por
consiguiente la calidad nutricional .A través de la cromatografía, las empresas de
alimentos pueden identificar los componentes . Con este método analizan sus productos
en busca de nutrientes como proteínas, vitaminas, conservantes y más, para probar la
calidad nutricional de sus productos. Las entidades regulatorias requieren que la
mayoría de los productos envasados tengan una etiqueta de información nutricional
que describa con precisión los ingredientes del producto,
El yogurt es un producto hoy por hoy muy popular entre los consumidores, que se
obtiene de la fermentación de la leche por microorganismos específicos
(streptococcus, thermophilus y lactobacillus bulgaricus). tiene la característica de ser
altamente nutritivo sabroso y de fácil digestión. su consumo en la actualidad se ha
llevado en aumento por lo que el mercado lo demanda. las bacterias ácido-lácticas
constituyen un vasto conjunto de microorganismos benignos, dotados de propiedades
similares. la variedad de yogures que existe alrededor del mundo hace que sea muy
difícil categorizar todos los yogurts de una forma en particular , sin embargo el análisis
por instrumentación es de gran utilidad porque va a ayudar identificar ciertos
componentes.

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