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Práctica 5. - Aglutinacion y Precipitacion

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CAMPECHE

Facultad de Ciencias Químico Biológica

Químico farmaceutico biologo

Inmunologia basica

Grado y grupo: 5C

Práctica 5.- REACCIONES DE AGLUTINACIÓN Y PRECIPITACIÓN

Equipo: #5

P R E S E N T A:

Jonathan Francisco Chac Valle

Anzhony D Pool Zapata

Gabriela A Estrella Cruz

Nayomi L Montero Perez

Alejandra Loeza Justiniano

Karla N. Romero Manrique

Fecha de realización de la práctica: 11/09/2024

Fecha de entrega de la práctica: 18/09/2024


Generalidades

Las reacciones antígeno-anticuerpo juegan un papel fundamental en la inmunología,


siendo herramientas esenciales en el diagnóstico y la investigación de
enfermedades. Entre las principales reacciones inmunológicas se encuentran la
aglutinación y la precipitación, las cuales son reacciones secundarias que se
producen como consecuencia de la interacción entre antígenos y anticuerpos (Aryal,
2020) .

La reacción de aglutinación es un proceso en el que anticuerpos específicos,


llamados aglutinantes, se unen a antígenos que se encuentran en forma particular
(como células o partículas). Esta unión genera la formación de grumos visibles, que
pueden observarse a simple vista o al menos bajo el microscopio óptico. Este tipo
de reacción es utilizado comúnmente en pruebas como la tipificación sanguínea y
en la detección de bacterias o virus, donde la presencia de aglutinación confirma la
interacción entre el anticuerpo y el antígeno (Aguilar, 2004).

Otra importante reacción secundaria es la reacción de precipitación, la cual ocurre


cuando un antígeno soluble se une con su anticuerpo específico, formando redes
complejas que precipitan del medio. Este fenómeno es clave para demostrar de
manera simple y directa las reacciones antígeno-anticuerpo en el laboratorio. La
reacción de precipitación es utilizada en métodos como la inmunodifusión o la
electroforesis de inmunoprecipitación, donde el antígeno y el anticuerpo se difunden
en un gel y forman un precipitado visible cuando interactúan (Gutiérrez, 2009).

Objetivo

Que predigan qué antígenos se aglutinan y cuáles precipitaron, así como saber
distinguir experimentalmente entre estos dos tipos de reacciones

Fundamento

Se basa en la interacción entre antígenos y anticuerpos, siendo métodos utilizados


para detectar y cuantificar la presencia de estos componentes en muestras
biológicas. Ambos procesos dependen de la formación de complejos inmunes entre
los anticuerpos (proteínas producidas por el sistema inmunológico) y los antígenos
(moléculas extrañas, como proteínas, polisacáridos o partículas). Un anticuerpo se
une a múltiples sitios de unión del antígeno, y a medida que se forman más
complejos, se crea una red lo suficientemente grande como para volverse insoluble,
lo que provoca la precipitación. Las reacciones de precipitación dependen de la
proporción correcta entre antígeno y anticuerpo. Para que ocurra una precipitación
efectiva, se requiere una zona de equivalencia, donde las concentraciones de
antígeno y anticuerpo son aproximadamente equivalentes, permitiendo que se
formen grandes complejos (Azucena & Galán, 2020).

En las reacciones de aglutinación, los antígenos particulados o celulares (como


bacterias o eritrocitos) se combinan con anticuerpos específicos, lo que da lugar a la
formación de grumos visibles (aglutinados). La aglutinación ocurre cuando un
anticuerpo se une a los antígenos presentes en partículas o células (por ejemplo,
bacterias o eritrocitos). A medida que se forman complejos, las partículas se
agrupan y crean grumos visibles.
Estas reacciones también dependen de la proporción entre antígeno y anticuerpo,
pero como los antígenos están en la superficie de partículas o células, el proceso de
aglutinación es más rápido y visible que la precipitación (Aryal, 2020).

El fundamento de las reacciones de aglutinación y precipitación se basa en la


formación de complejos antígeno-anticuerpo, que se hacen visibles por la formación
de precipitados o grumos. Estas reacciones son herramientas fundamentales en el
laboratorio clínico para el diagnóstico de enfermedades, la tipificación sanguínea y
la investigación inmunológica (Azucena & Galán, 2020).

Metodología

Determinación del grupo sanguíneo “Método de placa” (Lámina de tipificación


de grupo sanguíneo)

1.- Primero se realizó una extracción de sangre al alumno/paciente Jonathan


Francisco Chac Valle, empleando un tubo de tapón morado con anticoagulante
EDTA.

Figura 1.- Foto de la extracción de la sangre al paciente/alumno


.2.- Después a la muestra extraída se le puso una solución salina

Figura 2.- Fotografía de cómo se le puso la solución salina a la muestra extraída

3.- Después se quitó el plasma restante (se extrajo con una pipeta) de la muestra
para solo dejar el paquete globular.

Figura 3.- Fotografía de la extracción del plasma del paquete globular


4.- Después centrifugamos la muestra durante 5 minutos a 3500 rps, para obtener el
plasma y el paquete globular, después se repitió el proceso.

Figura 4.- Fotografía de las muestras obtenidas puestas en el centrifugado

5.- Se colocó unas tres gotas del centrifugado (Usando claramente una pipeta) en la
“lámina de tipificación de grupo sanguíneo” o conocido coloquialmente como placa
de grupo sanguíneo.

Figura 5.- Fotografía de la placa con sus respectivas gotas en posición

6.-Ya casi terminando con este primer método se agarraron los correspondientes
antígenos para determinar la aglutinación de los siguientes antígenos los cuales
fueron Anti-A, Anti.B y Anti D, y de los cuales se puso una gota en su respectivo
lugar, esto dando como resultado a la aglutinación de uno de ellos. y finalizando el
primer método.
Figura 6.- Fotografía de la placa ahora con su respectivos “reactivos” en este caso sus antígenos
Anti-A, Anti-B y Anti D

Determinación del grupo sanguíneo “Método de tubo”

1.- Siguiendo los mismos pasos del método de placa, se tomarán en cuenta los
pasos 1,2 ,3 y 4 para este método ya que en este sentido inician de manera similar.

Figura 7 y 8.- Muestra de la sangre antes (Izquierda)y después (Derecha) de la centrifugación

2.- Ahora como añadido de este método se preparó una suspensión de eritrocitos al
5%

Figura 9.- Imagen de la suspensión al 5 % de eritrocitos


3.- Después se roturaron 4 tubos de ensayo con las letras A, B, AB y Rh esto
claramente relacionado a donde iría cada antígeno, Luego en cada tubo se agregó
una gota de la suspensión al 5% y una gota del antisuero correspondiente. Después
se le colocó Parafilm (La centrifugadora) y claramente se centrifugó durante 30
segundos a 1500 rps.

Figura 10.- Tubos rotulados con su gota de antígeno correspondiente después de la centrifugación

4.- Como paso final se agitaron y se observó la dicha aglutinación por método de
tubo.

Técnica empleada

Determinación de grupos sanguíneos

Este es un método para indicar cuál es el tipo de sangre que tenga el


paciente/donante, la determinación del grupo sanguíneo se realiza para que se
pueda donar sangre o recibir una transfusión de sangre de manera segura, de la
misma forma, también se realiza para ver si el individuo posee una sustancia
llamada factor Rh en la superficie de sus glóbulos rojos.

Dependiendo de qué tipo de sangre tenga el individuo, determinará si hay o no


ciertas proteínas en sus glóbulos rojos, estas proteínas se llaman antígenos, y su
tipo de sangre (o grupo sanguíneo) depende de qué tipos de sangre heredó de sus
padres, la sangre a menudo se clasifica de acuerdo con el sistema de tipificación
ABO y existen cuatro tipos de sangre principales, que son: Tipo A, Tipo B, Tipo AB,
y Tipo O.
Preparación de la muestra

● Se obtiene la muestra por medio del paciente, generalmente utilizando


sangre venosa, y la muestra se coloca en un tubo con anticoagulante para
evitar la coagulación.

Reacción de tipo ABO

Preparación del Suero de Tipificación

● Se preparan dos tipos de sueros, cada uno con anticuerpos anti-A y anti-B.

Mezcla de Sangre con Sueros

● Suero anti-A: Se coloca una pequeña cantidad de suero anti-A en una placa
de prueba o tubo.
● Suero anti-B: Se coloca una pequeña cantidad de suero anti-B en otra placa
de prueba o tubo.
● Sangre del paciente: Se mezcla una pequeña cantidad de sangre del
paciente con cada uno de los sueros en las respectivas placas o tubos.

Incubación

Se incuba la mezcla durante un tiempo específico para permitir la reacción.

Observación de la Reacción

● Si el suero anti-A aglutina la sangre, esto indica la presencia del antígeno A y,


por lo tanto, el grupo sanguíneo es A.
● Si el suero anti-B aglutina la sangre, esto indica la presencia del antígeno B y,
por lo tanto, el grupo sanguíneo es B.
● Si no hay aglutinación con ninguno de los sueros, la sangre es del grupo O.
● Si hay aglutinación con ambos sueros, el grupo sanguíneo es AB.

Determinación de factor Rh

Preparación del Suero Anti-Rh

● Se utiliza un suero específico que contiene anticuerpos contra el antígeno Rh.


Mezcla de Sangre con Suero Anti-Rh

● Se coloca una pequeña cantidad de suero anti-Rh en una placa de prueba o


tubo.
● Se mezcla una pequeña cantidad de sangre del paciente con el suero
anti-Rh.

Incubación

● Se incuban las mezclas durante el tiempo especificado.

Observación de la Reacción

● Si hay aglutinación, el factor Rh está presente, y la sangre se clasifica como


Rh positivo (Rh +).
● Si no hay aglutinación, el factor Rh no está presente, y la sangre se clasifica
como Rh negativo (Rh-).

Resultados

Se emplearon dos técnicas, una se realizó en placa y la otra en tubo, esto con el fin
de corroborar si el tipo de sangre era el correcto lo cual nos ayudó a sustentar que
el procedimiento se realizó de manera adecuada.

Técnica en placa: Se observaron las reacciones por cada división de la lámina, en


este caso: Anti A, Anti B, Anti D , con apoyo de sus respectivos reactivos e
interacción con la muestra sanguínea, se obtuvo una aglutinación en el sitio de
Anti- D, lo que nos indicó la presencia del factor Rh.

Figura 11.- Imagen de la aglutinación en placa


Técnica en tubo de ensayo: Para esta técnica fue necesario realizar el lavado
eritrocitario. Se hicieron dos lavados y por cada uno se calibró 3,500 rpm en la
centrífuga , acto seguido se elaboró la suspensión y se centrifugó a 1,500 rpm, el
resultado se observó en 4 tubos de ensayo , con los reactivos añadidos se
obtuvieron los siguientes resultados:

Anti-A Anti- B Anti- AB Anti-Rh


(-) (-) (-) (+)

Figura 12.- Imagen de la aglutinación en tubo

Interpretación de resultados

Al finalizar la práctica, por medio del procedimiento, se pudo identificar que el tipo de
sangre obtenido del individuo es O +, por lo que el método empleado fue concebido
de forma grata, gracias a ello se dió la aparición de aglutinación del reactivo Rh, en
el que comparamos con los antígenos A, B y AB, en los cuales no hubo alguna
reacción, por ende, llegamos al resultado identificado como negativo por lo cual, se
corroboró que el tipo de sangre del individuo es O +.

Conclusiones

La determinación del tipo de sangre O + indica que el individuo tiene el tipo de


sangre O, lo que significa que carece de antígenos A y B en la superficie de los
glóbulos rojos, pero presenta el antígeno Rh positivo, este resultado es de suma
importancia clínica, ya que el tipo de sangre O + es considerado el donante
universal para transfusiones de glóbulos rojos, por lo que lo hace valioso en
situaciones de emergencia, por otra parte, al tener el conocimiento del tipo sangre
del individuo podemos saber cómo utilizarla y no causar reacciones adversas
transfusiones e incluso en el manejo del embarazo, entonces, al determinar el tipo
de sangre del individuo no solo logramos prevenir alguna situaciones no deseadas,
si no que nos ayuda y proporciona información y características para un mejor
empleo del tipo de sangre que se esté empleando/requiriendo.

Observaciones

-Al momento de extraer el paquete globular del plasma se agarró una pequeña
porción del tubo.

-Hubo confusión al momento de hacer la solución con los cálculos ya que se estaba
realizando en 2 tubos más y no en uno solo para identificar el grupo sanguíneo.

Cuestionario :

1. ¿Cuál es la diferencia fundamental entre aglutinación y precipitación?

La aglutinación implica la agrupación de células o partículas por anticuerpos,


mientras que la precipitación se refiere a la formación de complejos insolubles entre
antígenos solubles y anticuerpos (Mendez, 2015).

2. ¿Por qué es importante la fuerza iónica del medio en que se realiza una
reacción de aglutinación?

La fuerza iónica del medio controla el equilibrio entre las fuerzas repulsivas y
atractivas en la reacción, esto influye directamente en la efectividad y la visibilidad
de la aglutinación (Valdes & Hernández, 2001).

3. Describa los diferentes tipos de aglutinación.

Aglutinación directa: Ocurre cuando los anticuerpos se unen directamente a los


antígenos presentes en la superficie de células o partículas, como en el caso de los
grupos sanguíneos. Por ejemplo, en las pruebas de tipo de sangre, los anticuerpos
específicos se unen a los antígenos en las células rojas de la sangre (Aryal, 2020).

Aglutinación indirecta (o pasiva): Se produce cuando los antígenos no están


presentes en su forma natural, sino que se han adsorbido a un portador, como una
partícula inerte (por ejemplo, esferas de látex). Los anticuerpos se unen a estos
antígenos absorbidos en las partículas, formando un complejo visible. Este tipo de
aglutinación es común en pruebas de diagnóstico como las pruebas de aglutinación
con látex (Aryal, 2020).

Aglutinación cruzada: Ocurre cuando los anticuerpos en una muestra reaccionan


con antígenos similares pero distintos en diferentes partículas. Esto puede ser
utilizado para detectar reacciones cruzadas en pruebas serológicas (Aryal, 2020).

Aglutinación reversible: Se refiere a la formación de complejos de aglutinación


que pueden deshacerse al cambiar las condiciones del medio, como la
concentración de sales o el pH (Aryal, 2020).

Aglutinación irreversible: En este caso, los complejos de aglutinación formados no


se deshacen fácilmente y suelen ser estables bajo las condiciones del experimento
(Aryal, 2020).

4. En la hemoclasificación, ¿qué reactivos se le denominan aglutininas frías y


a cuál calientes y por qué?
Las aglutininas frías son anticuerpos que reaccionan mejor a temperaturas bajas,
generalmente a temperaturas inferiores a 37°C. El anticuerpo más conocido en esta
categoría es el anticuerpo anti-A y anti-B que puede causar aglutinación a
temperaturas de 4°C o incluso a temperatura ambiente. Estos anticuerpos pueden
causar problemas como la hemólisis fría en transfusiones o en algunas
enfermedades autoinmunes (Medlineplus.gov, 2022).

Las aglutininas calientes son anticuerpos que reaccionan mejor a temperaturas


corporales normales, es decir, alrededor de 37°C. El anticuerpo más común en esta
categoría es el anticuerpo anti-D en el sistema Rh, que causa aglutinación a
temperatura corporal. Estos anticuerpos son relevantes en la mayoría de las
reacciones transfusionales y en la enfermedad hemolítica del recién nacido
(Medlineplus.gov, 2022).

5. ¿Cuál es el fundamento de las pruebas de Coombs y Wiener?

La prueba de Coombs es un examen diagnóstico que busca identificar la presencia


de anticuerpos fijados en los glóbulos rojos de la sangre y que causan su
destrucción prematura. Los glóbulos rojos son el componente más abundante en la
sangre y son responsables de transportar el oxígeno a todas las células del cuerpo,
por lo que su pronta destrucción significaba un riesgo para la salud de la persona
(Aliaga, 2024).
Existen dos tipos de prueba de Coombs:

Prueba de Coombs indirecta: También se conoce como prueba indirecta de


antiglobulinas. Esta prueba se utiliza para detectar aquellos anticuerpos que actúan
libremente contra determinados glóbulos rojos (Aliaga, 2024).

Prueba de Coombs directa: Detecta anticuerpos fijados a la superficie de los


glóbulos rojos y que ocasionan su destrucción (Aliaga, 2024).

La prueba de Wiener, también conocida como prueba de antiglobulina humana, se


basa en principios similares a los de la prueba de Coombs. Fue desarrollada para
detectar anticuerpos sensibilizantes que no causan aglutinación directa de los
glóbulos rojos, pero que pueden ser detectados mediante la adición de suero
anti-humano (Ortiz, 2018).

6. ¿Cuál es la importancia de lavar los eritrocitos perfectamente antes de


realizar las pruebas?
Lavar los eritrocitos es esencial en una prueba de aglutinación para evitar que
sueros residuales o proteínas no específicas interfieran con la reacción. Esto
garantiza que la aglutinación observada sea únicamente el resultado de la
interacción entre los anticuerpos y los antígenos específicos en los eritrocitos, lo que
asegura una determinación precisa del grupo sanguíneo y el factor RH (Gil, 2023).

7. ¿Cuál es el potencial z de los eritrocitos? ¿Cómo se reduce?


El potencial z de los eritrocitos es la carga eléctrica en la interfaz entre la superficie
celular y el medio circundante. Este potencial afecta la forma en que las células se
repelen o atraen entre sí, influyendo en su aglutinación y sedimentación. Para
reducirlo se puede hacer por medio del uso de soluciones salinas, como cloruro de
sodio (NaCl), utilizar agentes de aglutinación, sustancias como el polietilenglicol
(PEG) y modificando el pH del medio (Bolívar, 2020).

8. Describa las técnicas de difusión

Inmunodifusión (Immunodiffusion): En esta técnica, solo uno de los reactivos


(antígeno o anticuerpo) se difunde a través del gel, mientras que el otro permanece
inmovilizado. Normalmente, el antígeno es el que se difunde desde un pozo central
en un gel que contiene anticuerpos distribuidos de manera uniforme. A medida que
el antígeno se difunde radialmente desde el pozo, forma un complejo con el
anticuerpo inmovilizado en el gel. Cuando las concentraciones son óptimas, se
forma un precipitado visible como un anillo alrededor del pozo (Villamontes, 2017).
Se utiliza para la cuantificación de antígenos. El diámetro del anillo de precipitación
es proporcional a la concentración del antígeno. Técnica de Mancini, comúnmente
usada para cuantificar inmunoglobulinas en suero (Villamontes, 2017).

Inmunoelectroforesis: Esta técnica combina la electroforesis con la difusión de


antígenos y anticuerpos. Se utiliza un campo eléctrico para separar los
componentes proteicos de una muestra en el gel, seguido por la difusión de los
anticuerpos para formar complejos con los antígenos. En la primera etapa, los
antígenos se separan por su carga eléctrica mediante electroforesis en un gel. En la
segunda etapa, los anticuerpos se aplican a un canal paralelo y se difunden hacia
los antígenos separados. Esto da lugar a la formación de líneas de precipitado entre
los antígenos y sus respectivos anticuerpos (Spiegato.com, 2023).

Se usa para la separación e identificación de múltiples antígenos presentes en una


mezcla compleja, como el suero sanguíneo. Es particularmente útil en estudios de
proteínas séricas y gammaglobulinas. Identificación de inmunoglobulinas (IgG, IgM,
IgA) y otras proteínas séricas (Spiegato.com, 2023).

Inmunodifusión en Gel con Contraelectroforesis: Similar a la


inmunoelectroforesis, esta técnica utiliza un campo eléctrico para acelerar el
proceso de difusión, haciendo que los antígenos y anticuerpos se muevan en
direcciones opuestas en el gel. Se colocan los antígenos y anticuerpos en pozos
opuestos del gel. Bajo la influencia de un campo eléctrico, los antígenos migran
hacia un lado y los anticuerpos hacia el lado opuesto. Cuando se encuentran,
forman un precipitado visible en menos tiempo que en la inmunodifusión pasiva. Es
útil cuando se necesita obtener resultados rápidos, por ejemplo, en la detección de
antígenos de bacterias o virus en infecciones agudas (Mendez, 2015).
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