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    2-Enzimas de Restriccion

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    Manuela Tejada
    Este documento describe las enzimas de restricción, incluyendo su reconocimiento de secuencias específicas de ADN, los tipos de cortes que realizan, y los tipos de extremos que generan. También discute cómo la metilación del ADN puede afectar la actividad de estas enzimas y cómo se pueden usar para estudiar la regulación epigenética de genes.

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    2-Enzimas de Restriccion

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    Manuela Tejada
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    Este documento describe las enzimas de restricción, incluyendo su reconocimiento de secuencias específicas de ADN, los tipos de cortes que realizan, y los tipos de extremos que generan. También discute cómo la metilación del ADN puede afectar la actividad de estas enzimas y cómo se pueden usar para estudiar la regulación epigenética de genes.

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    Enzimas de Restriccion

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    Este documento describe las enzimas de restricción, incluyendo su reconocimiento de secuencias específicas de ADN, los tipos de cortes que realizan, y los tipos de extremos que generan. También discute cómo la metilación del ADN puede afectar la actividad de estas enzimas y cómo se pueden usar para estudiar la regulación epigenética de genes.

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    ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

    Secuencias de
    Sitio de corte reconocimiento Sitio de corte

    ADN
    cromosómico

    Extrem os s Extremos romos


    cohesivo

    ADN
    Liga a
    s
    Vector de clonación
    digerido con EcoRI y
    PvuII
    Tipos de enzimas de restricción

    Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrómicas, 4-7 pb. Sitio de


    corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia
    Restricción-modificación

    m
    EcoR G-A-A-T-
    I T-C G-A-A-T-T-C
    C-T-T-A- C-T-T-A-A-G
    m A-G EcoRI
    G-A-A-T- m
    T-C G-A-A-T-T-C
    C-T-T-A- C-T-T-A-A-G
    A-G
    m
    G A-A-T-T-C
    EcoRI
    C-T-T-A-A G
    m
    G-A-A-T-
    T-C
    C-T-T-A-
    La metilación del ADN en eucariotas superiores está relacionada con la
    regulación de la transcripción. El uso de algunas enzimas de
    restricción específicas permite distinguir entre ADN metilado y no
    metilado, obteniéndose de esta manera información sobre la posible
    regulación de la expresión de un gen por metilación del ADN

    Vertebrados: metilación de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-


    metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulación de la
    transcripción.
    HpaII, MspI: isosquizómeros, reconocen C/CGG

    Plantas: metilación m5CG y m5CNG.


    Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilación:
    McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA
    sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354
    Metilación del ADN y digestión con enzimas de restricción

    Sistema dam: metila la A de la secuencia GATC en el N6, generando


    6-metiladenina: Gm6ATC.
    PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII, MboI y Sau3AI (/GATC)
    ClaI: AT/CG*AT
    XbaI: T/CTAG*A

    Sistema dcm: metila la C interna de la secuencia CC(A/T)GG en el C5, generando


    5-metilcitosina: Cm5CWGG
    EcoRII: /CCWGG, BstNI: CC/WGG
    StuI: AGG/C*CT

    DpnI: Es una enzima de restricción que corta en la secuencia GATC sólo si está
    metilada por dam (Gm6ATC). Utilizada en algunos protocolos de PCR para eliminar
    ADN plasmídico proveniente de la bacteria sin afectar al sintetizado in vitro.
    ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

    • Reconocen secuencias
    concretas
    • Simetría (palíndromes)
    Ejemplos de palíndromes

    • Dabale arroz a la zorra el abad


    • La ruta natural
    • A man, a plan, a canal: Panama
    Enzimas de restricción
    • Reconocen secuencias concretas
    • Simetría (palíndromes)
    • Número de nucleótidos en la secuencia

    N1N2N3N4 N1 N2 N3 N4 N5 N 6 N1 N2 N3 N4 N 5 N6 N7 N 8

    44 46 48
    256 4096 65536
    Sitios de corte de las endonucleasas de
    restricción del tipo II

    Tipo IIs: MboII


    Extremos protuberantes
    5’
    protuberantes
    EcoRI G-3’
    CTTAA-5’
    GAATTC

    CTTAAG
    5’-AATTC
    3’-G
    Extremos protuberantes
    3’
    protuberantes

    CTGCA-3’
    PstI G-5’

    CTGC
    AG 5’-G
    GACGTC 3’-GACGTC
    Extremos romos

    SmaI CCC-3’
    GGG-5’
    CCCGGG

    GGGCCC 5’-GGG
    3’-CCC
    Extremos compatibles (I)

    EcoRI
    GAATTC

    CTTAAG GAATTC
    EcoRI
    CTTAAG
    GAATTC

    CTTAAG
    Extremos compatibles (II)

    SalI
    GTCGAC

    CAGCTG GTCGAG
    XhoI
    CAGCTC
    CTCGAG

    GAGCTC
    Extremos romos
    (siempre compatibles)
    SmaI
    CCCGGG

    GGGCCC CCCATC
    EcoRV
    GGGTAG
    GATATC

    CTATAG
    Extremos no compatibles rellenados,
    transformados en romos
    (siempre compatibles)

    EcoRI
    GAATTC GAATT-3’
    -3’
    CTTAA-5’
    CTTAAG GAATTTCGAG
    XhoI + dNTPs
    CTCGAG 5’-TCGAG CTTAAAGCTC
    3’-AGCTC
    3’-
    GAGCTC
    •Degradado de cadena sencilla
    Extremos no compatibles
    transformados en compatibles
    • Rellenado parcial
    HindIII
    AAGCTT AAG-3’
    -3’
    TTCGA-5’
    TTCGAA AAGCTAGA
    XbaI + dATP, + dGTP
    TCTAGA 5’-CTAGA TTCGATCC
    3’-TCC
    3’-
    AGATCT
    + dCTP, + dTTP
    Precauciones

    • Actividad “star”

    • Metilación
    Aspectos prácticos

    Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 g de ADN en 1 hora a la


    temperatura y condiciones óptimas.

    Inhibición: Adición de 20 mM EDTA.


    Inactivación: Por calor o tratamiento con fenol-CIA

    Dos enzimas de restricción pueden utilizarse simultáneamente siempre


    que compartan las mismas condiciones de digestión (temperatura, pH,
    concentración de sales)

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