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    16 - Pruebas Diagnósticas para Vih

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    Anderson Gil
    Este documento resume diferentes pruebas diagnósticas para la detección del VIH, incluyendo métodos indirectos como ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), pruebas rápidas, Western Blot e inmunofluorescencia indirecta, y métodos directos como cultivo viral, detección de antígeno p24 y detección molecular de carga viral. Explica los principios, ventajas e inconvenientes de cada método.

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    16 - Pruebas Diagnósticas para Vih

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    Anderson Gil
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    Este documento resume diferentes pruebas diagnósticas para la detección del VIH, incluyendo métodos indirectos como ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), pruebas rápidas, Western Blot e inmunofluorescencia indirecta, y métodos directos como cultivo viral, detección de antígeno p24 y detección molecular de carga viral. Explica los principios, ventajas e inconvenientes de cada método.

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    16- Pruebas Diagnósticas Para Vih

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    16- Pruebas Diagnósticas Para Vih

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    Este documento resume diferentes pruebas diagnósticas para la detección del VIH, incluyendo métodos indirectos como ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), pruebas rápidas, Western Blot e inmunofluorescencia indirecta, y métodos directos como cultivo viral, detección de antígeno p24 y detección molecular de carga viral. Explica los principios, ventajas e inconvenientes de cada método.

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    16 - Pruebas Diagnósticas para Vih

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    Este documento resume diferentes pruebas diagnósticas para la detección del VIH, incluyendo métodos indirectos como ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), pruebas rápidas, Western Blot e inmunofluorescencia indirecta, y métodos directos como cultivo viral, detección de antígeno p24 y detección molecular de carga viral. Explica los principios, ventajas e inconvenientes de cada método.

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    PRUEBAS DIAGNÓSTICAS

    PARA VIH
    ÁNGELA VICTORIA YOVERA PUICAN
    MÉDICO PATÓLOGO CLÍNICO
    Morfología
    y Estructura del HIV
    Conceptos Básicos Envelope
    • Familia: Retroviridae

    • Género: Lentivirus

    • Forma esférica, ≈110nm, RNA

    • 5´-gag-pol-env-3´

    Capsíde
    viral

    TR integrase
    e protease
    HIV1
    Provirus
    ciclo de vida del HIV
    Pruebas laboratoriales
    INDICACIONES
     Adolescentes y adultos entre 13- 64 años que tienen o han tenido
    relaciones sexuales sin protección o con pareja inestable.
     Antecedentes de infección de transmisión sexual.
     Antecedente de tatuaje o piercing con instrumentos parcialmente
    contaminados.
     Usuarios de drogas intravenosas.
    Contactos de caso positivo. Consentimiento
     Solicitud voluntaria de la prueba.
    informado- consejería
    Niño, hijo de madre positiva.
    Pruebas laboratoriales
    MÉTODOS INDIRECTOS MÉTODOS DIRECTOS

    • Pruebas rápidas . • Cultivo vírico.


    • EIA. • Detección de antigenemia
    (antígeno p24).
    • Western blot.
    • Detección molecular de ADN
    • Inmunofluorescencia indirecta provírico y ARN vírico.
    (IFI). • Reacción en cadena de la
    polimerasa (PCR).
    •Radioinmunoprecipitación (RIPA). • ADN ramificado (bDNA).
    •Inmunoensayo lineal (LIA). • Amplificación basada en la
    transcripción o TMA (NASBA).
    DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
    MUESTRA
     Suero.
    Temperatura ambiente: hasta 24 horas.
     2- 8 °C: 1- 7 días.
     -20° a -80° C: más de 7 días.
     No someter las muestras a múltiples ciclos de congelación y
    descongelado.
     No deben inactivarse por calor.
    • Ensayos de cribado: identifican las muestras reactivas y deben tener
    sensibilidad superior
    • Confirmación: permite conocer si las muestras contienen anticuerpos
    específicos para el VIH ½ y deben tener especificidad superior.
    Tabla I.
    Técnicas de laboratorio para el diagnóstico de la infección por VIH

    a. Pruebas de screening serológicas

    I. Técnicas inmunoenzimáticas (EIA)


    • Primera generación: EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico,
    relativamente sensible, carecen de especificidad y se detectan a los 40 días de
    infección.
    • Segunda generación: EIA indirecto o competitivo con antígeno obtenido de proteínas
    recombinantes y/o péptidos sintéticos, detectan anticuerpos frente a subtipos M, N y
    O y frente al VIH-2. Tiempo de detección de anticuerpos: 33- 35 días de infección.
    • Tercera generación: EIA de tipo sándwich o de inmunocaptura, con antígeno obtenido
    de proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos y detección conjunta de
    anticuerpos específicos de clase IgG, IgM. Tiempo de detección 20- 25 días.
    • Cuarta generación: Detección combinada de anticuerpos específicos y antígeno p24.
    Tiempo de detección: 13- 15 días.
    ELISA
     An enzyme-labeled
    IgG, IgM, or IgA
    conjugate is added,
    and a substrate
    detects the
    presence of Ac.
    FALSO NEGATIVO:
    • Primera fase de infección hasta que se produce la
    seroconversión.
    • Estadíos finales de la infección.
    • Pacientes con tratamiento inmunosupresor.
    • Trasplantados de médula ósea.
    a. Pruebas de screening serológicas

    II. PRUEBAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICO


    • Generan resultados en menos de 30 min.
    • OMS recomienda el uso de pruebas rápidas en entornos de recursos limitados.
    • Muestra: fluido oral, sangre capilar, suero, plasma.
    • Emplean antígenos similares a los inmunoensayos.
    • No pueden identificar infecciones agudas.
    Pruebas de Detección
    ELISA
    Detección de Anticuerpos (resultado en horas)

    PRUEBAS RAPIDAS:
    Resultado en minutos

    Nos dan RESULTADOS PRELIMINARES, requieren prueba confirmatorias


    b. Pruebas confirmatorias

    I. Western blot
    II. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
    III. Inmunoensayo lineal (LIA)
    Western Blot
     Técnica mediante la cual se separan proteínas por electroforesis en
    gel de poliacrilamida y después se transfieren electroforéticamente
    a un papel de nitrocelulosa o una membrana similar, donde son
    detectadas con anticuerpos que reconocen los antígenos que hay en
    ellas.
    Etapas principales:

     Separación por electroforesis según pesos moleculares (SDS-PAGE)

     Transferencia a membrana de nitrocelulosa , incubación con suero


    problema,

     Incubación del conjugado (por ejemplo enzimático),

     Revelado y

     Examen contra patrón de pesos moleculares.


    WESTERN BLOT
    gp160
    gp120
    p6
    p51
    5
    lisado de gp41
    HIV-1 p31
    p24
    p1
    gel 8 papel de nitrocelulose

    tira após
    obtenção
    de cor
    tira de papel incubada
    papel de nitrocelulose cortado com o soro teste
    em tiras
    WESTERN BLOT

    Antígeno

    E Anticorpo
    1ario
    E
    Conjugado

    Legenda
    Esquema
    Western Blot

     Se requiere un patrón con Bandas de las siguientes Proteínas:


    p24, gp41 y gp120/160.

     Es una prueba de electroforesis de proteína.

     La desventaja es que es cara, compleja requiere de un proceso de 7


    pasos. (incubación entre 4 a 24 horas), dificultad en lectura de banda.
     Ausencia de bandas se interpreta como resultado negativo.
    Criterios de interpretación del Western blot para infección
    por el VIH, según algunos organismos internacionales
    Resultado indeterminado:
    • Infección aguda.
    • Estadío muy avanzado de la enfermedad.
    • Recién nacidos de madres seropositivas.
    • Sueros inactivados por el calor.
    • Pacientes con factor reumatoide.
    • Reacciones cruzadas con otros retrovirus.
    WESTERN BLOT
    WESTERN BLOT
    Incubacion con la muestra
    WESTERN BLOT
    Aplicacion de conjugado
    WESTERN BLOT
    Substrato - revelación
    INMUNOFLUORESCENCIA
    INDIRECTA
     Usa material humano de Células T infectadas que expresan
    antígenos de VIH-1.

     Las células se fijan a la superficie de una laminilla de vidrio, se


    utilizan células no infectadas como control.

     Cuando los anticuerpos del VIH están presentes en suero o plasma se


    unen a las células infectadas pero no a las células no infectadas.
    INMUNOFLUORESCENCIA

    El proceso de excitación – emision


    IF Directa: Se usa Ac específicos fluorescentes. Se identifica
    al microorganismo mediante el Ac marcado.
    IF Indirecta : se detecta haciendo reaccionar sobre el inmunocomplejo una
    anti Ig marcada con fluoresceína. Es más sensible.
    Inmunofluorescencia indirecta

    Antígeno tisular
    Inmunofluorescencia indirecta

    suero de paciente(IgG)
    Inmunofluorescencia indirecta

    + anti-IgG humana con


    marca fluorescente
    Inmunofluorescencia indirecta

    Microscopio
    de luz UV
    LECTURA
    Examinar las celulas con un microscopio de fluorescencia (250 – 400x)
    Seleccionar campos de distribución uniformes
    La inmunofluorescencia indirecta se ha utilizado ampliamente como
    prueba confirmatoria para la infección por el VIH-1 y lo siguen haciendo
    laboratorios con amplia experiencia con la prueba. Su desempeño es
    bueno pero requiere de personal debidamente entrenado para su
    lectura y de microscopio de fluorescencia.

    ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE INFECTOLOGÍA


    Infectio 2006; 10(4): 273-278
    LIA: inmunoensayo lineal
     Incorporan en un soporte plano ,equivalente a la tira de
    nitrocelulosa, varias proteínas recombinantes o péptidos sintéticos
    correspondientes a diferentes proteínas del VIH-1 y en algunos
    casos del VIH-2
     Su sensibilidad es similar al WB y presenta menos reacciones
    cruzadas por la presencia de productos celulares propios del proceso
    de fabricación de WB.
     Estas pruebas que son sensibles y especificas pueden considerarse
    como pruebas confirmatorias y en algunos sitios reemplazan al WB.
     La presencia de péptidos sintéticos puede ocasionar resultados falsos
    negativos en la infección VIH aguda y en niños.
    RIPA
     Técnica limitada a laboratorios capaces de lograr la propagación del VIH-1
    en cultivos celulares.
     El virus que crece en células H9 se expone, al alcanzar un crecimiento
    exponencial, a una substancia radiomarcada que tras el procesamiento
    permite detectar por autorradiografía los inmunoprecipitados que se han
    formado.
     Se considera más sensible que el WB frente a las proteínas de alto peso
    molecular aunque puede detectar peor la p24.
    2. MÉTODOS DIRECTOS

    a. Cultivo vírico
    b. Detección de antigenemia (antígeno p24)
    c. Detección molecular de carga viral.
    CULTIVO DE VIRUS
     Requiere infraestructura de alto nivel de bioseguridad.
     Poco sensible cuando se usa suero o plasma.
     Las células mononucleares son más adecuadas especialmente si están
    reducidas o agotadas de CD8+.
    DETECCIÓN DE ANTÍGENO P24
     Aparece en sangre después de la infección por VIH.
     Coincide con aumento de ARN viral.
     S: 89% E: 100%.
     El ensayo detecta nivel que corresponde a un nivel de ARN de 30000-
    50000 copias/ml.
    DETECCIÓN DE CARGA VIRAL PLASMÁTICA
     Se expresa comonúmero de copias/ ml o en log10.
    Junto con recuento de linfocitos CD4, son parámetros que se utilizan
    en la monitorización del tratamiento antiretroviral.
    Muestra: sangre anticoagulada con EDTA en cantidad de 5- 10 ml.
    Para Dx de niños menores de 18 meses.
     Aclarar resultados indeterminados.
    Principal uso: seguimiento de la infección y el de terapia.
    • Respuesta virológica:

    • Reducción de la CVP superior a 1 log10 tras 4 semanas desde inicio de TAR.


    • CVP menor de 50 copias/ml tras 16-24 semanas de iniciado el TAR.

    • Fracaso virológico:
    • CVP detectable tras 24 semanas de inicio de TAR.
    • Si tras alcanzar la CVP indetectable, esta se vuelve superior a 50 copias/ml en
    dos determinaciones consecutivas.

    En pacientes con CVP muy elevadas (más de 300 000 copias/ml) pueden
    requerirse más de 24 semanas para obtener un CVP indetectable.
    INFECCIÓN AGUDA
    • Primera etapa de infección.
    • 50% desarrollan manifestaciones clínicas sugestivas.
    • Niveles elevados del virus.
    • No es detectada por pruebas convencionales.
    • Disminución de carga viral y de antígeno p24 coincide con el
    incremento de niveles de anticuerpos.
    • Se puede diagnosticar:
    • Detección de ARN- VIH.
    DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR
    VIH EN EL NIÑO
     Técnica recomendable: detección de ácido nucleico o aislamiento viral.
     1/3 son detectados a los 10 días de vida.
     50% en primeras 4 semanas, el resto en los siguientes 2 meses.
     En niño > 18 meses, se pueden realizar las mismas pruebas que se
    realizan en el adulto.
    INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
    PRUEBAS DE TAMIZAJE

     FALSOS POSITIVOS:
     Más comunes.
     Multiparidad.
     Enfermedad reumática.
     Enfermedades infecciosas.
     Vacunación reciente para hepatitis B.
    INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
    PRUEBAS DE TAMIZAJE
    INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
    PRUEBAS DE TAMIZAJE

     FALSOS NEGATIVOS:
     Fases iniciales: periodo de ventana.
     Fases finales:
     Baja producción de anticuerpos.
     Infecciones silenciosas.
     Limitantes de la prueba (detectar variantes como grupo O o
    VIH-2)
     Transfusión masiva.
    INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
    PRUEBAS DE TAMIZAJE
    Prueba Indeterminada:

     Elisa (+) WB gp41 (una banda solamente)

     RNA PCR, para aclarar la infección

     Las pruebas pueden ser positivas de 3 a 12 semanas posterior a la


    infección
    Algoritmo de diagnóstico por laboratorio para
    la infección por el VIH

    Infectio 2006; 10(4): 273-278


    GRACIAS

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