Hybridation Moléculaire

Méthodes d'analyse du gène purifié
Hybridation moléculaire
L'hybridation d'acides nucléiques sur des membranes est une technique largement utilisée dans la
manipulation et l'analyse de gènes. L'hybridation moléculaire se base essentiellement sur le principe de
dénaturation/renaturation de l'ADN.
Dénaturation/renaturation
A une température élevée, les deux brins d'ADN sont séparés sans rompre les liaisons phosphodiesters. Par
refroidissement lent d'une solution d'ADN dénaturée des molécules d'ADN hybrides sont formées par
appariement entre des brins d'ADN simple brin de différente origine.
Conditions de la renaturation
 Concentration saline en NaCl suffisamment importante (0.15-0.5M) pour éliminer les répulsions
électrostatiques des groupements phosphate des deux brins
 Température de renaturation est de 20°C à 25°C inférieure à la Tm
Intérêt de la renaturation
La renaturation est un outil précieux de la biologie moléculaire:
 Déterminer le degré de parenté entre différents organismes

 Repérer des fragments d'ADN spécifiques dans un mélange spécifique
 Déterminer des fragments d'ADN paralogues qui codent pour des fonctions apparentées chez
plusieurs espèces
Technique d'hybridation
 Filtration de la solution d'ADN dénaturé à travers d'un filtre fin de nylon ou de nitrocellulose qui fixe
les échantillons d'ADN par leur squelette pentose-phosphate
 Incubation de la dans un sac contenant une faible quantité de sondes radioactives (sondes chaudes)
ou marquées chimiquement (sondes froides) dans des conditions qui permettent la renaturation
Lorsque la sonde reconnaît son homologue dans la population de molécules cibles, il ya hybridation.
L'hybride devient marqué par la présence de la sonde
 Lavage et repérage des hybrides
Dans le cas de marquage radioactif, les hybrides sont repérés par autoradiographie
Dans le cas de marquage chimique, le repérage des hybrides se fait par colorimétrie
 Si les deux brins qui s'hybrident présentent exactement les mêmes séquences, l'hybride sera stable
même dans les conditions de stringence importante (milieu proche de l'eau et température inférieure
à 65°C)
 Si les deux brins ne possèdent pas de similarité dans leurs séquences, l'hybridation n'aura pas lieu.
 En situation intermédiaire (similarité partielle) l'hybride sera stable dans les conditions de stringence
faible
 Zone de complémentarité courte: la sonde se détache immédiatement
Différentes techniques d'hybridation
1/Hybridation ADN/ADN (Southern blotting)

Sonde: ADN Cible: ADN
1. Réaliser une électrophorèse des fragments d'ADN obtenus après attaque par un ou plusieurs ER
2. Transfert sur membrane de nitrocellulose: le transfert (blotting) se fait en recouvrant le gel d'une
feuille de nitrocellulose, puis par une épaisse couche de serviette en papier. L'ensemble du dispositif
est alors comprimé grâce à un objet pesant forçant ainsi le liquide du gel à passer sur la feuille de
nitrocellulose
3. Incubation de cette membrane dans une solution contenant une sonde marquée dans des conditions
permettant l'hybridation
4. La membrane de nitrocellulose est développée par autoradiographie
Cette hybridation est utilisée dans le diagnostic des maladies génétiques dans le cadre d'étude de
polymorphisme de fragments de restriction
2/Hybridation ARN/ADN (Northern blotting)

Sonde: ADN Cible: ARN
Le même principe que le southern
Cette technique permet d'évaluer le taux d'accumulation d'une population d'ARNm dans un tissu donné à un
moment donné de son développement
3/Dot blotting et Slot blotting

Sonde: ADN Cible: ADN ou ARN
A la différence des deux techniques précédentes, les acides nucléiques ne sont pas séparés par
électrophorèse. Ils sont directement déposés à la surface de la membrane d'hybridation à une concentration
connue soit sous forme de point (dot) ou trait (slot). Après hybridation entre la sonde et l'acide nucléique
cible, l'intensité de la tache radioactive obtenue reflète la concentration de l'acide nucléique étudié parmi les
acides nucléiques cibles.

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Méthodes d'analyse du gène purifié

 Déterminer le degré de parenté entre différents organismes

L'hybride devient marqué par la présence de la sonde

 Lavage et repérage des hybrides

1/Hybridation ADN/ADN (Southern blotting)

2/Hybridation ARN/ADN (Northern blotting)

Le même principe que le southern

3/Dot blotting et Slot blotting

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