Tp N°3 : Coloration de Gram

Le but du Tp
Il permet l’étude microscopique des bactéries mortes après fixation et coloration. La
coloration de GRAM permet de différencier des bactéries dites Gram + de bactéries dites
Gram -.
Cette méthode permet d'observer :
-la MORPHOLOGIE des bactéries
-le MODE de GROUPEMENT
-la COULEUR : gram + ou –
Matériel
- une lame
- du Violet de Gentiane (ou Violet Cristal sous forme sèche)
- du lugol
- de l'alcool (éthanol à 95°) très peu dilué
- de la Fuschine fraîchement préparée
- de l'eau déminéralisée ou eau distillée
- du papier filtre
- microscope photonique : objectif x 40 et x100
-L’anse.
-Bec bunsen.
Technique
1. Prélèvement
 A partir d’une culture liquide : prélever un aliquote de suspension à l’anse (ou à la pipette
stérile) après avoir homogénéisée le milieu.
 A partir d’un milieu solide : réaliser une suspension en eau physiologique à partir d’une
culture jeune et prélever un aliquote de suspension à l’anse de platine (ou à la pipette
stérile). Ou prélevé une colonie étalé la dans la lame avec une goutte d’eau distillée
2. Réalisation du frottis
Etaler sur 1 à 2 cm par un mouvement circulaire ou un mouvement horizontal en partant du
centre de la lame
Le frottis réalisé doit être :
- MINCE et HOMOGENE, étendu sur la lame sans toucher les bords
- Réalisé sur une lame PROPRE et DEGRAISSEE, une goutte d'eau déposée en surface doit
s'y étaler complètement.
3. Séchage
- à la température du laboratoire, si possible
- ou bien à chaleur douce : platine chauffante à 37° ou au-dessus de la veilleuse du bec
bunsen, à hauteur suffisante. NE JAMAIS CHAUFFER BRUTALEMENT.
4. Fixation
But : tuer les bactéries, fixer leur structure cytologique, et les faire adhérer à la lame.
 Fixation par la chaleur :
- à utiliser seulement pour les frottis effectués à partir de cultures bactériennes
- passer la lame -frottis situé sur le dessus- dans la flamme chauffante, LENTEMENT et 3 à
4 fois de suite (attention de bien tenir la lame avec une pince) et laisser refroidir.
1. Coloration :

Principe : Cette coloration est une coloration complexe qui permet de différencier les
bactéries d'après leur forme et leur affinité pour les colorants.
La coloration permet de distinguer les bactéries GRAM + des GRAM – grâce à leurs
différences de nature de paroi. Les bactéries à Gram négatif ont une paroi plus fine et riche en
lipides, alors que les bactéries Gram positifs ont une paroi épaisse et pauvre en lipide.

MODE OPERATOIRE
ETAPES TEMPS
PRINCIPE

- Recouvrir la lame de cristal violet ou Le colorant violet pénètre dans les

violet de gentiane cellules bactériennes
COLORATION
1 minute
PRIMAIRE - Rincer à l’eau distillée et récupérer le
cristal violet dans un bêcher (ne pas le
jeter dans le bac à coloration)

Il se forme un complexe chimique

- Recouvrir de Lugol
entre le violet et le Lugol qui fixe le
MORDANÇAGE 1 minute
violet et colore le cytoplasme de toutes
- Rincer à l’eau distillée et l’égoutter
les bactéries en violet.

L'alcool dissout le violet de gentiane,

- Tenir la lame inclinée et faire couler si la paroi bactérienne est perméable à
pendant quelques secondes de l'alcool à l'alcool (les lipides sont dissous par
95° jusqu'à écoulement incolore. 5 secondes l’alcool), celui-ci pénètre dans les
DECOLORATION
environ bactéries et décolore leur cytoplasme :
- Rincer immédiatement à l’eau distillée et les bactéries deviennent incolores.
égoutter
Si les bactéries ont une paroi
imperméable à l'alcool (épaisse et sans
 lipides), elles restent colorées en violet
et elles sont dites GRAM + ou positif.

- Recouvrir la lame de fuschine La fuschine recolore en rose les

COLORATION
1 minute bactéries précédemment décolorées :
SECONDAIRE - Rincer à l’eau distillée les bactéries Gram – ou négatif.

- Egoutter entre 2 morceaux de papier-

SECHAGE
filtre et laisser sécher

5. Observation

On peut noter la morphologie des bactéries et la coloration de celles-ci : les bactéries

violettes sont dites Gram positives, celles qui sont roses sont dites Gram négatives.
On peut également noter l'homogénéité de coloration de la bactérie.
 TABLEAU DES PRINCIPALES BACTÉRIES1

BACTÉRIES AÉROBIES
GRAM POSITIF GRAM NÉGATIF
- Staphylococcus
• Staphylococcus aureus (méti-R et méti-S)
• Staphylocoque à coagulase négative

- Streptococcus
• Streptocoque bêta-hémolytique
▫ Streptococcus pyogenes (groupe A),
▫ S. agalactiae (groupe B), - Neisseria
▫ S. dysgalactiae (groupe C), • N. gonorrhoeae
COCCI • N. meningitidis
• S. pneumoniae
• Autres streptocoques
▫ S. mutans, S. oralis, S. salivarius, S. sanguis,
complexe « milleri » (S. anginosus,
S. constellatus, S. intermedius), S. gallotyticus
(ex S. bovis)
- Enterococcus
• Enterococcus faecalis,
• E. faecium
- Entérobactéries
• Citrobacter
• Enterobacter
• Escherichia coli
• Klebsiella
• Proteus
• Salmonella
o Salmonella typhimurium
• Serratia
• Shigella
o Shigella sonnei
• Yersinia
o Yersinia enterocolitica
- Coccobacilles
−Bacillus • Bartonella
•Bacillus anthracis • Branhamella
−Corynebacterium • Brucella
BACILLES −Erysipelothrix o Brucella abostur
−Listeria • Campylobacter
• Coxiella
−Nocardia • Francisella
−Tropheryma whippelii • Haemophilus
• Helicobacter
• Kingella
• Legionella
• Moraxella
o Moraxella catarrhalis
• Rickettsia
- Autres bacilles à Gram négatif
• Acinetobacter
• Aeromonas
• Bordetella
• Burkholderia
• Pasteurella
• Pseudomonas
• Stenotrophomonas
• Vibrio

BACTÉRIES ANAÉROBIES
GRAM POSITIF GRAM NÉGATIF

- Bacteroides
- Actinomyces
- Eubacterium
- Clostridium : C. botulinum, C.difficile, C. perfringens, C. tetani
- Fusobacterium
- Peptococcus
- Porphyromonas
- Propionibacterium acnes
- Prevotella

AUTRES BACTÉRIES
SPIROCHÈTES MYCOBACTÉRIES AUTRES
- Intracellulaires :
- Borrelia
- M. avium - M. africanum - Chlamydia
- Leptospira
- M. leprae - M. kansasii • Chlamydia psittaci
- Treponema
- M. tuberculosis - Mycobacteries
• Treponema pallidum - Sans paroi (mollicutes) :
- Mycoplasma, Ureaplasma
(1) Extracted from Nomenclature for Aerobic and facultative bacteria. Clinical infectious diseases ; 1999 ; 29 : 713-23.
Lignes directrices pour l’interprétation de la coloration de Gram
(Comité de gérance des antimicrobiens des régies régionales de la santé du Nouveau-Brunswick, octobre 2020)
Morphologie des bactéries Organisme le plus probable
Gram positif
Staphylococcus aureus
Staphylocoque à coagulase négative
– Exemples : S. epidermidis, S. lugdunensis, S. hominis,
Cocci en grappes ou en amas
S. warneri, S. saprophyticus, S. haemolyticus, etc.
Micrococcus
Aerococcus
Streptococcus pneumoniae (communément, diplocoques à Gram) positif
Streptocoques du groupe viridans
– Exemples : S. mitis, S. sanguinis, S. salivarius, S. oralis, S. bovis,
groupe Anginosus (S. anginosus, S. constellatus, S. intermedius)
Streptocoques pyogénes bêta-hémolytiques (groupes A, B, C, F, G)
Cocci groupés par deux ou en chaînettes Enterococcus
– Exemples : E. faecalis, E. fæcium
Plus rare : Gemella (parfois observer en grappe), Abiotrophia,
Granulicatella
Cocci anaérobies
Corynebacterium
Cutibacterium (précédemment Propionibacterium)
Bacilles – petits, non sporulés
Listeria
Bacilles anaérobies gram positif
Bacillus
Bacilles – grands, sporulés ou non
Clostridium
sporulés
Lactobacillus
Nocardia et autres actinomycètes aérobies
Bacilles – branchés/perlés/filamenteux Actinomyces
Mycobacterium tuberculosis atypique
Levures et pseudohyphes Candida
Gram négatif
Entérobactériacées
– Exemples : Escherichia coli, Serratia, Klebsiella, Enterobacter,
Citrobacter, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, etc.
Bacille non fermentant
Bacilles
– Exemples : Pseudomonas, Stenotrophomonas, etc.
Legionella
Bacilles gram negatif anaérobie
– Exemples : Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas
Haemophilus
Acinetobacter (peut être confondu avec un cocci Gram positif)
Pasteurella
Aggregibacter (précédemment Actinobacillus, Haemophilus aphrophilus
Coccobacilles/bacilles pléomorphes Eikenella corrodens
Kingella
Francisella tularensis
Brucella
Autres coccobacilles anaérobies gram négatif
Fusobacterium
Bacilles fusiformes
Capnocytophyga
Campylobacter
Bacilles courbés ou spirallés
Vibrio
Neisseria
Diplocoques – Exemples : N. meningitidis, N. gonorrhoeae
Moraxella catarrhalis
Cocci Veillonella