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    TP-5 Microbiologie

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    Ce document décrit les étapes d'une coloration de Gram pour observer des bactéries au microscope. Il présente également une coloration simple au bleu de méthylène. Trois cultures bactériennes sont fournies pour réaliser les colorations.

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    TP-5 microbiologie

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    sur 2

    TP V : Observation microscopique des bactéries après coloration L2

    Université de Saida Dr MOULAY Tahar

    Département de biologie Année universitaire 2022-2023

    L2 Module : Microbiologie

    TP V : OBSERVATION MICROSCOPIQUE DES BACTÉRIES APRÈS COLORATION


    Objectif
    La coloration des bactéries est un moyen d’augmenter leur contraste de
    manière à mieux les observer en microscope à fond clair. Dans les conditions
    normales, les procaryotes ont en général un pH intracellulaire neutre et une surface
    cellulaire globalement chargée négativement. Ceci explique l’efficacité des colorants
    basiques pour l’observation de la morphologie bactérienne.
    La coloration peut s’appliquer :
    -soit sur des cellules vivantes en utilisant des colorants dilués ;
    -soit sur des cellules tuées par FIXATION en utilisant des colorants concentrés.
    Toutes les techniques de coloration sur des
    bactéries tuées requièrent trois étapes principales :
    - La préparation du frottis
    - La fixation
    - La coloration proprement dite :
    -Coloration simple (un seul colorant). Coloration
    différentielle type Gram (deux colorants). Colorations
    spéciales des structures bactériennes (capsules, spores,
    flagelles….).
    Matériel et cultures microbiennes :
    En plus des colorants, de l’eau et de l’alcool Vous
    disposez de trois cultures : de Lactococcus, E. coli et de
    Saccharomyces. Les manipulations suivantes vont être
    réalisées pour les trois microorganismes.
    1. Réalisation des frottis
    a. Étalement
    L'étalement doit se faire en couche mince, sur une
    lame dégraissée soit par un mouvement régulier et
    circulaire à l'aide d'une anse de platine (figure n° 3), soit
    en tirant de façon uniforme l'effilure d'une pipette
    Pasteur (figure n° 4).
    b. Séchage
    Le séchage de la lame doit se faire autant que
    possible à la température du laboratoire, ou en la
    maintenant dans l'air chaud au-dessus de la veilleuse d'un
    bec Bunsen (figure n° 5).

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    TP V : Observation microscopique des bactéries après coloration L2

    Il faut éviter un séchage trop brutal, à une température trop élevée (altération
    de certains constituants, en particulier la paroi bactérienne).
    c. Fixation
    Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame
    opposée à l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement
    (figure n° 6).
    On peut également fixer en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool
    méthylique versées directement sur le prélèvement.
    À ce stade les germes ne sont plus considérés comme contaminants.
    1.1. Coloration de GRAM.

    a. Déposer quelques gouttes de Violet de gentiane.


    b. Laisser agir une minute.
    c. Égoutter puis rincer la lame avec de l'eau par un jet de pissette.
    d. Déposer quelques gouttes de Lugol.
    e. Laisser agir une minute.
    f. Égoutter puis rincer la lame avec de l'eau.
    g. Faire couler sur la lame incliné (pas sur l'étalement) l'Alcool. Jusqu'à disparition du Violet
    (5 à 10 secondes).
    h. Rincer avec de l'eau.
    i. Laisser agir quelques gouttes de Fuchsine 25 secondes.
    j. Rincer avec de l'eau.
    k. Sécher la lame entre deux feuilles de papier joseph, papier filtre ou en la maintenant dans
    l'air chaud au-dessus de la veilleuse d'un bec Bunsen.

    L'examen au microscope sera effectué avec un objectif 100 en présence d'huile


    d'immersion.
    1.2. Coloration simple
    Sur le frottis fixé et refroidi, faire couler la solution de bleu de méthylène
    jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte et laisser agir 1 minute.
    Rincer abondamment la lame avec un jet d'eau distillée, ou avec de l'eau du
    robinet jusqu'à élimination de l'excès de colorants puis sécher à l'air ou sécher
    doucement entre deux feuilles de papier joseph, sans frotter. L'examen au
    microscope sera effectué avec un objectif 100 en présence d'huile d'immersion.

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