ANALYSE DE QUELQUES TANNINS VÉGÉTAUX

UTILISÉS POUR LA FABRICATION DES CUIRS

par

Pascale RICHARDIN, Christine CAPDEROU, Françoise FLIEDER,

Sylvette BONNASSIES, Dominique RAISON.

Le tannage est une étape primordiale dans la fabrication du cuir puisqu'il

permet la transformation des peaux animales brutes en cuir. Au cours de leur
immersion dans un bain tannant, elles acquièrent une résistance à l'hydrolyse et à
la putréfaction par combinaison chimique irréversible entre le collagène et la
substance tannante. Celle-ci peut être d'origine diverse : organique (graisses,
fumées, végétaux, formol, matériaux synthétiques) ou minérale (alun et chrome)
(8). Les qualités du cuir dépendent en partie de la nature de la matière tannante ;
ainsi le tannage végétal, utilisé depuis des temps très reculés, permet d'obtenir un
matériau facile à travailler, particulièrement bien adapté à la reliure. En France,
l'écorce de chêne broyée appelée "tan" a été la plus employée ; à cet effet, on en
faisait une décoction aqueuse dans laquelle les peaux étaient mises à tremper. Le
tannin diffusant tout d'abord dans l'eau, était ensuite absorbé par la peau qui se
transformait alors en cuir. Il fallait douze à dix-huit mois pour obtenir un bon
tannage.

Actuellement, on a modifié le procédé en utilisant non plus des décoctions

mais des extraits tannants. Ils peuvent être liquides (solution concentrée contenant
50 % de matières sèches) ou solides (poudre, 90 à 96 % de matières sèches)
(28,40) ; quel que soit leur conditionnement on les emploie en solution. Le temps
du tannage se trouve alors considérablement raccourci, puisqu'il ne dépasse pas un
mois. Les produits les plus fréquemment utilisés à l'échelle mondiale sont ceux
qui proviennent des bois de québracho, de châtaignier et d'écorce de mimosa.

Si les tannins hydrolysables ont fait l'objet de nombreux travaux, les

tannins condensés ont été peu étudiés. Nous avons donc cherché à approfondir
notre connaissance dans ce domaine, en nous efforçant de les différencier et
d'établir la structure de certains d'entre eux. Néanmoins, nous avons étendu nos
recherches à l'étude d'un tannin mixte, provenant du bois de châtaignier, utilisé
fréquemment pour la fabrication des cuirs contemporains, et à celle d'un tannin
hydrolysable, extrait de feuilles de sumac, souvent employé conjointement à un
tannin condensé dans les procédés modernes de tannage.
152

Définition

Les tannins végétaux contiennent tous des composés glucidiques et phénoliques ;

bien que leurs structures soient assez éloignées les unes des autres, ils ont des
propriétés communes (13, 33, 42) : solubilité dans l'eau, coloration par les sels de
fer, oxydation par la permanganate de potassium à froid. Ils présentent, par
ailleurs, la capacité de s'associer aux protéines ainsi qu'à certains polyols.

Ce comportement est à la base des propriétés tannantes qu'ils exercent sur la peau
des animaux au cours de sa transformation en cuir. La formation d'une
combinaison entre le tannin et le collagène est due à trois types de liaisons :
• des liaisons hydrogènes entre les groupements hydroxyles de phénols présents
dans les tannins et différents groupes récepteurs (NH, CO, OH) des protéines
ou d'autres polymères (collagène par exemple) ;
• des liaisons ioniques entre des groupements anioniques, constitués par certains
cycles benzéniques des tannins et des groupes cationiques des protéines ;
• des liaisons de covalence, provenant de la réaction de fonctions quinones qui
peuvent exister dans la structure des tannins ou apparaître lors de leur
oxydation sur certains groupes actifs des protéines ou autres polymères.

Ces liaisons confèrent sa stabilité à la combinaison tannin-protéine. Celle-

ci n'est obtenue qu'avec des molécules ayant un nombre de groupements
hydroxyles suffisant pour réaliser l'enchaînement en plusieurs points, mais n'étant
pas trop volumineuses, afin de pouvoir s'approcher suffisamment des sites actifs
de la protéine. Les composés qui répondent à ces critères possèdent une masse
moléculaire comprise entre 500 et 3000. Les produits phénoliques seuls ne
peuvent donc pas être considérés comme de vrais tannins, par contre leurs
polymères en méritent le nom.

Les tannins sont très répandus dans le règne végétal, ils sont localisés dans
les écorces, les bois, les racines, les feuilles, les fruits, les galles. A titre indicatif,
on trouvera dans le tableau 1 le pourcentage de tannins présents dans les
principales matières végétales tannantes connues (28).

Classification

La classification des tannins végétaux admise actuellement a été établie par

Freudenberg (16). Il différencie deux grandes classes de tannins : les
hydrolysables et les condensés, selon leur comportement vis-à-vis des agents
hydrolytiques. La répartition de ces deux types de tannins est indiquée dans le
tableau 2 (28).
 153

Tableau 1
Composition moyenne de quelques matières tannantes végétales

% Tannins % Non- % Insolubles % Eau

Tannins
Ecorce de chêne 10 5,5 71,5 13
Ecorce de sapin 12,5 7,5 65,5 14,5
Ecorce de mimosa 35 11 42 12
Ecorce de palétuvier 36 9 40,5 14,5
Ecorce de malette 42 7 36,5 14,5
Bois de châtaignier 8,2 1,7 75,6 14,5
Bois d'urunday 14,4 1,5 65,1 19
Bois de tizerah 22,4 2,2 60,9 14,5
Racine de canaigre 26 14 45 15
Racine de badan 20 21 48,5 10,5
Feuilles de sumac 24 16 48 12
Feuilles de mangue 20 16 49,5 14,5
Fruits valonées (trillos) 46 12 30 12
Myrobolan 34 14 39 13
Algarobilles 44 20 21 15
Divi-divi 41,5 18 26 14,5
Tara 55 13 21 11
Gonakié 32 19 40 9
Galles-takaout 56,3 10,4 20,6 12,7

Tableau 2
Répartition des végétaux en fonction du type de tannin qu'ils contiennent

Végétaux contenant des tannins Végétaux contenant des tannins

condensés hydrolysables
Ecorces de chêne Bois de châtaignier
de sapin Feuilles de sumac
d'hemlock de lentisque
de pin de tamarix
de mimosa Fruits valonées
de palétuviers myrobolam
de malette algarobilles
Bois de québracho divi-divi
d'urunday gonakié
de tizerah Galles knoppern (gallon)
Racines de canaigre Galles de Chine

Les tannins hydrolysables ont une structure de polyester. Sous l'action d'un
acide dilué ou d'une enzyme (la tannase de l'Aspergillus niger) ils s'hydrolysent en
libérant une fraction glucidique ou polyalcoolique et des acides
carboxyphénoliques (10, 19, 20, 33, 48). Selon la nature de ces derniers, certains
auteurs distinguent les gallotannins qui produisent surtout de l'acide gallique et
154
les ellagitannins qui donnent, en plus, de l'acide ellagique ainsi que d'autres
acides phénoliques. A l'opposé des tannins hydrolysables, les tannins condensés
ne sont pas décomposables par hydrolyse. Au contraire, soumis à un chauffage en
milieu acide ils se polymérisent progressivement et forment des pigments
anthocyaniques, amorphes, de coloration rouge, ou des produits bruns jaunes,
insolubles, de poids moléculaire élevé, appelés phlobaphènes. A la pyrolyse, les
tannins condensés fournissent du pyrocatéchol.

Dans le présent travail, nous développerons principalement la partie

concernant les tannins condensés, les tannins hydrolysables ayant fait l'objet d'une
étude dans notre laboratoire à propos des encres ferro-galliques (18).

Les tannins condensés

La structure de ces tannins est peu connue. Freudenberg a démontré qu'ils

seraient des polymères des flavanol-3 (anthocyanidines) et des flavanediol-3, 4
(leucoanthocyanidines). Ces composés ont les formules suivantes :

-flavonol -3
R R R

OH OH OH

OH O OH O OH O
OH OH OH

OH OH OH

OH OH OH
R = H (2R-3R) Epicatéchine R = H (2S-3S) (+)Catéchine R = H cyanidine
R = OH (2R-3R) Epigallocatéchine R = OH (2S-3S) (+)Gallocatéchine R = OH delphinidine

-flavanediol -3,4
R' R'
OH OH

OH O OH O
R'' R''

OH OH
R OH OH OH
R = R' = R" = H Leucoguibourtinidine R' = H , R" = OH Leucocyanidine
R = R' = H , R" = OH Leucofisétidine R' = R" = OH Leuco delphinidine
R = OH , R' = R" = H Leucopélargonidine
R = H , R' = R" = OH Leucorobinétinidine
 155
Les tannins condensés extraits d'un tissu végétal sont donc constitués par
un mélange de plusieurs polymères. Leur polymérisation joue un rôle important
sur leurs propriétés, mais son processus n'a pas encore été bien élucidé. Plusieurs
hypothèses ont été émises à ce sujet.

Hypothèses émises sur le processus de polymerization des tannins condensés

Freudenberg et Weinges (17) ont envisagé une condensation catalysée par

la présence d'un acide. Dans le cas des flavanol-3, telle la catéchine, ils expliquent
ce processus par l'ouverture de l'hétérocycle du monomère, avec fixation d'une
molécule d'eau, puis formation d'un ion carbonium. Celui-ci réagirait avec un
centre nucléophile, comme les sommets 6 ou 8 du cycle benzénique d'une autre
molécule de flavanol-3. On aboutirait ainsi à la formation d'un dimère. Le
mécanisme se reproduirait pour conduire à un polymère de poids moléculaire
élevé.
OH

H+ OH

HO O

OH
Catéchine
OH

OH OH

OH OH

HO
HO O HO O

HO
OH OH OH
OH
OH OH
OH
OH
HO OH +
HO HO

OH

OH Dimère

De nombreuses alternatives à ce mécanisme ont été proposées, mais les

transformations des flavanediol 3, 4 et des flavanol-3 par les acides s'expliquent
par la possibilité que les molécules ont d'agir comme nucléophyles ou
électrophyles. Les différents modèles de réactions utilisés mettent en cause le
caractère électrophyle des dérivés des flavones (C2 ou C4) qui réagissent avec un
nucléophyle extérieur.

Hathway et Seakins (22, 23) proposent un autre modèle de polymérisation

qui repose sur l'autoxydation enzymatique de la (+) catéchine.
156
OH O
OH O

8 B
HO O HO O
A
6
OH OH

OH OH
O

O
B
HO O O

O
OH B
HO O
OH

OH
Polymère "tête à queue"
OH
O

O
B
HO O OH

OH
OH
Polymère "queue à queue"
OH O OH
B
O

Il y a formation initiale d'une ortho-quinone, puis le noyau B possédant un

caractère électrophyle va donc pouvoir s'unir à un centre nucléophyle (par
exemple site 6 ou 8 du noyau A). Les résultats obtenus à partir de modèles
expérimentaux amènent Hathway (25) à conclure que la (+) catéchine se
polymérise de façon à donner un polymère " tête à queue" alors que la
polymérisation de la (+) gallocatéchine conduirait à un polymère " queue à
queue". Hathway a particulièrement étudié les tannins de l'écorce de chêne et a
émis une hypothèse sur leur formation . Des précurseurs tels que la gallocatéchine
qui se trouvent dans les feuilles sont transportés par la sève jusqu'au cambium* où
ils sont oxydés par une enzyme (polyphénoloxidane); les tannins résultants sont
stockés dans l'écorce. En étudiant des modèles expérimentaux tels que l'oxydation
de la (+) gallocatéchine, il a remarqué que les polymères obtenus avaient les
mêmes caractéristiques (même spectre d'absorption, même analyse élémentaire)
que les phlobatannins de l'écorce de chêne. Il en a donc conclu que les tannins de
l'écorce de chêne étaient formés principalement par oxydation aérobie, dans le
cambium, de la (+) gallocatéchine et qu'il en résultait un polymère "queue à
queue".
Roux et Ferreira (44) concluent après des études faites en résonnance
magnétique nucléaire du proton 1H et du carbone 13C que la formation de dimère
représente la première étape de polymérisation des tannins condensés. Pour les
dimères et les oligomères, la position 8 de la (+) catéchine ou de la (-)

*
cambium : assise générale annulaire des tiges et des racines qui donne naissance au bois.
 157
épicatéchine représente le site nucléophyle qui réagit avec l'ion benzylcarbonium
formé à partir d'une molécule de flavanediol-3,4. Cette substitution électrophyle
peut ensuite se répéter au niveau de la position 6 de la sous-unité flavane de
l'oligomère, la plus accessible. Par exemple, on a isolé dans le Québracho le
dimère correspondant à la (+) catéchine et la (-) leucofisétinidine.

OH

OH

HO O Leucofisétinidine (donne un ion benzylcarbonium)

OH
OH
OH
OH
HO O
Catéchine (position 8 : centre nucléophile fort)

OH

OH

Haslam et al. (21) ont envisagé un processus de déshydrogénation des

précurseurs ( (+) catéchine, (-) épicatéchine) sans qu'il soit besoin de faire appel à
une polycondensation oxydative.

OH OH OH

OH OH OH

HO OH HO O HO O

[O]
OH OH OH

OH O OH OH

H OH
OH OH
OH
OH OH
HO O
HO O HO O

3
4 OH
OH OH H
H H OH
OH OH
Carbocation
Carbocation Réduction

OH OH
OH OH

HO O HO O

OH OH
H H
OH OH
158
La condensation des carbocations avec les flavanol-3 se fait sur les sites
nucléophyles C6 ou C8 par l'intermédiaire du C4 électrophyle de l'hétérocycle
oxygéné pour former les dimères correspondants. Les oligomères peuvent être
formés à partir des dimères par condensation répétitive avec les carbocations.

Comportement des tannins condenses dans différents milieux

Plusieurs réactions peuvent survenir en fonction du milieu dans lequel se

trouvent les tannins : milieu acide, présence d'humidité ou de soufre (33,44).

Hydrolyse et condensation en milieu fortement acide

Chauffés en présence d'un acide minéral puissant, les tannins subissent
deux réactions compétitives :
• la dégradation conduisant à la formation de catéchine et d'anthocyanidines ;
OH OH
OH OH

HO O HO O

OH OH
OH OH
OH OH
OH OH
H+ + H
O O H O O
H

OH OH
OH OH

OH OH
OH OH

HO O HO O

+ OH OH
OH OH

• l'ouverture partielle de l'hétérocycle oxygéné des unités flavanol-3 avec

formation de p-hydroxybenzylcarbocations. Ces derniers peuvent se condenser
au hasard avec différents sites nucléophyles appartenant à d'autres unités
flavanes pour former des phlobaphènes ou tannins rouges.
OH
OH OH
OH H
HO OH
H +
HO OH
+
OH
OH ...Polymères
OH OH
OH
OH
C2 Carbocation HO OH

OH

OH
 159
Si, en milieu alcoolique (80 à 100 % d'éthanol), la formation
d'anthocyanidines est facilitée, en milieu aqueux, ce sont la polycondensation et
la production de phlobaphènes qui prédominent.

Oxydation
Comme tous les phénols, les tannins noircissent par oxydation lorsqu'ils
sont en solution ou en présence d'humidité. L'oxydation débute à pH 2,5 et
augmente rapidement lorsque le pH croît. Elle est inhibée par la présence de
composés à haut potentiel d'oxydation tel que le catéchol ou le pyrogallol et
supprimée par les acides organiques.
Sous l'action de la lumière, les tannins rougissent rapidement après un
certain temps d'induction. On observe une oxydation initiale de l'anneau A avec
formation d'une quinone. Le mécanisme se répète pour donner des chromophores.
OH
OH

HO O
OH O O
OH

OH OH
OH OH
R H
HO O [O] h ν R
OH HO O
OH

OH OH
OH OH
R H
R H
HO O
OH HO O
OH

OH
OH
OH
OH OH

O O
OH

OH OH
R
HO O
OH

OH OH
R H
O O
OH

OH

OH

Sulfitation des tannins avec du bisulfite ou du sulfite de sodium

L'introduction d'un groupe sulfonique modifie les propriétés physiques et
chimiques du tannin (augmentation de la solubilité et diminution de la viscosité).
Par exemple, le québracho traité avec du sulfite devient soluble dans l'eau alors
que seul, il n'est soluble que dans l'eau chaude.
160
OH

HO O HO OH OH
OH OH
HSO3-
OH OH

OH SO3Na SO3Na
OH

HO O HO OH OH
OH OH
HSO3-
OH OH
SO3Na

Identification des différents tannins

Extraction.

De nombreux auteurs se sont penchés sur le problème de l'extraction des

tannins à partir des végétaux (1,15,24,27). D'une façon générale, cette opération
se fait en Soxhlet avec plusieurs solvants : eau, acétone, éthanol, méthanol, acétate
d'éthyle. Les conditions expérimentales (température, durée, système de solvants)
dépendent en partie de la nature du végétal traité. Elles sont choisies de manière à
effectuer l'extraction la plus complète dans le minimum de temps, afin d'éviter
toute oxydation.

Analyse.

Colorimétrie et précipitation.
Des méthodes simples permettent de déceler la présence de tannins dans
les extraits étudiés (13).
Elles sont basées sur des réactions colorées ou sur l'apparition de précipités :
• le chlorure ferrique ou l'alun de fer et d'ammonium donnent avec les tannins
des colorations caractéristiques : bleu-noir avec les tannins galliques, vert-noir
avec les catéchiques, noirâtre avec un mélange ;
• avec la gélatine salée, on obtient un précipité blanc quelque soit le tannin ;
• le réactif de Stiasny (mélange de formaldéhyde et d'acide chlorhydrique)
forme un précipité beige, fonçant à la chaleur, avec les composés catéchiques
seuls.

L'étape suivante consiste à doser la quantité de tannins présents dans

l'extrait. Un dosage global et approximatif peut s'effectuer également par des
techniques simples :
• méthode au permanganate de potassium (KMnO4), décrite par Doat (13) sous
le nom de méthode de Lowenthal, elle est basée sur l'oxydation des
polyphénols par le permanganate de potassium en solution acide diluée. Le
 161
sulfite d'indigo est utilisé comme régulateur et indicateur d'oxydation. On fait
un dosage de l'extrait brut et de l'extrait détanné par la gélatine. La différence
des résultats donne la quantité de KMnO4 correspondant aux tannins. Cette
valeur est comparée à la quantité de KMnO4 nécessaire pour oxyder une
quantité connue d'acide gallique. Cette méthode de dosage est simple et
reproductible, toutefois les résultats peuvent être discutés car le taux de tannin
est exprimé par rapport à l'acide gallique (ceci peut être erroné dans le cas d'un
mélange de tannins).
• méthode à la poudre de peau (13). De la poudre de peau chromée fraîchement
préparée, ajoutée à une solution aqueuse contenant l'extrait, retient les tannins.
Connaissant la quantité totale initiale d'extrait sec, on détermine par différence
la teneur en tannins retenus par la poudre de peau (cette méthode est
empirique).
• méthodes colorimétriques (13). La première repose sur la formation d'une
coloration rouge-violette stable avec les sels ferreux en présence de tartrate de
sodium et de potassium en milieu tamponné. L'intensité de la coloration est
mesurée à une longueur d'onde de 545 nm. On apprécie la quantité de
polyphénols par rapport à une courbe de référence établie avec l'acide gallique.
La seconde est connue sous l'appellation de méthode au réactif de Folin et
Giocalteu (32). Ce réactif est un mélange de phosphomolybdate de tungstate de
sodium qui est réduit lors de l'oxydation des phénols en un mélange d'oxydes
de tungstène et de molybdène de couleur bleue dont on mesure l'intensité au
maximum d'absorption à 760 nm. L'apparition du complexe coloré n'est pas
spécifique de la présence des phénols, des composés non phénoliques peuvent
aussi réagir ; il est donc nécessaire d'effectuer une purification préalable à ce
dosage.

D'autres techniques permettent de déterminer la quantité de tannins

condensés présents dans un extrait. Broadhurst et Jones (7) proposent une
réaction utilisant la vanilline acidifiée. Les tannins condensés donnent avec le
réactif un composé coloré dont l'absorption maximum est à 500 nm. Ceci est
contesté par Ribereau-Gayon (41) qui considère que la vanilline réagit avec les
positions 6 ou 8 des flavanes activées par la présence des groupements OH. Les
liaisons présentes dans la structure des tannins condensés font intervenir de façon
prépondérante les sommets 6 ou 8, donc à chaque fois qu'une molécule est
engagée par sa position 6 ou 8, elle ne réagit plus avec la vanilline. Ainsi, la
réaction sera d'autant plus faible que le tannin est plus condensé.

Analyses chromatographiques.
Bien que les techniques précédemment décrites permettent de définir la classe du
tannin ainsi que son pourcentage dans un extrait, elles ne fournissent aucune
indication sur la dimension et la structure des molécules. Pour fractionner et
identifier les différents constituants des tannins condensés, on a fait appel à la
chromatographie.
162

• Chromatographie sur couche mince et sur colonne.

Pendant longtemps, la chromatographie sur papier a été le seul moyen
permettant de séparer les différents composés des tannins condensés. La méthode
la plus utilisée est la chromatographie bidimensionnelle sur papier Wathman avec
deux systèmes de solvants (acide acétique pour le premier, butanol-acide acétique-
eau pour le second). Les composés phénoliques ayant des solubilités différentes
selon leur structure, sont séparés par cette technique. De plus, la plupart d'entre
eux absorbent ou sont fluorescents dans l'ultra-violet. A l'aide de révélateurs
comme le chlorure ferrique par exemple, il est possible d'identifier certains
flavanoïdes. Ribereau-Gayon (42) a utilisé cette technique d'analyse pour mettre
en évidence différents anthocyanines, permettant ainsi de différencier la nature
des tannins de certains vins. Haslam (20) a séparé les composés tannants dans un
extrait de québracho. Roux et Paulus (43) ont identifié par chromatographie
bidimensionnelle sur papier quelques composés flavanoïdes d'un extrait d'écorce
de Robinia pseudacacia.
Pastuka et Krüger (37) ont effectué une chromatographie sur couche mince
des tannins végétaux en utilisant des couches préfabriquées de polyamide. Ils
emploient comme solvant un mélange benzol-éthanol ou benzol-éthanol-pyridine
et comme révélateur du chlorure ferrique. Les chromatogrammes sont révélés sous
lampe UV à 366 nm. Andersen et Francis (2) ont utilisé des plaques de cellulose
avec un système de solvants (acide chlorhydrique, acide formique, eau) pour
séparer les anthocyanines et anthocyanidines de pigments végétaux, alors que
Pifferi et Vaccari (38) étudient leur adsorption sur l'alumine. Vanhaelen et
Vanhaelen Fastré (52) quant à eux, ont comparé l'efficacité des plaques de silice et
de polyamide. Les meilleurs résultats pour différencier des composés phénoliques
sont obtenus en employant les plaques de polyamide éluées avec un mélange
éthanol-eau.
Hathway (24) sépare par chromatographie sur colonne avec du gel de silice
les substances phénoliques solubles dans l'éther et dans l'acétate d'éthyle,
contenues dans un extrait d'écorce de chêne. Il a ainsi mis en évidence la (+)
catéchine, la (+) gallocatéchine et la leucodelphinidine. De la même façon, Porter
et Wilson (39) ont fractionné sur Sephadex G25 avec un mélange eau-acétone
(50-50) les composés suivants : catéchine, dihydroquercetone, un dimère et un
trimère du mimosa. Après extraction à l'acétate d'éthyle, Nonaka, Nishimura et
Nishioka (35,36) séparent les différents composés des tannins de l'écorce de chêne
par chromatographie sur Sephadex LH-20 et Diaion HP-20 en utilisant plusieurs
systèmes de solvants (éthanol-eau-acétone-méthanol). Chaque fraction obtenue est
analysée par résonnance magnétique du proton 1H et du carbone 13C.
• Chromatographie liquide haute performance (CLHP)
Actuellement, cette technique est très utilisée pour séparer les différents
composés des tannins condensés (26). Elle ne nécessite pas de dérivation et
semble être plus rapide. Daigle et Conkerton (12) donnent les conditions d'analyse
des différents composés phénoliques.
 163
Les meilleurs résultats pour séparer les flavones sont obtenus en
chromatographie liquide phase inverse. Dans ce cas, la phase stationnaire est
moins polaire que la phase mobile et les molécules fortement polaires du soluté
sont éluées en premier. Ceci est très important pour la séparation d'un mélange
complexe de flavones. L'ordre d'élution est le suivant : tout d'abord les sucres puis
les autres composés de polarité décroissante. Les colonnes commerciales les plus
employées sont la Lichrosorb RP-18, la RP-8 ou encore la Bondapack C 18 ; le
solvant est un mélange méthanol-eau contenant une faible quantité d'acide
acétique qui empêche l'ionisation des molécules. La détection des composés en
sortie de colonne est assurée par un détecteur ultra-violet. La longueur d'onde
utilisée doit être compatible avec le solvant et avec le composé analysé. Pour les
flavanols, flavones et isoflavones, l'éventail des longueurs d'onde s'échelonne
entre 254 nm-280 nm. Les anthocyanines et les proanthocyanines sont détectées
entre 520 nm et 546 nm ou à 280 nm.
En utilisant cette technique, Wulf et Nagel (55) ont séparé différents acides
phénoliques et composés des flavanes. La colonne employée est une Bondapack
(C18), les produits sont élués avec un mélange de solvants (eau-acide acétique-
méthanol). Ils ont étudié l'influence de la structure et l'effet du solvant sur le
temps de rétention. De la même manière, des mélanges complexes ont été
fractionnés sur colonne Bondapack C18 ou Lichrosorb RP 18 (43,45,54,55).
Vande Casteele, Geiger et Van Sumere (50) ont employé une colonne
Lichrosorb RP18 avec un gradient d'élution (solution aqueuse d'acide formique et
méthanol) pour déterminer les temps de rétention de 141 flavones. Ils établissent
des corrélations entre la structure et le temps de rétention. Les mêmes chercheurs
sont arrivés à séparer un mélange de 41 composés phénoliques (anthocyanines et
anthocyanidines) (51). A ce propos, il faut signaler l'article de Banwart et Porter
(4) dans lequel sont indiquées les conditions de séparation en CLHP et les
longueurs d'onde d'absorption de 50 composés phénoliques. De nombreux auteurs
ont étudié le fractionnement des composés phénoliques des végétaux par cette
technique (3, 9). Dziedzic et Dick (14) ont analysé les isoflavanes dans la fleur de
Bengalgram en utilisant une colonne Spherisorb 5 ODS et un mélange méthanol-
eau comme phase mobile. Pour Lea (30), les conditions optimales de séparation
des procyanidines de cidres et de vins sont obtenues en employant une colonne
phase inverse Spherisorb Hexyl et comme éluant, un mélange acidifié eau-
méthanol.

• Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Pour étudier les composés des tannins condensés en CPG, il est nécessaire
de les rendre plus volatils en les silylant. Les dérivés les plus fréquemment formés
étant les esters triméthylsilylés, les réactifs les plus utilisés sont les suivants :
T.M.C.S. (triméthylchlorosilane), H.M.D.S. (hexaméthyldisiloxane), B.S.T.F.A.
(N,O'-bis(triméthylsilyl)trifluoroacetamide).
164
Vande Casteele et al. (49) ont ainsi séparé après silylation par du
B.S.T.F.A., 36 composés phénoliques naturels. Colliers et Mallows (11) ont
effectué l'analyse en CPG après silylation au T.M.C.S. de certains flavanols du
thé : catéchine, épicatéchine, épigallocatéchine, gallate d'épicatéchine, gallate
d'épigallocatéchine. Bombardelli et al. (5,6) ont étudié certaines anthocyanines et
anthocyanidines par CPG couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM).
Lorsqu'on traite ces composés avec un mélange H.M.D.S. et T.M.C.S. on obtient
des dérivés de la quinoléine. Ces derniers fournissent en CPG des pics
chromatographiques bien séparés et se fragmentent de façon telle qu'il est facile
de retrouver leur structure initiale. Il faut également remarquer le travail de
Müller et Simon (34) sur l'identification de 10 anthocyanines par pyrolyse suivie
d'une chromatographie en phase gazeuse couplée avec la spectrométrie de masse.
Les échantillons dissous dans le méthanol, subissent une pyrolyse à 600° C sous
atmosphère d'hydrogène ; les fragments obtenus sont élués par de l'hélium. La
formule générale de ces composés est la suivante :

+
R'O O R1

OR'''
OR''

En pyrolyse CPG/SM, le substituant (R1) sur le carbone-2 donne le

fragment majoritaire et permet de caractériser l'anthocyanine. Une étude similaire
a été faite par Lanzarini (29) et ses collaborateurs pour identifier diverses
anthocyanines.

Expérimentation

Nous avons dans un premier temps mis au point des méthodes d'analyses
afin de différencier un certain nombre d'extraits végétaux, les plus fréquement
cités dans les recettes anciennes de tannage des peaux. Il s'agit surtout de tannins
provenant principalement de bois ou d'écorce d'arbres : chêne, châtaignier,
québracho ou mimosa. Nous avons également étudié l'extrait de sumac, tannin
hydrolysable provenant des feuilles du Rhus coriaria, qui est comme nous l'avons
mentionné précédement, très utilisé encore de nos jours, seul ou en combinaison
avec d'autres tannins, comme le châtaignier par exemple.
Nous avons ensuite vérifié la fiabilité de nos méthodes d'identification en
les expérimentant sur plusieurs cuirs, fabriqués spécialement pour cette étude au
Centre Technique du Cuir de Lyon (C.T.C.) et dont nous connaissons avec
précision la nature du tannage. A cet effet, un procédé d'extraction des tannins
libres des cuirs a été élaboré.
 165

Analyse des extraits végétaux.

Les analyses effectuées pour cette étude sont essentiellement réalisées par
chromatographie en phase gazeuse (CPG) et par couplage avec la spectrométrie de
masse (CPG/SM). D'autres méthodes spectroscopiques complémentaires seront
expérimentées et feront l'objet de travaux ultérieurs.
Etude des tannins bruts par CPG.
Pour diminuer la polarité et augmenter la tension de vapeur de tous les
constituants présents, il nous a fallu trouver une méthode de dérivation. Comme
nous l'avons mentionné plus haut, la silylation est une méthode de choix pour
l'étude des produits phénoliques. Nous avons testé deux types de réactifs :
1 - l'hexaméthyldisiloxane (H.M.D.S.) avec du triméthylchlorosilane (T.M.C.S.)
en solution dans la pyridine à température ambiante ;
2 - N,O'-bis (triméthylsilyl) trifluoroacétamide (B.S.T.F.A.) avec de la
triéthylamine (T.E.A.) en solution dans l'acétonitrile à 100°C.
Les chromatogrammes obtenus avec ces deux mélanges réactionnels sont
identiques, avec cependant quelques variations d'intensité d'un ou deux pics, sans
doute dues à la différence de rendement des réactions. D'autres dérivations ont été
testées, comme une alkylation ou une estérification suivie d'une silylation, mais
les résultats sont à l'heure actuelle peu concluants.

Les études chromatographiques ont été réalisées sur une colonne capillaire
apolaire. Nous avons cependant observé au cours de cette étude un vieillissement
précoce de la colonne en raison de la toxicité des dérivés TMS vis-à-vis de la
phase méthylsilicone (CPSIL5). Malgré l'optimisation des conditions
chromatographiques, une heure d'analyse est nécessaire afin de séparer la totalité
des constituants avec une résolution satisfaisante. Pour toutes les fractions
étudiées, la majorité des produits éluent en deux massifs distincts : le premier, très
intense, se situe à une température comprise entre 180°C et 290°C suivi du
deuxième, apparaissant en fin d'analyse en palier de température.

Pour les extraits de châtaignier, chêne et québracho, malgré la quantité

injectée relativement importante et la sensibilité de l'appareil, la réponse du
détecteur à ionisation de flamme (DIF) reste très faible. La raison de ce
phénomène peut être la suivante : seuls les composés dont la température de
vaporisation est inférieure ou égale à la température de l'injecteur, que nous avons
fixée à 260°C pour nos essais, pourront être élués dans la colonne. Ainsi, sera
exclue de nos chromatogrammes une fraction plus ou moins importante de
l'échantillon injecté.
166

Pour le québracho, dont le chromatogramme est donné dans la figure 1,

seul l'acide gallique (noté 1) a pu être identifié par couplage avec la spectrométrie
de masse, les autres composés se trouvant à l'état de traces.

COOH

HO OH

OH

1 = acide gallique
Réponse du détecteur

10 20 30 40
Temps (mn)

Figure 1 - Chromatogramme (DIF) du québracho brut silylé.

En revanche, pour le mimosa brut la sensibilité est bien plus grande (figure
2) et un certain nombre de produits ont été identifiés en spectrométrie de masse.
 167

1 = acide gallique
17 = catéchine
Réponse du détecteur

18 = isomère de la
catéchine
21 = inositol
32 = ?
35 = glucose
40 et 40b = saccharose
42 = gallocatéchine

10 20 30 40 50

Temps (mn)

Figure 2 - Chromatogramme (DIF) du mimosa brut silylé.

Contrairement à tous les autres tannins étudiés, le pic principal n'est pas
l'acide gallique (pic 1) mais le pic 32, composé silylé de masse moléculaire 554
dont la structure n'a pas encore été déterminée avec certitude (figure 3). Il s'agit
vraisemblablement d'un acide glucidique.
168

Figure 3 - Spectre de masse du pic 32 du mimosa en impact électronique à 70 eV.

Nous avons trouvé également du glucose (pics 35), du saccharose (pics 40 et 40b),
de l'inositol (pic 21), de l'acide galacturonique (pic 41). Certains flavanoïdes
éluent en fin d'analyse comme la catéchine (pic 17) et un isomère (pic 18), ou la
gallocatéchine (pic 42).

OH

OH

HO O pic 17 - catéchine

OH

OH

OH

OH

HO O
OH pic 42 - gallocatéchine
OH

OH
 169
Le sumac, tannin hydrolysable, donne également une bonne réponse en
DIF (figure 4) et nous avons mis en évidence l'abondance d'acide quinique (pic
13) et d'acide shikimique (pic 12).

1 = acide gallique
12 = acide shikimique
13 = acide quinique
21 = inositol
29 = acide ellagique
Réponse du détecteur

35 = glucose
40 = saccharose

10 20 30 40 50

Temps (mn)

Figure 4 - Chromatogramme (DIF) du sumac brut silylé

COOH
HO COOH

HO OH HO OH
OH OH

12- acide 13- acide

shikimique quinique
170

Extraction à l'acétate d'éthyle

L'extraction des tannins bruts à l'aide d'un solvant très polaire comme
l'acétate d'éthyle, permet d'isoler les composés phénoliques libres, en particulier
galliques et catéchiques, des produits condensés. Nous avons par conséquent
effectué, à partir d'une solution aqueuse de tannins, une extraction liquide /
liquide à l'acétate d'éthyle, jouant ainsi sur la meilleure solubilité des composés
phénoliques dans ce solvant.

La mise au point de la séparation, réalisée sur l'extrait de québracho brut,

s'est avérée trés délicate. En effet, une simple agitation des deux solvants
(magnétique ou manuelle dans une ampoule à décanter) produit une émulsion qui
rend la séparation des deux phases pratiquement impossible. Nous avons donc
utilisé un perforateur de Jalade pour solvants légers dans lequel le solvant
organique, recyclé en continu par distillation, balaie la solution aqueuse puis, est
récupéré dans le ballon récepteur. De plus, la température élevée qui correspond à
la température d'ébullition du solvant (77°C) accélère la solubilité des produits
phénoliques, diminuant ainsi le temps d'extraction. Après optimisation, les
conditions opératoires établies sont les suivantes : vingt-quatre heures d'extraction
d'une solution aqueuse à 1 g/l de tannin. Les pourcentages en poids des composés
phénoliques extraits de chacun des tannins étudiés sont rassemblés dans le tableau
suivant :

Extrait % en poids des composés

tannant phénoliques
châtaignier 15
chêne 24
québracho 30
mimosa 70
sumac 54

Afin de contrôler la séparation et de connaitre la nature des composés

majeurs des différentes fractions, nous avons étudié par CPG puis CPG/SM les
phases organiques et aqueuses en comparant les résultats avec ceux obtenus pour
les extraits tannants bruts.

Pour les tannins condensés, c'est dans la phase acétate d'éthyle que le plus
grand nombre de composés a pu être détecté et identifié. La réponse du détecteur
(DIF) est beaucoup plus intense, ce qui nous permet de visualiser pour le
 171
québracho (figure 5a), en dehors de l'acide gallique (pic 1) qui reste le pic
majoritaire, des phénols (résorcinol : pic 2, pyrogallol : pic 3), un massif de faible
intensité contenant des sucres, et un autre massif plus intense contenant les
flavones (pics 17, 18,42,...). Les phases acétate d'éthyle du chêne et du châtaignier
fournissent des chromatogrammes similaires, en dehors d'un produit (noté X)
présent uniquement dans l'extrait organique du châtaignier (figure 5b). Comme
pour le tannin brut, l'extrait organique du mimosa (figure 5c) se distingue de celui
des autres tannins par la présence d'une forte quantité du produit 32 et de ces
trois flavones (pic 17, 18 et 42). Le saccharose, relativement abondant dans
l'extrait brut, a totalement disparu du chromatogramme.

Les polysaccharides, dont le glucose et le saccharose, sont regroupés dans

les phases aqueuses où l'on a identifié également l'acide quinique dans le cas du
sumac. Les chromatogrammes obtenus pour les phases aqueuses des tannins
condensés sont peu intenses. Nous l'avions déjà observé lors de l'analyse des
extraits tannants bruts. Ainsi, les produits condensés lourds, qui sont dans les
phases aqueuses, sont bien exclus de nos analyses chromatographiques.

Hydrolyse acide
Les études chromatographiques des tannins hydrolysables s'effectuent
habituellement après hydrolyse acide, à température élevée pendant quatre heures,
et silylation. Nous avons par conséquent étudié l'ensemble des tannins par cette
méthode. L'hydrolysat du sumac, tannin hydrolysable, donne une empreinte
chromatographique semblable à celle du tannin brut en dehors de la disparition de
quelques pics dont la structure reste à definir. Pour les tannins condensés,
l'intensité est plus faible et nous avons observé l'apparition d'acide ellagique,
éluant en fin d'analyse.

O
HO
O

OH
HO

O
OH

acide ellagique
172

1 = acide gallique
2 = résorcinol
3 = pyrogallol
12 = acide shikimique
17 = catéchine
Réponse du détecteur

18 = isomère de la
catéchine
42 = gallocatéchine

10 20 30 40 50

Temps (mn)

1 = acide gallique
35 = glucose
Réponse du détecteur

10 20 30 40 50

Temps (mn)

Figure 5 - Chromatogramme (DIF) de la phase acétate d'éthyle du québracho (a),

du châtaignier (b).
 173

1 = acide gallique
17 = catéchine
18 = isomère de la catéchine
32 = ?
35 = glucose
42 = gallocatéchine
Réponse du détecteur

10 20 30 40 50

Temps (mn)

Figure 5bis - Chromatogramme (DIF) de la phase acétate du mimosa.

Analyse de tannins extraits de cuirs.

Nous avons appliqué nos résultats à l'étude des tannins libres extraits de cuirs.
Après la mise au point d'une méthode d'extraction, nous avons analysé les
fractions obtenues par CPG après silylation et dans les mêmes conditions
opératoires que précédemment.

Plusieurs cuirs, fabriqués au C.T.C. de Lyon ont été étudiés :

- Cuir 3 tanné au québracho ;
- Cuir A tanné au québracho, nourri à l'Ewol B ;
- Cuir 7T tanné au châtaignier, nourri à l'huile de pied de boeuf ;
- Cuir 3A tanné avec un mélange châtaignier / sumac, nourri à l'huile de
pied de boeuf ;
- Cuir 6 tanné avec un mélange châtaignier / sumac, retanné aux sels
d'aluminium et nourri à l'Ewol B ;
- Cuir QCM tanné avec un mélange québracho (48%), châtaignier (28%) et
mimosa (24%).
174
Le cuir 7T, vieilli dans une enceinte climatique maintenue à 70°C et 90%
d'humidité relative pendant trois semaines, a également été étudié.Il sera appelé :
cuir 7V.
Pour faciliter la pénétration des solvants, les cuirs sont finement broyés
avant extraction. Afin d'éviter l'interférence sur nos chromatogrammes des
produits de nourriture des cuirs, ceux-ci sont dégraissés avec du chloroforme dans
un extracteur de type Soxhlet. L'extraction est suivie par analyse en spectroscopie
infrarouge à transformée de Fourier (IR/TF) de la solution chloroformique
obtenue. Dans la majorité des cas, quarante-huit heures sont nécessaires afin
d'extraire la quasi-totalité des matières grasses.
Certains composés phénoliques simples, comme l'acide gallique, le
catéchol et autres flavanoïdes de bas poids moléculaire, ne peuvent se complexer
avec le collagène, en raison de leur faible encombrement stérique. D'après Metche
et Girardin (33), ils peuvent facilement être extraits des cuirs par action d'un
solvant organique, comme le méthanol ou un mélange diméthylformamide /
tampon acétate (pH4). Ce dernier étant d'utilisation délicate, nous avons
sélectionné le méthanol qui de plus, peut être utilisé dans un extracteur de type
Soxhlet. Il serait cependant intéressant de connaître l'action de l'acétate d'éthyle,
solvant utilisé pour séparer les composés phénoliques des tannins bruts.
Les solutions méthanoliques obtenues après vingt-quatre heures
d'extraction, sont fortement colorées. Après évaporation et séchage, les extraits
sont silylés avant analyse chromatographique. Les pourcentages en poids de
chaque fraction, obtenue à partir d'un prélèvement de 1 à 1,5 g de cuir, sont
rassemblés dans le tableau suivant :

Cuir Tannage Nourriture % CHCl3 % MeOH

3 québracho / 1,5 % 22,5 %
A québracho Ewol B* 23 % 11%
7T châtaignier HPB** 5,5 % 11,2 %
7V châtaignier HPB 5,2 % 7%
3A châtaignier+ HPB 12,5% 12 %
sumac
6 châtaignier + Ewol B 10 % 1,5 %
sumac et Al
QCM châtaignier + HMS*** 4% 12 %
sumac
+québracho
__________________________________________________________________
* Ewol B : mélange non oxydable de corps gras, de dérivés de corps gras oxydés et condenses
** HPB : huile de pied de boeuf ; *** HMS : huile marine sulfonée.

Nous avons diminué la prise d'essai (25 mg) afin de minimiser la taille du
prélèvement quand il s'agit de cuirs provenant d'objets anciens ou de valeur.
 175
Le cuir tanné au québracho et nourri à l'Ewol B (cuir A) semble fixer
davantage de tannins que le cuir 3. En effet, 22,5% de tannins libres sont extraits
de ce dernier contre 11% pour le cuir A. On retrouve dans la fraction méthanol du
cuir 3, la majorité des constituants de la phase acétate d'éthyle du québracho brut,
avec cependant quelques modifications d'intensité de certains flavanoïdes (figure
6). Quelques produits supplémentaires (pics grisés) ont été extraits du cuir. Par
contre, le cuir A a fixé beaucoup plus d'acide gallique, qui n'est plus alors le pic
majoritaire du chromatogramme des tannins libres.

1 = acide gallique
Réponse du détecteur

Temps

Figure 6 - Comparaison du chromatogramme des tannins libres du cuir 3 (a) et

de celui de la phase acétate d'éthyle du québracho (b).
176
Pour les cuirs tannés avec du châtaignier, le vieillissement artificiel a pour
conséquence principale une diminution du taux de tannins libres (7% pour le cuir
7V, cuir vieilli, et 11,2% pour le cuir 7T, cuir témoin).
Le tannage s'effectue par associations des groupements phénoliques avec
certains sites spécifiques des régions amorphes de la structure fibrillaire du
collagène. D'aprés des études réalisées au laboratoire, le type de vieillissement
utilisé pour nos essais (chaleur humide) provoque une diminution des réticulations
intermoléculaires du collagène. On peut supposer qu'une certaine quantité de
molécules libres du tannin, comme l'acide gallique, va se fixer dans les nouvelles
régions amorphes, sans pour autant réticuler les molécules de collagène. Nous
observons, comme dans le cas précédent une certaine similitude entre les tannins
libres extraits des deux cuirs et l'extrait acétate d'éthyle du châtaignier.
Le cuir 6, tanné avec le mélange châtaignier / sumac et retanné aux sels
d'aluminium, a un taux de tannins libres très faible (1,5%) par rapport au cuir 3A,
non retanné (12%). Deux facteurs entrent en jeu : la nourriture des cuirs (Ewol B
au lieu de l'huile de pied de boeuf) et le retannage (aluminium pour le cuir 6).
Dans le cuir 3A, nous avons pu attribuer la majorité des constituants de
l'un et de l'autre des deux tannins (figure 7) par comparaison avec leur phase
acétate d'éthyle.
Etant donné la complexité du mélange de tannins du cuir QCM
(québracho / châtaignier / mimosa ) l'identification de chacun des tannins reste
délicate.
°
° °
Les analyses chromatographiques présentées ci-dessus nous ont donné des
indications précieuses quant à la nature des cinq tannins végétaux étudiés. Une
extraction à l'acétate d'éthyle permet de définir les produits phénoliques libres de
ces derniers et donne une empreinte chromatographique caractéristique pour
chacun d'eux. Cependant, si l'identification d'une partie des constituants présents
a été réalisée par spectrométrie de masse, elle est encore incomplète à l'heure
actuelle et sera approfondie ultérieurement.
L'extraction au méthanol des tannins libres des cuirs donne des résultats
prometteurs quant à la caractérisation du tannage. Cependant, un essai avec
l'acétate d'éthyle devrait être envisagé, afin de voir si ce solvant, utilisé pour
l'analyse des tannins bruts, permettrait une meilleure séparation.
D'autres extraits tannants seront étudiés, en particulier des tannins
hydrolysables utilisés pour le tannage des cuirs, comme le tara, le
myrobolan,...etc.
Enfin, l'analyse des tannins libres de cuirs vieillis artificiellement ou en
milieu naturel sera entreprise afin d'être en mesure de connaître l'évolution de tels
matériaux dans le temps et de pouvoir ainsi les retrouver dans des objets anciens.
 177

s = sumac
c = châtaignier
x = indéterminé
Réponse du détecteur

10 20 30 40 50

Temps (mn)

Figure 7 - Chromatogramme (DIF) des tannins libres du cuir 3A.

178
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 181

Annexe 1

MODE OPERATOIRE

Hydrolyse acide

Elle est effectuée sur 10 mg d'extrait brut bien sec, par 1 ml d'acide
chlorhydrique à 5% (v:v) (pour analyses, Prolabo) dans un tube scellé pendant
quatre heures à 105°C. Après refroidissement de la solution, l'acide est évaporé à
sec et l'hydrolysat est silylé avant l'analyse chromatographique.

Silylation

Elle est réalisée dans un tube scellé sur 10 mg d'échantillon auxquels on

ajoute successivement 100 µl d'acétonitrile (pour chromatographie, Merck), 200
µl de B.S.T.F.A. (pour chromatographie, Merck) et 100 µl de TEA (pour
chromatographie, Merck). Aprés étuvage pendant deux heures à 105°C, la
solution est refroidie et directement injectée dans le chromatographe.

Chromatographie en phase gazeuse et couplage avec la spectrométrie de

masse

Les chromatogrammes ont été enregistrés sur un appareil Girdel série 30,
muni d'un détecteur à ionisation de flamme. La colonne capillaire est une colonne
de silice fondue WCOT CPSIL 5 (Chrompack) de 25 mètres de long et de 0,25
mm de diamètre intérieur. Les températures de l'injecteur et du détecteur sont
maintenues à 260°C et 310°C respectivement, celle du four est programmée de
120°C à 290°C à raison de 5°C par minute. La pression du gaz vecteur (Hélium
U, Air Liquide) est de 0,5 bar.

Le couplage CPG/SM a été réalisé sur un appareil quadripolaire Nermag

R10-10C, en impact électronique à 70 eV et en ionisation chimique à l'ammoniac
(N45, Air Liquide) sous une pression de 0,1 torr à 100 eV.
182
Annexe 2

FORMULE ET NUMEROTATION
DES CONSTITUANTS IDENTIFIES EN SPECTROMETRIE DE MASSE

COOH HO

produit 1 : HO OH
produit 21 :
acide
inositol
gallique HO OH HO OH

OH OH

O
HO
O
HO OH produit 29 :
produit 2 : OH
acide HO
résorcinol
ellagique O
OH
O

OH

produit 3 : HO OH produit 32 :
?
pyrogallol acide

COOH CH2OH
produit 12
O
: produit 35 : OH
acide HO OH
glucose OH OH
shikimique OH OH

HO COOH CH2OH
produit 13 CH2OHO
produit 40 et O
: OH OH
40b :
acide CH2OH
HO OH saccharose OH O
quinique OH OH OH

OH

OH COOH
produit 41 :
produit 17 OH O
HO O acide OH
:
galacturoniqu
catéchine OH
OH e OH
OH

OH
produit 18 OH
:
produit 42 : HO O
isomère de ? OH
gallocatéchine
la
OH
catéchine
OH