Plan de Travail

Introduction
Détection et identification des micro-organismes en microscopie
Étude de la biodiversité microbienne
Inventaire des micro-organismes présents dans les boues
Quantification des micro-organismes
Conclusion
Références
INTRODUCTION
La biologie moléculaire est devenue incontournable dans l’étude des
processus biologiques impliqués dans le traitement des eaux résiduaires.
Cet article présente les outils couramment utilisés aujourd’hui pour
caractériser les populations microbiennes des boues activées, apportant
des informations essentielles à la compréhension et à l'optimisation du
fonctionnement des stations d’épuration.
Longtemps, l’étude des stations d’épuration s’est limitée au suivi des
données physico-chimiques en entrée et en sortie de l’installation,
considérant le bassin biologique comme « une boîte noire » où avaient
lieu des réactions chimiques mal comprises, réalisées par des micro-
organismes non identifiés. La microbiologie des boues activées a permis
de lever de nombreuses zones d’ombre sur la nature des réactions
existant dans le bassin biologique et le rôle des micro-organismes
présents. Avec l’arrivée de la biologie moléculaire, de nouvelles
informations capitales ont été apportées, notamment sur la relation
identité/fonction des micro-organismes, améliorant encore notre
connaissance des mécanismes de dépollution mis en jeu au sein des
stations d’épuration.
Pour caractériser l’aptitude des boues activées à traiter un type de
polluant, le microbiologiste doit répondre à plusieurs questions dont les
principales sont : qui, combien, comment ? Les méthodes de
microbiologie traditionnelles, dites pasteuriennes, ne répondent que très
imparfaitement à ces questions. L’identification et le dénombrement des
micro-organismes se font par microscopie sur des critères
morphologiques ou de coloration, ou encore par tests biochimiques
après isolement et culture sur boîtes de Petri ou en milieux liquides. Or,
la très grande majorité des micro-organismes est incultivable sur ces
milieux car les facteurs nécessaires à leur croissance restent inconnus.
De plus, ces méthodes requièrent l’isolement du micro-organisme de son
milieu naturel et de sa communauté, ce qui biaise forcément l’évaluation
de ses activités.
Les méthodes moléculaires, en s’affranchissant de la mise en culture,
réduisent énormément les biais des méthodes pasteuriennes. Elles
permettent de caractériser les micro-organismes d’un échantillon, qu’ils
soient cultivables ou non, dans leur environnement naturel (Huybens et
al., 2009). Ces techniques utilisent des séquences (1) d’ADN (2) 
spécifiques des micro-organismes cibles afin de les identifier et de les
dénombrer. Selon que la séquence ciblée est choisie dans une région
très conservée (3) des gènes marqueurs, ou au contraire dans une
région très variable, il sera mis en évidence des groupes microbiens très
divers, ou bien des micro-organismes très ciblés (espèce ou sous-
espèce bactérienne). D’un point de vue pratique, seule une centaine de
millilitres de boue activée est nécessaire à la réalisation de dizaines,
voire de centaines d’analyses moléculaires. Ces techniques sont donc
particulièrement puissantes dès lors que la représentativité de
l’échantillonnage est bien assurée.
Cet article présente les outils couramment utilisés aujourd’hui pour
caractériser les populations microbiennes des boues activées
(identification, biodiversité, quantification) en détaillant leurs principes et
en donnant quelques exemples d’application en épuration des eaux
résiduaires.

Détection et identification des micro-organismes en microscopie

En microscopie classique, il est possible d’étudier la structure des flocs
(4) (taille, morphologie), mais il est très difficile d’identifier les différents
micro-organismes présents. Des colorations (Gram, Neisser) permettent
d’identifier quelques grands groupes de bactéries, mais déstructurent
complètement l’organisation du floc.
La technique FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), qui combine
biologie moléculaire et microscopie, présente l’avantage considérable de
pouvoir à la fois identifier de manière fiable les micro-organismes
présents et visualiser leur morphologie ainsi que leur répartition spatiale
au sein des flocs. La puissance de cette technique réside dans sa
simplicité et sa rapidité de réalisation (quelques heures). Son principe
repose sur l'utilisation de sondes (5) fluorescentes complémentaires de
séquences spécifiques de l'ARN des ribosomes (6) (ARNr (7)) des
cellules ciblées. Après traitement chimique de la membrane des cellules,
les sondes vont pouvoir y entrer et se fixer sur leurs cibles. La
fluorescence émise est alors observable avec un microscope dit « à
épifluorescence » (figure 1). Il est possible d’utiliser plusieurs sondes
simultanément sur un même échantillon, marquées avec des
fluorophores différents (multiplexage). Pour identifier un micro-
organisme, il est toutefois nécessaire qu’une sonde spécifique existe, ce
qui n’est pas toujours le cas, même si plus de 2500 sondes ont été
développées à ce jour (http://www.microbial-ecology.net/probebase/).
Grâce à cette technique, il a été mis en évidence que les AOB
(Ammonia Oxidizing Bacteria) et les NOB (Nitrite Oxidizing Bacteria),
bactéries réalisant respectivement la première et la deuxième étape de
la nitrification, étaient spatialement proches dans le floc, rendant les
produits de la première réaction rapidement utilisables comme substrats
pour la seconde (Mobarry et al., 1996).
En routine, le FISH se révèle très utile pour identifier rapidement et
simplement les bactéries filamenteuses, qui peuvent être responsables
de dysfonctionnements biologiques en stations d’épuration
(foisonnement des boues et/ou moussage). En effet, les techniques
classiques de coloration ne permettent pas toujours de le faire avec
certitude (variabilité des colorations, expérience de l’observateur). Il est
alors possible de mettre en place sur site des solutions préventives ou
curatives adaptées à la bactérie incriminée.
 Étude de la biodiversité microbienne
La technique FISH ne permettant de visualiser simultanément qu’un
nombre limité d’espèces différentes sur un même échantillon, les études
de diversité microbienne font généralement appel à d’autres techniques
appelées « techniques de typage moléculaire ». Dans cette approche,
les cellules sont lysées, leur ADN est purifié et les gènes d’intérêt sont
amplifiés par PCR . Le plus souvent, les gènes ciblés codent pour des
ARNr microbiens et permettent une identification phylogénétique (8) des
espèces. Il peut aussi s’agir de gènes dits « de fonction », codant pour
des enzymes importantes pour les réactions biochimiques de dépollution
comme celles intervenant dans la nitrification ou la dénitrification. Les
produits de PCR obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse (9)
dans une matrice de polymères.
Une de ces techniques, la DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), est un procédé d’électrophorèse sur gradient de
dénaturants chimiques qui permet d’observer les différences de mobilité
de fragments d’ADN de même taille, mais de séquence différente. Sous
l’effet d’un champ électrique, les produits de PCR migrent dans le gel et
rencontrent des concentrations en dénaturants de plus en plus
importantes, entraînant la dénaturation progressive de leurs brins
d’ADN selon leur composition en bases GC et AT . L’abondance des
bandes sur le profil électrophorétique obtenu reflète la biodiversité de la
communauté pour les micro-organismes considérés, chaque bande
correspondant au moins à une espèce cible (figure 2). En découpant les
bandes sur le gel et en réamplifiant par PCR l’ADN qu’elles contiennent,
il est également possible de connaître l’identité du micro-organisme
correspondant après séquençage. (cf tableau 1 et partie « séquençage
»). La DGGE reste lourde à mettre en œuvre car elle nécessite au moins
deux jours de manipulations, depuis l’extraction d’ADN jusqu’à la
révélation des fragments d’ADN du gel sous illumination UV. De plus,
l’identification des espèces est longue car elle fait appel aux techniques
de séquençage décrites ci-dessous. En revanche, elle présente
l’avantage de pouvoir visualiser jusqu’à une trentaine d’espèces en une
seule fois et peut être mise en œuvre sur plusieurs dizaines
d’échantillons en parallèle.
La biodiversité des bactéries nitrifiantes, qui assurent la transformation
de l’ammoniaque en nitrates au sein du bassin biologique, est très
étudiée. Cette technique a permis de montrer que des espèces
nitrifiantes différentes se développaient dans les stations d'épuration des
eaux usées urbaines et industrielles, en fonction principalement de la
concentration en ammonium de l'influent (Kreuzinger et al., 2003).
En routine, la DGGE peut être utilisée, par exemple, pour évaluer
l’impact de conditions de fonctionnement particulières d’une station
d’épuration sur une communauté microbienne donnée. Les bactéries
nitrosantes (AOB) étant très sensibles aux conditions environnementales
(température, variation de charge, toxique), la nitrification peut être
facilement impactée et les niveaux de rejet en sortie de station non
respectés.

Inventaire des micro-organismes présents dans les boues

Le séquençage permet, à partir d’une séquence cible d’ADN, de
retrouver l’identité du micro-organisme correspondant après
comparaison avec une base de données. Il est utilisé pour réaliser
l’inventaire des espèces ou des fonctions potentielles d’un écosystème
comme les boues activées par exemple.
Le séquençage selon la méthode originale de Sanger a été mis au point
dans les années 1970. Ce fut une révolution dans le domaine de
l’identification des micro-organismes. Cependant, la limitation de cette
technique tenait principalement à sa faible capacité de lecture et à sa
lenteur : il aurait fallu en effet plusieurs dizaines d’années à un
séquenceur fonctionnant jour et nuit pour décrypter les millions de bases
d’un génome bactérien. Aussi, le nombre de séquences analysables
n’était que de quelques centaines et les inventaires réalisés sur des
boues activées ne permettaient d’observer que les espèces présentes à
plus de 108 cellules par millilitre, c'est-à-dire représentant
quantitativement moins de 1% de la communauté. Avec cette approche,
les bactéries nitrifiantes, présentes souvent à des concentrations de
106 à 108 cellules par millilitre de boues activées, n’étaient pas détectées.
Depuis 2005, avec le séquençage haut-débit dit « de nouvelle
génération »,  la même opération est dorénavant réalisée en quelques
heures seulement et le nombre de séquences obtenues s’élève à
plusieurs millions. Toutefois, le traitement du grand nombre de données
générées est lourd, il nécessite des connaissances approfondies en
bioinformatique et plusieurs jours d’analyse.
Cette technique a permis de grandes avancées dans la connaissance
phylogénétique des bactéries filamenteuses. On s’est en effet rendu
compte que des bactéries très proches morphologiquement étaient en
fait très éloignées phylogénétiquement et avaient des fonctions et
activités différentes (Wagner et Cloete, 2002).
L’apport de cette technique est capital : il est désormais possible
d’inventorier les différents micro-organismes présents dans un
échantillon de boues activées sur une seule plaque de séquençage (de
moins d’1 cm2), ou d’avoir accès à leur activité métabolique à un instant
donné.

Quantification des micro-organismes

Pour améliorer la compréhension des procédés, les données obtenues à
l’aide des outils moléculaires doivent être quantitatives. L’outil le plus
utilisé aujourd’hui est la PCR en temps réel (qPCR), technique précise,
rapide, et facilement automatisable. Le principe est le même que celui
d’une PCR classique,  à la différence que l’amplification du fragment
d’ADN est mesurée en continu à l’aide d’agents intercalants (11) de
l’ADN double brin ou de sondes fluorescentes. Cette méthode nécessite
la réalisation d’une gamme étalon à l’aide de solutions d’ADN cible de
concentrations connues. Le nombre de copies d’ADN cible étant doublé
à chaque cycle, la fluorescence augmente de la même façon. Le logiciel
détermine alors pour chaque échantillon un « seuil de quantification »
(Cq), correspondant au nombre de cycles pour lequel la fluorescence
devient significativement différente du bruit de fond. Comparée à celles
de la gamme étalon, la valeur de Cq permet d’estimer la quantité d’ADN
cible de l’échantillon correspondant (figure 4). Le nombre de micro-
organismes d’intérêt peut ensuite être déduit en connaissant le nombre
moyen de copies du gène ciblé par cellule (www.mmg.msu.edu).
Cette technique a permis de quantifier dans les boues activées des
micro-organismes appelés AOA (Ammonium Oxidizing Archaea),
archées capables de réaliser la première étape de la nitrification (Park et
al., 2006). Développée à l’origine pour quantifier les séquences d’ADN et
dénombrer ainsi les micro-organismes, cette technique est actuellement
adaptée à la quantification des ARN afin de quantifier l’expression de
gènes d’intérêt et approcher l’activité des micro-organismes.
En routine, la qPCR peut être utilisée, par exemple, pour suivre l’impact
d’un traitement curatif (chloration, sels métalliques) sur la quantité de
bactéries filamenteuses présentes dans les boues activées, et de
pouvoir ainsi conclure sur son efficacité ou bien adapter le dosage sur
site.
 
Conclusion
La liste de méthodes présentée ici est loin d’être exhaustive. De
nombreuses autres techniques moléculaires sont utiles à l’analyse
microbiologique des boues activées. Les progrès sont très rapides et ces
techniques en constante évolution, devenant au fil des années plus
rapides, plus efficaces et moins coûteuses. De plus, la plupart des
techniques utilisées aujourd’hui peuvent être automatisées pour traiter
rapidement un grand nombre d’échantillons. Cependant, la microbiologie
des boues activées reste un domaine où de grandes inconnues
subsistent, à cause de la complexité de ce milieu, tant au niveau des
processus biologiques que des micro-organismes impliqués. Aujourd’hui,
le couplage systématique des méthodes de microbiologie moléculaire à
celles du génie des procédés permet toutefois de mieux comprendre et
optimiser les procédés de traitement des eaux résiduaires.
Références :
JUZAN, Lauriane ; PERNELLE, Jean-Jacques ; DABERT, Patrick, Les outils de la
biologie moléculaire pour l’analyse microbiologique des boues activées , Revue
Science Eaux & Territoires, Recherche et Ingénierie au service des acteurs de
l’assainissement, numéro 09, 2012, p. 76-81, 19/12/2012
http://www.set-revue.fr/les-outils-de-la-biologie-moleculaire-pour-lanalyse-
microbiologique-des-boues-activees